Name: Ensaio de repórter luciferase à base de RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda a usar ensaio de luciferase com RNA transcrito in vitro para estudar regulação da tradução em células infectadas por poxvirus. Este método permite analisar elementos cis em mRNA e modos de iniciação.

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O projeto foi financiado pelos institutos nacionais de saúde (AI128406 www.nih.gov) para ZY e em parte pelo centro de pesquisa de câncer de Johnson (http://cancer.k-state.edu), na forma de estudante de pós-graduação Summer stipend para PD.

1. preparação do modelo de DNA por PCR para transcrição in vitro
<ol><li>Para preparar o modelo de DNA por PCR, iniciadores de design. Ao projetar primers considerar características cruciais como primer comprimento, temperatura de recozimento (Tm), GC conteúdo, 3 ' final com G ou C etc. Nota: Discutido em detalhe nesta literatura25,26,27.</li>
	<li>Projete primeiras demão para gerar o amplicon do PCR que contem os seguintes elementos em 5 ' a 3 ' sentido: T7-promoter, líder poli (A), luciferase do Firefly ORF e uma cauda de Poly (A) consultá-se daqui para a T7_12A-Fluc. Iniciadores de design (Forward e Reverse) para abranger todos os elementos adicionais não presentes no modelo DNA (Figura 2a). Nota: A sequência de todos os elementos pode ser encontrada na tabela 1.
</li>
	<li>Inclua diversos nucleotídeos extra na primeira demão para diante (5 '-3 ')28, seguido pelo T7-promotor, pelo líder poli (A) ou pela seqüência desejada de 5 '-UTR e por aproximadamente 20 nucleotídeos, ajuste baseado em Tm, correspondendo ao 5 ' extremidade do gene do repórter Orf. Assegure-se de que a região correspondente no primer seja idêntica à vertente do sentido (+ vertente) do gene. Nota: Para longo 5 '-UTR, sintetizar dois fragmentos de DNA: um com o promotor T7 seguido por Long 5 '-UTR e segundo com ORF do gene do repórter. Junte esses dois fragmentos usando a extensão de sobreposição PCR29.</li>
	<li>O primer reverso do projeto (5 '-3 ') para incluir a cauda poli (A) e aproximadamente 20 nucleotides, ajusta baseado em Tm, correspondendo ao 3 ' extremidade do ORF do gene do repórter. Assegure-se de que a região correspondente na primeira demão seja idêntica à vertente antisense (-vertente) do gene e um Codon do batente do em-frame esteja atual antes da cauda de Poly (A). Nota: O comprimento desejado de A em um poli (A) líder ou Poly (A) cauda pode ser personalizado nos primers. Por exemplo, para adicionar 50 a ' s na cauda poli (a), o primer reverso deve implicar 50 T' s. Da mesma forma, para adicionar 20 A ' s no poli (a) líder, o primer para a frente deve implicar 20 A ' s.</li>
	<li>Para o controle interno, projete um outro conjunto de primers contendo os seguintes elementos em 5 ' a 3 ' direção: T7 promotor, uma sequência de codificação 5 '-UTR aleatória contendo a sequência de Kozak, renilla luciferase ORF e Poly (a) cauda referida doravante como T7_ Kozak-Rluc.</li>
	<li>Em um tubo do PCR, adicione os reagentes na seguinte ordem: água livre de DNase, polymerase do ADN da elevado-fidelidade 2x, primeiras demão, e ADN confirmado seqüência do molde do luciferase (tabela 2). Nota: As quantidades de componentes individuais na mistura devem ser ajustadas de acordo com o volume da reacção.</li>
	<li>Use um ciclo de PCR padrão de 3 etapas (desnaturação, recozimento, extensão) para gerar um modelo de DNA, conforme mostrado na tabela 3. Nota: Temperatura de recozimento X ° c depende do conjunto de primer sendo usado e tempo de extensão T min dependem do tamanho do amplicon PCR e DNA polimerase usado.</li>
	<li>Detecte o produto do PCR executando 5-10% da reação do PCR na electroforese do gel do agarose Tris-Acetato-EDTA (Tae) de 1% (que contem o brometo do etídio 0.1 μg/ml) junto com o padrão de peso molecular disponível comercialmente. Visualize o gel um iluminador UV para determinar o tamanho do produto do PCR.</li>
	<li>Após ter determinado o tamanho correto do produto do PCR, ~ 1,7 KB para T7_12A-Fluc e ~ 1,0 KB para T7_Kozak-rluc, purificar o usando um jogo comercialmente disponível da purificação do PCR. Elute o DNA usando 100 μL de água livre de nuclease (Figura 2b).</li>
	<li>Uma vez purificada, verifique a concentração do DNA usando um espectrofotômetro e determine a relação A260/A280 (~ 1.8-2.0 é aceitável).</li>
	<li>Armazene o ADN purified a-20 ° c ou use-o para a transcrição in vitro imediatamente.</li>
</ol>2. gerar mRNA por transcrição in vitro
<ol><li>
Sintetizar RNA do produto PCR in vitro, utilizando um kit de transcrição in vitro (Figura 3a). Nota: os moldes do ADN de T7_12A-Fluc e de T7_Kozak-rluc são usados para sintetizar 12A-Fluc e Kozak-Rluc mRNAs, respectivamente.<ol>
<li>Para fazer isso, pegue um tubo de microcentrífuga e adicione os reagentes na seguinte ordem: água livre de DNase-RNase, mistura do tampão de NTP, Analog do tampão, produto do PCR do molde, mistura da polimerase T7-RNA (tabela 4). Nota: Outros sistemas tampando podem igualmente ser usados para tampar o RNA sequencialmente após a transcrição in vitro que segue a instrução do fabricante.</li>
		<li>Misture completamente e incubar a 37 ° c durante 2 h.</li>
		<li>Prossiga para a purificação do RNA sintetizado usando um kit de purificação de RNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Executar RNA purificado em 1,5% de agarose Tris-borato-EDTA (TBE) gel (contendo 0,5 μg/ml de brometo de etídio) para verificar o RNA. Visualize o gel um iluminador UV (Figura 3B).</li>
	<li>Verifique a concentração do RNA usando um espectrofotômetro e determine a relação A260/A280 (~ 1.8-2.0 é aceitável).</li>
	<li>Aliquot o RNA purified e armazene em-80 ° c.</li>
</ol>3. transfect mRNA para células
<ol><li>Células HeLa semente em uma placa de 24 poços (para ser aprox. ~ 80-90% confluente no dia seguinte) e incubar durante a noite em uma incubadora em 37 ° c com 5% CO2.</li>
	<li>Infectar células HeLa com vírus vacinia (VACV) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 ou manter células HeLa não infectadas para comparação. Nota: MOI é o número de partículas virais infecciosas por célula.</li>
	<li>MOI de X = {[(número de células * X)/titer de vírus] * 1000} μL de vírus por 1 mL médio.</li>
	<li>
Após a infecção desejada do borne de h (HPI) (neste experimento em 10-12 HPI), difícil transfecção mRNA (500 ng do mRNA total por o poço de 24 placas do poço) usando um reagente catiônicos do transfection do lipido como mostrado na Figura 3C.
	<ol>
<li>Para um poço de uma placa de 24 poços, misture 480 ng da seqüência 12A que carrega o luciferase do Firefly do vagalume (12A-Fluc) mRNA e 20 ng da seqüência de Kozak que carrega o mRNA de Renilla luciferase (Kozak-rluc) em um tubo do microcentrífuga. Em outro tubo de microcentrífuga adicionar 1,1 μL de reagente de transfecção lipídica catiônica.</li>
		<li>Adicionar 55 μL de meio sérico reduzido em ambos os tubos. Misture e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.</li>
		<li>Após 5 min de incubação, adicionar 55 μL de reagente de transfecção lipídica catiônica contendo meio sérico reduzido em tubo contendo mRNA.</li>
		<li>Misture suavemente, mas completamente, e incubar à temperatura ambiente por 15 min.</li>
		<li>Durante a incubação, retire o meio de cultura celular e acrescente 400 μL de meio sérico reduzido por poço de placas de 24 poços.</li>
		<li>Após a incubação, adicione 100 μl da mistura gota e uniformente a um poço de 24 placas do poço.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Meça atividades de luciferase
<ol><li>Cinco horas pós-co-transfection de 12A-Fluc e Kozak-Rluc mRNA, meça a atividade do luciferase usando um sistema do ensaio do luciferase capaz de executar dois ensaios do repórter (por exemplo, jogo duplo do ensaio do repórter do luciferase).</li>
	<li>Remova o meio sérico reduzido e lyse as células adicionando 150 μL de tampão de Lise 1x, um componente do kit de ensaio de luciferase.</li>
	<li>Após 10 min de incubação à temperatura ambiente, colete o lisado raspando as células e transfira para um tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Centrifugue o lisado em 12.000 x g por 10 minutos em 4 ° c aos restos da pilha da pelota.</li>
	<li>Adicionar 30 μL de sobrenadante em placa de ensaio com paredes opacas 96 bem branco com fundo sólido.</li>
	<li>Meça a luminescência dupla usando o kit de ensaio de luciferase e um luminômetro de leitor de placas multimodo.</li>
	<li>Realize a medição utilizando a função cinética (numa base por poço) utilizando as definições descritas na tabela 5. Nota: A leitura também pode ser tomada usando o luminômetro manual. Adicionar um volume igual de lisado e substrato para Fluc em uma cubeta. Aguarde 2 s e meça por 10 s usando o luminômetro. Após a medição Fluc, rapidamente tirar a cubeta do luminômetro e adicionar um volume igual do substrato para Rluc manualmente. Novamente, aguarde 2 s e meça por 10 s usando o luminômetro.</li>
	<li>Exporte os dados de leitura de luminescência para um formato de arquivo desejável.</li>
	<li>Determine a taxa relativa da tradução de 12A-Fluc mRNA em pilhas não infectados e vacv Infected Hela dividindo o valor de Fluc pelo controle interno valor de rluc. Nota: A Figura 1 complementar mostra a análise passo a passo dos dados brutos para obter a atividade Fluc relativa.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores gostariam de declarar nenhum interesse financeiro concorrente.

Todas as etapas do quatro-núcleo são críticas ao sucesso do in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Uma atenção especial deve ser dada ao projeto da primeira demão, especial para a seqüência do promotor T7. T7 RNA polymerase começa a transcrição do sublinhado primeiro G (ggg-5 '-UTR-Aug-) em T7 promotor adicionado antes da seqüência de 5 '-UTR. Embora o local do começo da transcrição (TSS) Comece do primeiro G no 5 ' extremidade, diminuindo o número de G ' s menos de três na região do pr...

De acordo com o dogma central, a informação genética flui do DNA para o RNA e, finalmente, para a proteína1,2. Este fluxo de informação genética é altamente regulamentado em vários níveis,incluindo a tradução mRNA3,4. O desenvolvimento de ensaios de repórter para medir a regulação da expressão gênica facilitará a compreensão dos mecanismos regulatórios envolvidos nesse processo. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar a tradução do mRNA usando um in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase em pilhas poxvirus-infected.
Os poxvirus compreendem muitos micróbios patogénicos humanos e animais altamente perigosos5. Como todos os outros vírus, os poxvirus dependem exclusivamente de máquinas de células hospedeiras para síntese protéica6,7,8. Para sintetizar de forma eficiente as proteínas virais, os vírus evoluíram com muitas estratégias para a seqüestro da maquinaria translacional celular para redirecioná-la para a tradução de mRNAs virais7,8. Um mecanismo comumente empregado por vírus é o uso de elementos de ação cisem suas transcrições. Exemplos notáveis incluem o local de entrada Ribossome interna (ires) e o potenciador de tradução independente de Cap (CITE)9,10,11. Esses cis-elementos tornam as transcrições virais uma vantagem translacional atraindo máquinas translacionais através de diversos mecanismos12,13,14. Mais de 100 mRNAs de Poxvirus têm um elemento cis-acting evolutivamente conservado na região 5 '-Untranslated (5 '-UTR): um 5 '-Poly (a) líder no muito 5 ' extremidades destes mRNAs15,16. Os comprimentos destes 5 '-Poly (a) os líderes são heterogêneos e são gerados pelo derrapagem da polimerase poxvirus-codificada do RNA durante a transcrição17,18. Nós, e outro, descobrimos recentemente que o 5 '-Poly (a) o líder confere uma vantagem da tradução a um mRNA nas pilhas contaminadas com o vírus de vaccinia (vacv), o membro prototípicas de Poxvirus19,20.
O ensaio de repórter de luciferase baseado em RNA transcrito in vitro foi inicialmente desenvolvido para compreender o papel do líder 5 '-Poly (a) na tradução de mRNA durante a infecção pelo poxvirus19,20. Embora os ensaios do repórter do luciferase DNA-baseado do plasmídeo sejam amplamente utilizados, há diversos inconvenientes que complicarão a interpretação do resultado em pilhas poxvirus-contaminadas. Em primeiro lugar, os plasmís são capazes de replicar em células infectadas VACV22. Em segundo lugar, a transcrição críptica geralmente ocorre a partir do plasmídeo DNA18,23,24. Em terceiro lugar, a transcrição impulsionada pelo promotor VACV gera poli (A)-líder de comprimentos heterogêneos, consequentemente, dificultando o controle do comprimento do líder Poly (A) em alguns experimentos18. Um ensaio in vitro transcrito do repórter da luciferase baseado em RNA contorna estas edições e a interpretação dos dados é direta.
Há quatro etapas chaves neste método: (1) reacção em cadeia do polymerase (PCR) para gerar o molde do ADN para a transcrição in vitro; (2) transcrição in vitro para gerar mRNA; (3) transfection para entregar o mRNA nas pilhas; e (4) detecção da atividade da luciferase como indicador de tradução (Figura 1). O amplicon resultante do PCR contem os seguintes elementos no sentido 5 ' a 3 ': T7-promotor, líder poli (A) ou 5 '-seqüência desejada de UTR, frame de leitura aberto do luciferase do Firefly (ORF) seguido por uma cauda poli (A). O amplicon do PCR é usado como o molde para sintetizar mRNA pela transcrição in vitro usando o polymerase de T7. Durante a transcrição in vitro, o tampão de m7G ou o outro Analog do tampão são incorporados no mRNA recentemente sintetizado. As transcrições tampadas são transfected em células não infectadas ou VACV-infectadas. O lisado da pilha é coletado no tempo desejado após o transfection para medir atividades do luciferase que indicam a produção da proteína do mRNA transfected. Este ensaio do repórter pode ser usado para estudar a regulação da tradução pelo cis-elemento atual em 5 '-UTR, em 3 '-UTR ou em outras regiões de um mRNA. Além disso, o ensaio in vitro transcrito RNA-baseado pode ser usado para estudar os mecanismos diferentes da iniciação da tradução que incluem a iniciação tampão-dependente, a iniciação tampão-independente, a reiniciação e a iniciação interna como IRES.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492</td><td>Polimerase de DNA de alta fidelidade usada em PCR</td></tr><tr><td>3&agudo;-O-Me-m7G(5')pp(5')G RNA Cap Structure Analógico</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td>Anti reverse Cap analógico ou ARCA</td></tr><tr><td>Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate</td><td>Corning</td><td>3693</td><td>Placa branca de 96 poços com parede opaca com fundo sólido</td></tr><tr><td>Sistema de Ensaio Reporter de Luciferase Dupla</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Kit de Ensaio de Luciferase Dupla (DLAK)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Kit de Ciclo Puro</td><td>OMEGA BIO-TEK</td><td>D6492</td><td>Kit de Purificação de PCR</td></tr><tr><td>GloMax Navigator Microplate Luminometer</td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>Referido como luminômetro leitor de placa multimodo</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td>In Kit de transcrição</td></tr><tr><td>Vitro Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Reagente de transfecção lipídica catiônica</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Usado para medir a concentração de DNA e RNA</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Mídia de soro reduzida</td></tr><tr><td>Purelink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>Kit de purificação de RNA</td></tr><tr><td>Sistema de nivelamento Vaccinia</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080</td><td>Sistema de nivelamento</td></tr></tbody></table>

ensaio de repórter luciferase à base de rna transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Cada mRNA do poxvirus transcrito após a replicação viral do ADN tem um 5 '-Poly (A) evolutivamente conservado, não-modelado do 5 '-UTR. Para dissecar o papel de 5 '-Poly (A) líder na tradução de mRNA durante a infecção do poxvirus nós desenvolvemos in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Este ensaio do repórter compreende de quatro etapas do núcleo: (1) PCR para amplificar o molde do ADN para a transcrição in vitro; (2) transcrição in vitro para gerar mRNA usando T7 RNA polimerase; (3) transfecção para introduzir in vitro o mRNA transcrito nas pilhas; (4) detecção da atividade da luciferase como indicador de tradução. O ensaio do repórter do luciferase RNA-baseado descrito aqui contorna edições da replicação do plasmídeo em pilhas poxvirus-contaminadas e na transcrição enigmático do plasmídeo. Este protocolo pode ser usado para determinar o Regulamento da tradução por cis-elementos em um mRNA que inclui 5 '-UTR e 3 '-UTR nos sistemas diferentes das pilhas poxvirus-contaminadas. Além disso, diferentes modos de iniciação de tradução, como o tampão-dependente, Cap-Independent, re-iniciação, e iniciação interna podem ser investigados usando este método.

As quatro etapas do ensaio in vitro transcrito do repórter da luciferase baseada em RNA: PCR para gerar o molde do ADN para a transcrição in vitro, in vitro a transcrição para gerar o mRNA, o transfection do mRNA, e a medida do luciferase, podem ser considerados no diagrama esquemático ( Figura 1). A concepção de primers para ambos os modelos de DNA (Fluc e rluc) e o esquema geral de extensão de saliência PCR é ilustrado no esquema (Figur...

Nós apresentamos um protocolo para estudar o Regulamento da tradução de mRNA em pilhas poxvirus-contaminadas usando in vitro o ensaio do repórter da luciferase do RNA-baseado transcrito. O ensaio pode ser usado para estudar a regulação da tradução por cis-elementos de um mRNA, incluindo 5 '-região não traduzida (UTR) e 3 '-UTR. Diferentes modos de iniciação de tradução também podem ser examinados usando este método.

Ensaio de repórter luciferase à base de RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Nosso protocolo para um ensaio de luciferase in vitro transcrito baseado em RNA ajuda a estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo vírus da varíola. Além disso, um comprimento personalizado do poly(A)litro permite estudar seus efeitos regulatórios na tradução. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo da regulação da tradução por elementos cis como 5'UTR e 3'UTR em mRNA e amplo espectro de iniciação de tradução.O ensaio de repórter luciferase in vitro transcrito baseado em RNA pode ser adaptado para incorporar modificações na tampa e outras modificações e usado para testar o efeito na tradução. Para começar, projete primers para frente e para trás para gerar amplicon PCR contendo os seguintes elementos em 5'to 3'direction:T7-Promoter, Poly(A)litro, Firefly Luciferase ORF em uma cauda Poly(A)referida como T7_12A-Fluc, incluem vários nucleotídeos extras no primer dianteiro seguidos de T7-Promoter Poly(A)liter ou sequência desejada de 5'UTR e aproximadamente 20 nucleotídeos correspondentes ao final do ORF do gene repórter. Ajuste o comprimento do primer com base na temperatura de fusão correspondente ao orf do gene repórter, garantindo que a região correspondente no primer seja idêntica à cadeia de sentido do gene.Em seguida, projete o primer reverso para incluir a cauda Poly(A) e aproximadamente 20 nucleotídeos. Ajuste com base na temperatura de fusão correspondente ao ORF de 3'end do gene repórter garantindo que a região correspondente do primer seja idêntica à cadeia antissamante do gene e um códon de parada no quadro esteja presente antes da cauda Poly(A)." Para controle interno, projete outro conjunto de primers contendo os seguintes elementos em 5'to 3'direction:T7-Promoter, uma sequência aleatória de codificação utr de 5'UTR contendo sequência Kozak, Renilla Luciferase ORF e cauda Poly(A),referida como T7_Kozak-Rluc.Para configurar a reação, adicione reagentes na seguinte ordem a um tubo PCR:DNase água livre, polimerase de DNA de alta fidelidade 2X, primers e sequência confirmada DNA modelo de luciferase. Após um ciclo PCR padrão de três etapas para gerar um modelo de DNA, detecte o produto PCR executando 5-10% da reação do PCR em uma eletroforese de gel TAE de 1% agarose, juntamente com um padrão de peso molecular. Para determinar o tamanho do produto PCR, visualize o gel sob um iluminador UV.Depois de determinar o tamanho correto do produto PCR, purifique-o usando um kit de purificação PCR comercialmente disponível usando 100 microliters de água livre nuclease para elutar o DNA. Verifique a concentração do DNA purificado usando um espectotômetro e armazene-o a menos 20 graus Celsius para uso para transcrição in vitro imediatamente. Para sintetizar o RNA do produto PCR, adicione os seguintes reagentes a um tubo de microcentrifuuge: água livre DNase-RNase, mistura de tampão NTP, analógico da tampa, modelo de produto PCR e mistura de polimerase T7-RNA do kit de transcrição in vitro.Homogeneizar. Incubar a 37 graus Celsius por duas horas e, em seguida, proceder para a purificação do RNA sintetizado usando um kit de purificação de RNA. Para verificar o RNA purificado, aqueça o RNA a 70 graus durante cinco minutos para remover a estrutura secundária e executá-la em gel TBE de 1,5 agarose.Em seguida, visualize o gel sob um iluminador UV. Verifique a concentração do RNA purificado usando um espectotômetro. Aliquot-lo e armazenar a menos 80 graus Celsius.Sementes HeLa células em uma placa de 24 poços para alcançar 80-90% de confluência no dia seguinte e incubar durante a noite em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Infectar células HeLa com vírus Vaccinia em uma multiplicidade de infecção de cinco e manter células HeLa não infectadas para comparação. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 10 a 12 horas.Após horas desejadas após a infecção, misture 480 nanogramas de sequência 12A com mRNA Firefly Luciferase e 20 nanogramas de sequência kozak com renilla Luciferase mRNA em um tubo de microcentrifuuge. Em outro tubo de microcentrifuge, adicione 1,1 microliters de reagente de transfecção lipídica cationic. Adicione 55 microliters de mídia súmumlica reduzida aos dois tubos, misture e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, adicione 55 microliters reagente de transfecção lipídica cationic contendo mídia de soro reduzido ao tubo contendo mRNA. Misture suavemente, mas bem com uma pipeta e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Durante a incubação, remova o meio de cultura celular das células e adicione 400 microliters de meio soro reduzido por poço.Quando a incubação estiver concluída, adicione 100 microliters da mistura, queda sábia e uniformemente por poço da placa de 24 poços. Cinco horas após a co-transfecção com 12A Fluc e Kozak Rluc mRNA, remova o meio sérico reduzido das células e lise as células adicionando 150 microliters 1X lysis tampão do kit de ensaio luciferase capaz de realizar dois ensaios repórteres. Depois de incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, raspe as células usando borracha e seringa estéril e transfira para um tubo de microcentrifuge.Para detritos de células de pelota, centrifugar o lysate a 12.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira 30 microliters de supernascer por poço de uma placa de ensaio 96 bem branca murada com um fundo sólido. Use o kit de ensaio luciferase e um luminômetro leitor de placas multi-modo para medir a luminescência dupla usando a função cinética como descrito no manuscrito.Depois de exportar os dados de leitura de luminescência em um formato de arquivo desejável, determine a taxa de tradução relativa de 12A Fluc mRNA em células HeLA não infectadas e VACV infectadas dividindo o valor Fluc por controle interno valor Rluc. Este ensaio foi usado para testar a eficiência de tradução de um mRNA Fluc que contém um 5'Poly(A)litro em células infectadas não infectadas e VACV. Ambas as células infectadas não infectadas e vacv foram co-transinfetadas com fluc e rluc mRNA.A divisão do Fluc por Rluc normalizou a eficiência de transfecção na estabilidade do RNA nas células. 5'Poly(A)litro contendo mRNA tem uma vantagem translacional durante a infecção pelo VACV em comparação com células não infectadas. Isso não foi devido à eficiência diferenciada de transfecção ou estabilidade do mRNA, uma vez que o nível de RNA foi semelhante em células infectadas pelo VACV cinco horas após a transfecção do mRNA.Tome cuidado especial ao projetar primers, pois isso pode afetar não apenas a eficiência de reação do PCR, mas também todos os processos a jusante que requerem o DNA amplificado. Este método é um importante ensaio para testar rapidamente o regulamento de tradução por elementos Cis. Se possível, esse método deve ser corroborado por outros experimentos complementares.Deve-se tomar precauções ao usar o vírus vaccinia e evitar a exposição a produtos químicos como brometo de ethidium e fenol.

in-vitro-transcribed-rna-based-luciferase-reporter-assay-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este método descreve a síntese in vitro com alto rendimento de RNA mensageiro (mRNA) tanto com capuz quanto sem capuz, a partir de um plasmídeo linearizado contendo o gene da luciferase de Gaussia (GLuc). O RNA é purificado e uma fração do RNA sem capuz é cappingada enzimaticamente utilizando a enzima de capping do vírus Vaccinia. Na etapa final, o mRNA é transfetado em células HeLa e os sobrenadantes do cultivo celular são analisados quanto à atividade da luciferase.

Transcrição in vitro e nivelamento de Gaussia mRNA luciferase Seguido por HeLa transfecção celular

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Este vídeo demonstra um método para rastrear infecções virais em modelos de camundongos usando um vírus Influenza A bi-repórter recombinante com luciferase e proteína de fluorescência. Este método permite estudos in vivo e ex vivo, permitindo que os pesquisadores obtenham insights sobre a dinâmica viral e os efeitos das intervenções.

Um vírus da gripe repórter fluorescente luciferase para rastrear infecções virais

Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a regulação da tradução em células infectadas por poxvírus. Células não infectadas e infectadas por vírus foram co-transfectadas com mRNAs que codificam para luciferase de vaga-lume (Fluc) e luciferase de Renilla (Rluc), com o mRNA de Fluc contendo uma sequência líder de 5 'Poly (A). Ao adicionar substratos bioluminescentes em células lisadas, medir o sinal de ambas as luciferases para identificar a vantagem translacional do mRNA Fluc em células...

Um ensaio repórter de luciferase para estudar a regulação da tradução em células infectadas por poxvírus

Descreve-se a utilização de um vírus vaccinia repórter fluorescente que permite a medição em tempo real da infectividade viral e a expressão do gene através da expressão específica da fase de fluoróforos espectralmente distintos repórter. Detalhamos um método baseado em placa para identificar com precisão a fase em que a replicação do vírus é afetada em resposta a pequena inibição molécula.

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Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

A transfecção na linhagem celular de macrófagos, RAW264.7, é difícil devido à resposta natural da célula contra materiais estranhos. Descrevemos aqui um procedimento suave, mas robusto, para transfectar genes repórter de luciferase em células RAW264.7.

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Um ensaio de bioluminescência em vitro para determinar celular ritmo circadiano em células epiteliais mamárias é apresentado. Este método utiliza plasmídeos de repórter de pilha mamífera expressando desestabilizado luciferase sob o controle do promotor do gene de período 2 . Ele pode ser adaptado para outros tipos de células para avaliar efeitos de órgãos específicos no ritmo circadiano.

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Para identificar novos reguladores de fatores de transcrição, desenvolvemos uma abordagem para tela de bibliotecas RNAi lentivirais ou retrovirais usando um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase. Esta abordagem oferece uma maneira rápida e relativamente barata de selecionar centenas de candidatos em um único experimento.

Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase

Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.

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Ensaio de repórter luciferase à base de RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaio de repórter luciferase à base de RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus

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