Biópsia e vitrificação humana do Blastocyst

Tanto a biópsia do blastocisto quanto a vitrificação têm sido uma revolução na fertilização in vitro, permitindo que embriologistas de todo o mundo realizem testes genéticos de pré-implantação em embriões humanos com risco mínimo para o embrião. A biópsia de tropetoderme permitiu a recuperação de cerca de sete células de um embrião totalmente crescido, permitindo assim uma análise genética robusta a jusante. Além disso, nenhum impacto foi demonstrado, até o momento, para essa abordagem.

A eficiência clínica deste fluxo de trabalho permite que pacientes com condições monogênicas e todos aqueles pacientes com risco aumentado de anormalidades cromossômicas dentro de seu blastocisto se beneficiem de testes genéticos pré-implantação. Ainda há espaço para melhorar as estratégias atuais de seleção de embriões. Por exemplo, o perfil miRNomic e proteômico representam opções intrigantes para complementar os testes genéticos de pré-implantação em uma única biópsia de tropectoderme.

Operadores não experientes muitas vezes lutam para abrir e penetrar na zona pellucida. É só uma questão de foco. O blastocisto, objetivo laser e pipetas devem estar no mesmo plano focal.

Depois de rotular o prato de biópsia com os detalhes do paciente, com um marcador permanente, não tóxico, numerar cada gota de 10 microliter de meio tamponado hepes com o embrião e iD de ciclo.Usando uma pipeta de descascamento de 300 micrômetros, transfira um blastocisto viável e totalmente expandido para a primeira gota da placa de biópsia e enxágue a gota para remover o meio de cultura em excesso, antes de mover o blastocisto para a segunda gota no prato. Coloque o prato sob um microscópio invertido, e prime a pipeta biópsia com médio a partir da terceira gota do prato de biópsia. Sob uma ampliação de 20 vezes, oriente o blastocisto para obter uma visão clara da massa celular interna às sete horas, e fixar o embrião na pipeta de retenção.

Concentre-se na zona pellucida para que tanto as pipetas quanto o blastocisto estejam no mesmo plano focal. Mude para o objetivo do laser e posicione o ponteiro laser na zona pellucida no lado oposto da massa celular interna. Perfurar a zona pellucida com dois a três pulsos de laser, e pressione suavemente a pipeta da biópsia contra a zona pellucida para permitir que o meio seja soprado através da fenda para separar as células de trophectoderm da superfície interna.

Quando o trophectoderm for destacado, entre pelo orifício e aspire de sete a oito células de trophectoderm na pipeta da biópsia com sucção suave. Ao aplicar uma sucção moderada para esticar as células-alvo, mova ligeiramente a pipeta da biópsia para trás e direcione o laser para a parte mais fina das células aspiradas. Dispare de dois a cinco pulsos de laser nas junções entre as células para separar as células-alvo do corpo do embrião.

Quando o fragmento de trophectoderm tiver sido separado do blastocisto, solte o fragmento na mesma gota de biópsia longe do blastocisto para evitar que o fragmento seja sugado de volta para a pipeta da biópsia. Solte o blastocisto da pipeta de retenção e levante prontamente ambas as pipetas para evitar que o fragmento grude em pipetas. Em seguida, imagem o fragmento biopsiado para fins de controle de qualidade.

Quando todos os blastocistos tiverem sido biópsiados como apenas demonstrado, mova o prato de biópsia de volta para a capa de fluxo laminar e rotule o prato de cultura pós-biópsia com o ID do casal e cada gota com o embrião e os IDs de ciclo. Na presença de uma testemunha, enxágue o blastocisto em meio de FERTILIZAÇÃO INVIP limpa e mova o blastocisto para sua queda correspondente no prato pós-biópsia. Em seguida, coloque o prato pós-biópsia em uma incubadora de 37 graus Celsius, 6% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio.

Na presença da testemunha e dentro de uma coifa de fluxo laminar à temperatura ambiente, rotule os tubos PCR com um marcador permanente e não tóxico. Rotule a tampa de um prato de cultura de tubulação de 60 x 15 milímetros com os IDs de embriões biópsias, e adicione duas gotas de 10 microliter de solução de lavagem de biópsia ao prato. Prime uma pipeta de 140 micrômetros com solução de lavagem de biópsia a partir da segunda gota do prato de tubulação sob o microscópio estéreo para visualizar os fragmentos de trophectoderm.

Solte delicadamente alguma solução de lavagem de biópsia sobre o fragmento do trofederm e carregue o fragmento na pipeta de descascamento. Mova o fragmento para a segunda gota da solução de lavagem da biópsia, e enxágue cuidadosamente o tecido duas a três vezes. Transfira o fragmento de trophectoderm para a parte inferior do tubo PCR apropriadamente rotulado com solução de carregamento, tomando cuidado para evitar tocar nas paredes do tubo com a ponta da pipeta de descascamento.

Quando todos os fragmentos tiverem sido adicionados aos seus tubos, gire todos os tubos em uma mini centrífuga por alguns segundos para sedimentar os fragmentos. Em seguida, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius até que sejam enviadas para o laboratório genético de referência para testes. Dentro de 30 minutos de biópsia de trophectoderm, rotule uma placa de vitrificação com os detalhes do paciente e as identidades dos blastocistos que devem ser vitrificadas.

Utilizando criolatos especiais resistentes à temperatura fria, rotule os suportes de vitrificação com o nome e sobrenome do paciente, identificação do casal, identificação do embrião que será carregado nele e a data do procedimento. À temperatura ambiente, dispense 300 microliters de solução de equilíbrio para cada blastocisto que será vitrificado e, na presença de uma testemunha, use uma pipeta de descascamento de 300 micrômetros para mover o blastocisto em um volume de solução de equilíbrio. Deixe o blastocisto na solução de equilíbrio por 13 a 15 minutos.

Após uma redução inicial do volume, será observada uma reestração gradual. No final do equilíbrio, adicione 300 microliters de solução de vitrificação ao segundo poço da placa de vitrificação e transfira o blastocisto completamente re-expandido para a solução de vitrificação por um minuto. No final da incubação, enxágue o blastocisto para diluir a solução de equilíbrio e, na presença de uma testemunha, carregar o blastocisto no suporte de vitrificação.

Remova o excesso de solução de vitrificação. Um filme sutil de solução deve cercar o blastocisto. Mergulhe o suporte de vitrificação em nitrogênio líquido, e mova vigorosamente o suporte para reduzir o risco de formação de bolhas perto da amostra.

Em seguida, coloque a tampa protetora no suporte enquanto o suporte de vitrificação ainda está submerso em nitrogênio líquido. Dos 1.544 procedimentos de biópsia de trophectoderm realizados durante este período representativo de dois anos, entre um a quatro blastocistos foram biópsias por procedimento entre três a 22 minutos por procedimento. Nestes gráficos, é mostrado o tempo médio da biópsia para cada operador ao longo dos trimestres de estudo, com um valor médio global de 8,24 minutos.

É útil adquirir uma imagem de cada fragmento biópsia para fins de controle de qualidade para avaliar se a causa de diagnósticos inconclusivos era imputável à dimensão e/ou qualidade do fragmento, à tubulação ou a algumas questões no processamento da amostra no laboratório genético. Neste estudo, 572 blastocistos euploides foram aquecidos para serem submetidos a uma transferência de embriões após o diagnóstico de euploidia. Todos os blastocistos vitrificados em 30 minutos, com 2,4% dos blastocistos não se rees expandindo entre 31 e 90 minutos e 4,9% não se expandindo além de 90 minutos de reaquecimento.

Especialmente para a má qualidade e/ou dia sete blastocistos, o tempo entre biópsia e vitrificação parece crucial para alcançar a reestrução após o aquecimento. Tome cuidado para se concentrar antes de abrir a zona pellucida ao expor a junção entre a célula de trophectoderm e o disparo, e tome cuidado também para evitar a reestrucionação do blastocisto antes da vitrificação. Existem duas outras abordagens de biópsia blastocisto, ambas implicando a abertura da zona pellucida e esperando por um arqueamento espontâneo das células de trophectoderm.

Essas abordagens são mais fáceis, mas exigem mais manipulações e são mais demoradas. A eficácia deste fluxo de trabalho permite a implementação de tecnologias moleculares na FIV, a fim de tentar selecionar o blastocisto com maior chance de implantar antes da transferência do embrião. Lembre-se de não usar nenhum dispositivo ou solução que possa ser tóxico para os embriões e para evitar a contaminação do DNA usando materiais livres de DNA.