Name: Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda a avaliar a permeabilidade vascular dependente de TMEM em tumores usando imagem intravital e análise de tecido fixo com dextran de alto peso molecular. Estes métodos correlacionam-se com disseminação de células cancerígenas.

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Gostaríamos de agradecer à unidade de imagem analítica (AIF) no Albert Einstein College of Medicine para suporte de imagem. Este trabalho foi apoiado por subsídios do NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 e CA216248), o SIG 1S10OD019961-01, o centro de Biophotonics Gruss-Lipper e seu programa de imagem integrada, e Ruth L. Kirschstein de Montefiore T32 capacitação de cirurgiões para o estudo do microambiente tumoral (CA200561).

A GSK co-escreveu o manuscrito, realizou imagens para a figura 1C e 3B, desenvolveu protocolo de análise de tecido fixo, analisou e interpretou todos os dados; O JMP co-escreveu o manuscrito e realizou a cirurgia e a imagem intravital para a figura 1B, 2C e 3a; LB &AMP; AC realizou a cirurgia e a imagem intravital para a figura 2B; O RJ realizou a cirurgia e a imagem intravital para a figura 2a; JSC co-escreveu o manuscrito e analisou e interpretou todos os dados; Mho co-escreveu o manuscrito e analisou e interpretou todos os dados; e de executou a cirurgia e a imagem latente intravital para a Figura 2D, co-escreveu o manuscrito, desenvolveu a análise fixa do tecido e os protocolos intravital da imagem latente, e analisou e interpretou todos os dados.

Todos os experimentos com animais vivos devem ser conduzidos de acordo com as diretrizes e regulamentos de uso e cuidado com animais. Os procedimentos descritos neste estudo foram realizados de acordo com os regulamentos nacionais de saúde relativos ao cuidado e uso de animais experimentais e com a aprovação do colégio Albert Einstein de medicina cuidados e uso animal Comissão (IACUC).
1. avaliação da "permeabilidade de ruptura" usando imagens de animais vivos
<ol><li>Transplantação de tumores syngeneic do peito em anfitriões do rato com macrófagos fluorescentes
	<ol>
<li>Gerar pedaços de tecido tumoral adequado para transplante.<ol>
<li>Gerar tumores com rótulo fluorescently em modelos de câncer de rato mamário, cruzando o espontâneo, autóctone, geneticamente projetado mouse mamária modelo de câncer MMTV-pymt camundongos com ratos transgênicos expressando repórteres fluorescentes38, 39 [por exemplo, proteína verde fluorescente aumentada (EGFP), proteína fluorescente ciano aumentada (ecfp), ou Dendra2].</li>
			<li>Permita que os ratos de MMTV-pymt com tumores cDNAs etiquetados cresçam a um tamanho de não maior de 2 cm (aproximadamente 10-12 semanas da idade).</li>
			<li>Eutanize o tumor que carrega os ratos de MMTV-pymt colocando os em uma câmara com isoflurano de 5% até 30 segundos depois que todas as respirações param.</li>
			<li>Realize uma luxação cervical.</li>
			<li>Retire o cabelo do abdômen do rato eutanasiado usando um creme depilatório tópico.</li>
			<li>Coloque um prato de Petri com meio de cultura de células DMEM/F12 no gelo.</li>
			<li>Coloc o rato e a placa de Petri no gelo na capa das emanações.</li>
			<li>Sanitize o abdômen do rato com 70% de álcool etílico.</li>
			<li>Usando luvas estéreis e ferramentas cirúrgicas (tesoura esterilizada, fórceps e lâmina) remover os tumores e colocá-los na placa de Petri.</li>
			<li>Corte o tumor em pedaços pequenos (~ 2 mm x 2 mm x 2mm de tamanho), descartando qualquer porção necrótica, enquanto eles estão na placa de Petri.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transplantar as partes do tumor em anfitriões do receptor.<ol>
<li>Criar camundongos com macrófagos com rótulo de fluorescently geneticamente modificados, por exemplo, MacGreen40 ou macblue 41 MICE (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ecfp)</li>
			<li>Permita que os ratos de FVB com macrófagos cDNAs etiquetados cresçam a uma idade de ~ 4-6 semanas).</li>
			<li>Anestesiam os camundongos FVB com macrófagos fluorescentamente rotulados em uma câmara utilizando isoflurano a 5% com oxigênio como gás transportador.</li>
			<li>Reduza a anestesia para ~ 3% isoflurano e aplique pomada oftálmico aos olhos do mouse para evitar a secagem.</li>
			<li>Retire o cabelo de sobre a 4ª glândula mamária do rato.</li>
			<li>Limpe a pele com Betadine. É importante manter condições estéreis durante todo o resto do procedimento. Isso inclui o uso de instrumentos esterilizados e reagentes.</li>
			<li>Faça uma pequena incisão ~ 2-3 mm apenas inferior ao 4º mamilo.</li>
			<li>Dissecar até que a almofada gorda mamária esteja exposta.</li>
			<li>Tome um pedaço de tumor do prato de Petri e casaco em matriz extracelular artificial.</li>
			<li>Transplante de tumores debaixo da almofada gorda mamária 4th .</li>
			<li>Feche a incisão usando adesivo de cianoacrilato.</li>
			<li>Monitore continuamente o animal até que recupere inteiramente da anestesia e possa manter o recumbency esternal. Além disso, não para devolver o animal para a empresa de outros animais até a recuperação completa.</li>
			<li>Para minimizar infeções, adicione 1 mL de 100 mg/mL de antibiótico enrofloxacina à garrafa de água potável do animal (8 fl oz).</li>
			<li>Permitir que os tumores cresçam até palpáveis (~ 5 mm; ~ 4 semanas).</li>
			<li>Dependendo do experimento, alocar os camundongos em grupos de tratamento e realizar os tratamentos correspondentes, se aplicável.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Configuração para imagiologia intravital
	<ol>
<li>Ligue o laser de dois fotônicos do microscópio e os detectores.</li>
		<li>Gire sobre a caixa de aquecimento e pré-aqueça o estágio x-y do microscópio.</li>
		<li>Coloque a inserção de estágio feita medida42 no estágio x-y.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da janela de imagem
	<ol>
<li>Antes da configuração para a imagem latente, autoclave o frame de janela feito-à-medida da imagem latente circular42.</li>
		<li>Use uma pipeta ou uma seringa da insulina para coloc uma camada fina de adesivo do cianoacrilato à moldura de janela e afixe no lugar um vidro de tampa circular de 8 milímetros. Nota: 1) é importante evitar a obtenção de resíduos na abertura clara do vidro da tampa. 2) é importante aderir o vidro da tampa à moldura da janela pelo menos 1 h antes do uso para a imagem latente.</li>
		<li>Limpe cuidadosamente qualquer excesso de cianoacrilato na abertura clara do vidro de cobertura usando um laboratório de limpeza molhada com uma pequena quantidade de acetona.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de cateter de veia cauda para administração de fluidos e corantes fluorescentes durante a imagem
	<ol>
<li>Corte uma parte de 30 cm de tubulação do polietileno para construir um cateter da veia de cauda.</li>
		<li>Retire a parte da agulha de uma agulha de 30 G do cone Luer, dobrando suavemente a agulha para a frente e para trás até que se quebre. Nota: a agulha deve ser mantida perto do cone luer e não da ponta da agulha. Isto pode ser feito com alicates ou fórceps para agarrar a agulha a fim impedir ferimento da vara da agulha.</li>
		<li>Insira a extremidade sem corte da agulha em uma extremidade da tubulação de polietileno.</li>
		<li>Insira a extremidade afiada de outra agulha de 30 G, mantendo a sua conicidade Luer unida, na extremidade oposta do tubo.</li>
		<li>Encha uma seringa de 1 cc com soro fisiológico tamponado com fosfato, prenda-a ao cone Luer do cateter montado e lave o cateter da veia cauda certificando-se de que não há bolhas de ar no sistema.</li>
		<li>Para a rotulagem vascular, encha uma seringa de 1 cc com 100 μL de 10 mg/kg 155 kDa Dextran-tetrametilrodamina (TMR) ou pontos quânticos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do rato para a imagem latente
	<ol><li>Anestesie o mouse em uma gaiola embaixo (~ 1 pé abaixo) uma lâmpada de calor usando 4%-5% isoflurano misturado com 100% de oxigênio definido para um fluxo de 1,5-2 L por min.</li>
		<li>Gire sobre a lâmpada de calor sobre a área de funcionamento cirúrgica. Esta etapa é crítica para manter a temperatura corporal fisiológica do núcleo do rato durante a cirurgia.</li>
		<li>Coloc o rato a lâmpada de calor e abaixe a anestesia a 2%-3% para a duração da cirurgia. Nota: Certifique-se de manter a lâmpada de calor a uma distância segura (~ 1 pé) longe do rato para evitar o superaquecimento.</li>
		<li>Coloc a pomada oftálmica nos olhos do rato para impedir a secagem dos olhos e da cegueira.</li>
		<li>Teste que o mouse é anestesiado realizando teste de pinça de dedo. Se o animal se retira, aumente a dosagem de isoflurano em 1% e reteste em 1-2 min.</li>
		<li>Insira o cateter da veia cauda no ponto mais distal na cauda possível.</li>
		<li>Afixe o cateter da veia de cauda à cauda com uma parte pequena de fita do laboratório que envolva em torno da cauda e varas à agulha para assegurá-la não começ desalojada.</li>
		<li>Injetar 50 μL por h de PBS através do cateter de veia cauda para proporcionar hidratação adequada. É fundamental evitar injetar muito fluido (não mais de 200 μL por h) ou quaisquer bolhas no cateter, pois isso pode ser fatal para o mouse.</li>
		<li>Retire o cabelo no abdômen sobre as 4ª e 5ª glândulas mamárias usando creme depilatório.</li>
		<li>Limpe a pele com Betadine e deixe a pele secar.</li>
		<li>Faça uma incisão longitudinal do midline que começa imediatamente superior aos genitais e carreg a incisão até o nível do aspecto superior da glândula mamária 4th .</li>
		<li>Transportar a incisão transversal ao aspecto superior da 4ª glândula mamária. É fundamental evitar comprometer o suprimento sanguíneo neste momento.</li>
		<li>Dissecar a almofada gorda mamária fora do peritônio que cria uma aleta do tecido usando o fórceps e as tesouras estéreis. Nota: a imagem da aleta da pele é suscetível aos artefatos significativos do movimento e à desidratação do tecido. Estes são evitados, como descrito anteriormente43,44, afixando uma peça rígida de borracha atrás para o lado da pele do retalho (para endureçar o tecido mole e isolá-lo do resto do corpo) e, em seguida, colocando o tumor em uma imagem superficial janela para preservar a hidratação. Isto é crítico para a imagem latente estável porque o tumor e o tecido circunvizinho neste ajuste são muito complacentes.</li>
		<li>Estabilize a aleta da pele afixando (com colagem do cianoacrilato) uma parte pequena de borracha rígida que mede 2 cm x 2 cm ao lado da pele da aleta. O tumor deve estar no centro da área a ser estabilizada pela borracha.</li>
		<li>Mantenha o tecido exposto hidratado com gotas de PBS.</li>
		<li>Aplique uma película pequena do cianoacrilato à borda exterior do frame de janela feito encomenda da imagem latente.</li>
		<li>Aplique uma pequena gota de PBS (~ 10 – 20 μL) ao centro do vidro da tampa.</li>
		<li>Seque o tecido da aba circundante com uma limpeza de laboratório. É crítico certificar-se de que o cianoacrilato no frame de janela não entra o contato com o PBS no vidro, porque este pode fazer com que o cianoacrilato polimerize e ajuste prematuramente.</li>
		<li>Afixe a janela pequena da imagem latente à aleta do tecido com o tumor no centro da abertura desobstruída.</li>
		<li>Retire a caixa de aquecimento do palco.</li>
		<li>Transfira o cateter anestesiado do rato e da veia da cauda à fase do microscópio. Use extrema cautela para garantir que o cateter da veia cauda não caia.</li>
		<li>Coloque o mouse no palco na posição prona.</li>
		<li>Coloc o cone do nariz do isoflurano sobre o focinho para assegurar a manutenção da anestesia.</li>
		<li>Insira a janela no furo na placa de estágio x-y personalizada.</li>
		<li>Coloque a caixa de aquecimento de volta para o palco para manter uma temperatura fisiológica.</li>
		<li>Monitore os sinais vitais do animal anexando uma sonda de oxímetro de pulso via sensor de clipe para a pata traseira.</li>
		<li>Diminua lentamente o isoflurano para 0,5%-1% para manter o fluxo sanguíneo adequado e evite anestesiando o mouse.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagiologia intravital Nota: a imagem latente que nós descrevemos nesta seção foi executada em um microscópio do multifotônica do dois-laser costume-construído que seja descrito previamente5,39,45. Resumidamente, um laser femtossegundo é usado para gerar 90 femtossegundo pulsado luz laser centrada em 880 Nm. A luz da fluorescência é detectada com três dos quatro detectores simultaneamente adquirindo (azul = 447/60, verde = 520/65, e 580/60 vermelho; comprimento de onda/largura de banda centrais) após a separação da luz da excitação por um dichroic (chroma, Z720DCXXR). O suporte do microscópio contem uma lente objetiva de trabalho longa da distância de funcionamento (2 milímetros) de 25x, de 1, 5 NA (abertura numérica). É importante notar que, enquanto nós usamos um microscópio personalizado-construído, o protocolo descrito abaixo pode ser realizado em qualquer microscópio multifóton comercialmente disponível também.<ol>
<li>Coloc uma gota da água destilada entre o 25x, o objetivo do microscópio de 1, 5 NA e o vidro da tampa da janela para fazer o contato ótico.</li>
		<li>Use a ocular do microscópio para centrar-se sobre áreas com as pilhas fluorescentes do tumor perto da superfície da janela.</li>
		<li>Encontrar vasos sanguíneos fluindo e macrófagos rotulados. É crítico ter os vasos sanguíneos de fluxo para avaliar a dinâmica do vasculature.</li>
		<li>Mude o microscópio para o modo multifóton.</li>
		<li>Defina os limites superior e inferior de uma série z, que mede aproximadamente 50 μm.<ol>
<li>Defina o limite superior da série z usando o ajustador de foco para mover o objetivo para o local de início desejado, na posição mais superficial, e marcando essa posição como zero dentro do software clicando no botão superior da posição z.</li>
			<li>Defina o limite inferior da série z movendo o objetivo para a camada mais profunda (tipicamente 50-70 μm da parte superior para tumores menores) e clicando no botão inferior da posição z.</li>
			<li>Defina o tamanho da etapa z para 5 μm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Clique no botão do painel Time-Lapse e defina o intervalo de tempo entre as aquisições para pelo menos 10 s para fornecer tempo adequado para reabastecer a água acima da lente objetiva. Isto é feito manualmente com uma pipeta do aperto no objetivo durante o lapso de tempo longo.</li>
		<li>Retire a seringa com PBS no cateter da veia cauda e substitua-a por outra seringa contendo o 155 kDa Dextran-TMR (tetrametil rhodamina).</li>
		<li>Injete 100 μL de 155 kDa Dextran-TMR através do cateter de veia cauda.</li>
		<li>Após a injecção, substitua a seringa de TMR pela seringa PBS.</li>
		<li>Adquira uma imagem de lapso de tempo de pilha z clicando nos botões Z-Stack e Time-Lapse e, em seguida, clicando no botão de gravação.</li>
		<li>Injetar 50 μL de PBS a cada 30-45 min para manter a hidratação adequada do animal. Evite injetar mais de 200 μL no tempo, pois isso pode causar sobrecarga de fluido.</li>
	</ol></li>
	<li>Eutanásia
	<ol>
<li>Aumente o isoflurano para 5% e mantenha o animal abaixo de 5% de isoflurano com cone nasal no lugar até 30 s após a cessação das respirações.</li>
		<li>Retire o mouse do palco.</li>
		<li>Realize luxação cervical.</li>
	</ol></li>
	<li>Processamento de imagem
	<ol>
<li>Carregue todas as imagens no ImageJ e formate-as em um hyperstack de 5 dimensões (x, y, z, t e canal de cores).</li>
		<li>Execute a separação da sobreposição espectral (isto é: GFP e CFP) e eliminação da tração x-y dos hyperstacks usando métodos estabelecidos38.</li>
		<li>Use o ajuste de brilho e contraste para aumentar o nível de branco do canal sanguíneo para que o sinal de fundo fique visível.</li>
		<li>Para cada fatia z, Inspecione cuidadosamente cada filme para obter sinais de vazamento vascular transitório (um "Burst"). A execução dos filmes em taxas de quadros rápidas (40 fps) pode ajudar essa identificação.</li>
		<li>Uma vez que uma explosão foi identificada, retorne o brilho para este canal a um nível normal e recorte o hyperstack a esta região e z-fatia.</li>
	</ol></li>
</ol>2. avaliação do dextrano extravascular utilizando análise de tecido fixo
<ol><li>
Preparação do tumor e da amostra Nota: a parte 2 deste protocolo supõe que os tumores da mama estiveram colhidos de um modelo transplantação orthotopic do do rato da transplantação do carcinoma do peito (isto é o MMTV-pymt). Este modelo poderia ser o mesmo que o descrito na parte 1 doSt do protocolo, embora os tumores fluorescently-etiquetados não sejam necessários neste momento.<ol>
<li>Após a terminação do pipeline experimental (ou seja, tratamentos medicamentoso, etc.), realize uma injeção de cauda-vaidosa de 100 μL de 10 mg/mL 155 kDa Dextran-tetrametil rhodamina, 1 h antes de sacrificar os camundongos.</li>
		<li>Sacrifique os camundongos e colha os tumores de mama.</li>
		<li>Corrija os tumores em formalina a 10% para 48-72 h e prossiga para a incorporação de parafina.</li>
		<li>Usando um micrótomo, corte duas lâminas seqüenciais de 5 μm de espessura dos tecidos de parafina encaixados (FFPE) fixos em formalina. Um slide é usado para manchar o Dextran, enquanto o outro será usado para executar TMEM Triple-IHC, para referência. Nota: o protocolo TMEM Triple-immunohistochemistry foi descrito em outra parte 10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SE a coloração e a digitalização para a primeira das duas secções sequenciais
	<ol>
<li>Envie slides para um protocolo de paraffinização padrão. Isso inclui duas imersões subsequentes em xileno (10 min cada), seguidas de desidratação em soluções de álcool serialmente diluídas (100%, 95%, 70% e 50% EtOH em H2O por 2 min cada imersão).</li>
		<li>Realize a recuperação do antígeno pelo aquecimento (perto do ponto de ebulição) as seções submersas no citrato (pH 6,0-ajustado) por 20 minutos.</li>
		<li>Deixe as amostras esfriar a temperatura ambiente para 15-20 min e depois lave em PBS 3x por 2 min cada lavagem.</li>
		<li>Bloco de 60-90 min em tampão de bloqueio (10% FBS; 1% BSA; 0, 25% gelatina de pele de peixe; 0, 5% PBST, ou seja, PBS com 0, 5% Tween-20).</li>
		<li>Incubar amostras com uma mistura de anticorpos primários de ratos e coelhos que visam Endomucin e TMR, respectivamente, e depois lave em PBST 3x,2 min cada.</li>
		<li>Incubar amostras com uma mistura de anticorpos secundários do burro de encontro ao rato IgG (conjugado a Alexa-647) e ao coelho IgG (conjugado a Alexa-488), e lave então em PBST 3x 2 minutos cada um.</li>
		<li>Realize uma coloração DAPI de rotina (ou seja, imersão em solução DAPI por 5-6 min), monte os slides usando um meio de montagem "Hard" sem glicerol e armazene em um local escuro até a digitalização.</li>
		<li>Para obter resultados ideais, digitalize os slides em um scanner de slides inteiro digital.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de imagem
	<ol>
<li>Capture 10 campos de alta potência (HPFs) por caso, usando qualquer software adequado para patologia digital.</li>
		<li>Salve os canais Endomucin (vermelho) e TMR (verde) separadamente como TIFF.</li>
		<li>Usando o ImageJ, carregue os arquivos TIFF e converta-os em imagens de 8 bits.</li>
		<li>Limite as imagens de 8 bits para o nível do controle negativo, e gerar duas imagens binarizadas, mostrando o endomucin e TMR "máscaras".</li>
		<li>A partir das ferramentas binárias , selecione preencher furos na máscara de endomucin.</li>
		<li>Gere e guarde as seguintes cinco regiões de interesse: 1) a imagem de dextrano limitados como "o ROI de dextrano" (ROI1), 2) a imagem limitados do endomucin como o "ROI vascular" (ROI2), 3) a imagem invertida do endomucin como "ROI extravascular" (ROI3), 4) o interseção " ROI extravascular "e" Dextran ROI "imagem (ROI1 ∩ ROI3) como" ROI Dextran extravascular "(ROI4), e 5) toda a imagem como" ROI tumoral "(ROI5).</li>
		<li>Divida a área ROI4 pela área ROI5 e multiplique por 100 para gerar a área de porcentagem que o dextrano extravascular cobre em todo o tumor.</li>
		<li>Repita o processo para 10-20 HPFs por caso (dependendo da disponibilidade do tecido) e gere uma média de Dextran extravascular (% área) para cada caso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não divulgam conflitos de interesse.

Aqui, nós esboçamos dois protocolos que podem ser aplicados para visualizar e quantificar um tipo específico de permeabilidade vascular que esteja atual em entradas de TMEM e esteja associado com o rompimento de junções vasculares apertadas e dos aderens. Este tipo de permeabilidade vascular é transiente e controlado pelo complexo tripartida da pilha de tmem, como explicado acima de5. A capacidade de identificar e quantificar a permeabilidade vascular associada à TMEM é crucial para a avaliação de...

Os avanços recentes em nossa compreensão da metástase do cancro descobriram que a transição epithelial-à-mesenchymal (EMT) e a indução de uma subpopulação migratória/invasora da pilha de cancro não são, por si só, suficientes para a disseminação hematógena 1. indeed, pensou-se previamente que as pilhas de cancro se por metástese intravasate através da totalidade do endotélio cancro-associado como o neovasculature do tumor é caracterizada frequentemente pela baixa cobertura do pericyte, e como tal, é altamente permeável e instável2,3,4. Embora altamente sugestivo de funções defeituosas dentro do tumor, as modificações vasculares durante a carcinogénese não fornecem a evidência por se que as pilhas do tumor podem penetrar vasos sanguíneos facilmente e em uma forma descontrolada. Introspecções dos estudos intravital da imagem latente (IVI), em que as pilhas do tumor Fluorescently-são etiquetadas e o vasculatura é etiquetado através da injeção intravenosa de pontas de prova fluorescentes (tais como o dextrano ou pontos do Quantum), mostra que, quando os vasos do tumor forem uniformemente permeável ao dextranos de baixo peso molecular (por exemplo, 70 kD), o dextranos de alto peso molecular (155 kD) e as células tumorais podem atravessar o endotélio apenas em sítios especializados de intravasação que estão preferencialmente localizados no ponto de ramificação vascular5, 6 anos de , as análises 7. immunohistochemical (IHC) usando modelos animais e o material paciente-derivado humano mostraram que estes locais são "doorways" que se especializam em regular a permeabilidade vascular, localmente e transientemente, fornecendo uma breve janela de oportunidade para que as células cancerosas migratórias/invasivas entrem na circulação. Estas portas são chamadas "microambiente do tumor da metástase" ou "tmem", e, completamente expectedly, sua densidade correlaciona com um risco aumentado de desenvolver a doença metastática em pacientes do cancro da mama8,9, a 10.
Cada porta TMEM consiste em três tipos distintos de células: um macrófago perivascular, uma célula tumoral sobreexpressando a proteína actina-reguladora de mamíferos ativada (Mena), e uma célula endotelial, tudo em contato físico direto uns com os outros1, 5,9,10,11,12,13. O evento-chave para a função de TMEM como uma entrada de intravasação é a liberação localizada do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) para o vaso subjacente pelo macrófago perivascular14. VEGF pode interromper junções neutralizantes entre as células endoteliais15,16,17,18,19, um fenômeno que resulta em vazamento vascular transitório, também conhecida como permeabilidade "estourando" como descrito em estudos de IVI 5. Os macrófagos de tmem foram mostrados para expressar o receptor da tirosina quinase TIE2, que é exigido para a função de tmem VEGF-negociada e homing destes macrófagos ao Niche perivascular5,20,21 , 22. além de regular a disseminação e a metástase de células cancerosas, TIE2+ macrófagos demonstraram ser reguladores centrais da angiogênesetumoral 21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Como tal, TIE2+ macrófagos representam um constituinte crítico do microambiente tumoral e o principal regulador da cascata metastática.
Para conceituar melhor a permeabilidade vascular mediada por TMEM (ou seja, "estourando"), é muito importante distingui-la de outros modos de permeabilidade vascular que não estão associados à dissolução de junções endoteliais de células celulares. Em um endotélio intacto (um cujas junções apertadas e aderens não são interrompidas), existem três tipos principais de permeabilidade vascular: (a) pinocitose, que pode, ou não, ser acoplada à transcitose do material ingerido; (b) transporte de material através de fenestrae endotelial; e (c) transporte de material através da via paracelular, que é regulado por junções apertadas endoteliais15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. embora desregulamentado em muitos tumores, os modos acima mencionados da permeabilidade vascular foram descritos na maior parte no contexto da fisiologia e do Homeostasis normais do tecido, os extremos de que são os tecidos com uma ou outra permeabilidade limitada ( por exemplo, barreira hematoencefálica, barreira sangue-testis), ou permeabilidade abundante (por exemplo, capilares fenestrados do aparelho glomerular renal)34,35,36,37.
Usando a imagem latente intravital do multifotônica e a microscopia multiplexada da imunofluorescência, nós podemos distinguir entre a permeabilidade vascular tmem-negociada ("estourando") e outros modos da permeabilidade vascular em tumores do peito. Para conseguir isto, nós realizamos uma única injeção intravenosa de um peso elevado-molecular, sonda fluorescently-etiquetada nos ratos. Eventos de ruptura espontânea podem ser capturados usando imagens intravitais em camundongos vivos; ou alternativamente, o extravasamento da sonda pode ser quantificado por estudos de colocalização com vasculatura sanguínea (por exemplo, CD31+ ou Endomucin+) e portas tmem usando microscopia de imunofluorescência. Os protocolos apresentados aqui descrevem ambas as técnicas, que poderiam ser usadas independentemente ou conjuntamente umas com as outras.

<table><tbody><tr><td>IgG anti-coelho (Alexa 488)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rato (Alexa 647)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Citrato Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eng Scientific Inc</td><td>9770</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>de cobertura Microscopia eletrônica Ciências</td><td>72296-08</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo de Cianoacrilato</td><td>Henkel</td><td>Adesivo 1647358</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1490</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-Tetrametil-Rodamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Endomucina (anticorpo primário)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-65495</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Bayer</td><td>84753076 V-06/2015</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de Pele de Peixe</td> Seringa de Insulina <td>Fisher Scientific</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorano</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB40234</td><td>Agulha de matriz extracelular artificial</td></tr><tr><td>(30 G)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Tampolado com Fosfato Salino</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>PBS</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Polietileno</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>BB31695-PE / 1</td><td></td></tr><tr><td>Oxímetro de Pulso</td><td>Kent Scientific</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Pomada Veterinária</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Quantum Dots</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>Q21561MP</td><td></td></tr><tr><td>Borracha</td><td>McMaster Carr</td><td>1310N14</td><td></td></tr><tr><td>TMR (anticorpo primário)</td> <td>Invitrogen</td><td>A6397</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biologicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>184835</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

A causa mais comum de mortalidade relacionada ao câncer é a metástase, um processo que requer a disseminação de células cancerosas do tumor primário para sítios secundários. Recentemente, nós estabelecemos que a disseminação da pilha de cancro no cancro da mama preliminar e em locais metastáticos no pulmão ocorre somente nas entradas chamadas MicroEnvironment do tumor da metástase (TMEM). O número da entrada de TMEM é prognóstico para o retorno distante da doença metastática em pacientes do cancro da mama. As portas de tmem são compostas de uma célula cancerosa que expresse sobre-expressa a proteína reguladora de actina Mena no contato direto com um macrófago perivascular, pró-angiogênicos que expresse níveis elevados de TIE2 e de VEGF, onde ambas estas pilhas são amarradas firmemente a um sangue célula endotelial do vaso. As células cancerosas podem intravasate através das entradas de TMEM devido à permeabilidade vascular transiente orquestradas pela atividade comum do macrófago TMEM-associado e da célula cancerosa TMEM-associada de Mena-expressando. Neste manuscrito, nós descrevemos dois métodos para a avaliação da permeabilidade vascular transiente TMEM-negociada: imagem latente intravital e a imunofluorescência fixa do tecido. Embora ambos os métodos tenham suas vantagens e desvantagens, combinar os dois pode fornecer as análises as mais completas da permeabilidade vascular tmem-negociada assim como pré-requisitos microambientais para a função de tmem. Desde o processo metastático no cancro da mama, e possivelmente outros tipos de cancro, envolve a disseminação da pilha do cancro através das entradas de TMEM, é essencial empregar métodos bem estabelecidos para a análise da atividade da entrada de TMEM. Os dois métodos descritos aqui fornecem uma abordagem abrangente para a análise da atividade de entrada de TMEM, seja em animais ingênuos ou farmacologicamente tratados, o que é de suma importância para os ensaios pré-clínicos de agentes que impedem a célula cancerosa disseminação via TMEM.

Os procedimentos experimentais descritos neste artigo do protocolo são resumidos brevemente e ilustrados na Figura 1A-C.
Para medir a permeabilidade vascular mediada por TMEM ("atividade de ruptura") e reduzir o ruído experimental de outros modos de permeabilidade vascular (isto é, transcelular e paracelular, como explicado na introdução), realizamos intravenoso (i.v.) injeção de sondas de alto peso molecular, tais como 155 kDa Dextran, conjugados...

Nós descrevemos dois métodos para avaliar a permeabilidade vascular transiente associada com o microambiente do tumor da função da entrada da metástase (TMEM) e da intravasação da pilha de cancro usando a injeção intravenosa do dextrano high-molecular do peso (155 kDa) nos ratos. Os métodos incluem a imagem latente intravital em animais vivos e a análise fixa do tecido usando a imunofluorescência.

Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Essas técnicas complementares avaliam e medem a permeabilidade da vasculatura tumoral utilizando dextran de alto peso molecular. O protocolo de tecido fixo oferece maior cobertura tumoral, é de alto rendimento e não requer equipamento de imagem multifotono. Por outro lado, o protocolo de imagem intravital oferece informações em tempo real sobre a cinética, função e interação dinâmica das células no microambiente tumoral de metástase ou TMEM.Assim, os protocolos aqui apresentados permitem a medição direta da permeabilidade vascular dependente do TMEM que se correlaciona fortemente com a disseminação de células cancerosas, portanto esses protocolos podem ser utilizados para avaliar o potencial metastático dos tumores. Para gerar pedaços de tecido tumoral adequados para transplante, comece com eutanásia de camundongos portadores de tumores, conforme descrito no protocolo de texto. Coloque uma placa de Petri com meio de cultura celular DMEM/F12 no gelo no capô da fumaça.Leve o rato para o capô da fumaça e higienize o abdômen do rato com 70% de álcool etílico. Usando luvas estéreis e ferramentas cirúrgicas, remova os tumores e coloque-os na placa de Petri. Corte o tumor em pequenos pedaços, descartando porções necrosadas enquanto estiverem na placa de Petri.Para transplantar os pedaços do tumor em hospedeiros receptores, anestesizem camundongos que foram criados com macrófagos geneticamente modificados e rotulados fluorescentemente, conforme descrito no protocolo de texto. Reduza a anestesia para aproximadamente 3% de isofluorano e aplique pomada oftálmica aos olhos do camundongo para evitar a secagem. Remova o cabelo da quarta glândula mamária do rato.Depois de limpar a pele com antisséptico, use instrumentos esterilizados para fazer uma pequena incisão de aproximadamente dois a três milímetros apenas inferior ao quarto mamilo. Disseca até que a almofada de gordura mamária seja exposta. Pegue uma peça de tumor da placa de Petri e cubra em matriz extracelular artificial.Transplante de tumores sob a quarta almofada de gordura mamária. Feche a incisão usando adesivo de cianoacrilato. Por fim, adicione um mililitro de antibiótico enrofloxacina à água potável dos animais.Anestesiar o mouse e inserir um cateter da veia da cauda conforme descrito no protocolo de texto. Faça uma incisão longitudinal de linha média começando imediatamente superior aos genitais e leve a incisão até o nível do aspecto superior da quarta glândula mamária. Leve a incisão transversal ao aspecto superior da quarta glândula mamária.É fundamental evitar comprometer o suprimento de sangue neste momento. Estabilize a aba da pele afixando um pequeno pedaço de borracha rígida medindo dois por dois centímetros ao lado da pele da aba. Os tumores devem estar no centro da área sendo estabilizados pela borracha.Aplique uma pequena película de cianoacrilato na borda externa da moldura da janela de imagem feita sob medida. Agora aplique uma pequena gota de PBS no centro do vidro de cobertura. Evite o contato entre o cianoacrilato na moldura da janela e o PBS no vidro para evitar a polimerização prematura do cianoacrilato.Seque o tecido de retalho ao redor com um lenço de laboratório. Afixe a pequena janela de imagem na aba de tecido com o tumor no centro da abertura clara. Transfira o cateter anestoizado do rato e da veia da cauda para o estágio do microscópio.Tenha extrema cautela para garantir que o cateter da veia da cauda não caia. Neste ponto, realize imagens intravitais de longo prazo, conforme descrito no protocolo de texto e em nossa publicação anterior do JoVE. Para maior análise de rendimento e maior cobertura tumoral, use imunofluorescência em tecido fixo para avaliar a permeabilidade vascular mediada pelo TMEM.Para realizar a coloração da imunofluorescência, primeiro prepare as amostras como descrito no protocolo de texto e, em seguida, realize a recuperação de antígenos aquecendo as seções submersas em citrato perto do ponto de ebulição por 20 minutos. Depois de deixar as amostras esfriarem até a temperatura ambiente por 15 a 20 minutos, lave as amostras em PBS três vezes por dois minutos cada lavagem. Bloqueie por 60 a 90 minutos no tampão de bloqueio, em seguida, incubar amostras com uma mistura de ratos primários e anticorpos rápidos que visam a endomucina e a tetrametodamina, respectivamente.Após a incubação, lave as amostras três vezes em PBST por dois minutos cada. Incubar amostras com uma mistura de anticorpos de burro secundário contra Rat IgG e IgG rápido, em seguida, lave as amostras três vezes em PBST por dois minutos cada. Realize uma coloração da DAPI de rotina e monte os slides usando um meio de montagem dura sem glicerol.Armazene as amostras em um local escuro até a varredura. Para obter resultados ideais, escaneie os slides em um scanner de slides digital. Para realizar a análise de imagens, capture 10 campos de alta potência por caso usando qualquer software adequado para patologia digital.Salve os canais de endomucina e TMR separadamente como TIFF. Usando ImageJ, carregue os arquivos TIFF e converta-os em imagens de 8 bits. Limite as imagens de 8 bits ao nível do controle negativo e gere duas imagens binarizadas mostrando as máscaras de endomucina e TMR.A partir das ferramentas binárias, selecione Preencher furos na máscara de endomucina. Gere a imagem limiar do Dextran e salve-a como ROI do Dextran. Além disso, gere a imagem de endomucina limiar e salve-a como ROI Vascular e gere a imagem de endomucina invertida e salve-a como ROI extravascular.Em seguida, gere a imagem do ROI Extravascular e do ROI DoXtran e salve-a como ROI Extravascular Dextran. Finalmente salve toda a imagem como ROI tumoral. Divida a área extravascular do ROI do Dextran pela área do ROI tumoral e multiplique por 100 para gerar a área percentual que o Dextran Extravascular cobre em todo o tumor.Repita o processo para 10 a 20 campos de alta potência por caixa e gere um Dextran extravascular médio para cada caso. Mostrada aqui é uma imagem de uma glândula mamária saudável e em desenvolvimento dentro de um animal transgênico. A vasculatura é rotulada por TMR Dextran em vermelho, epitélio dúctil mamário é rotulado pela proteína fluorescente dendra2 em verde, e macrófagos são rotulados por uma proteína fluorescente ciano.Em contraste, um carcinoma dútil invasivo com rótulo de dendra2 é mostrado em um animal com macrófagos e vasos rotulados. Tecido pulmonar saudável foi visualizado através de uma janela de imagem pulmonar dentro de um rato com vasculatura rotulada. Metástases pulmonares são evidentes após a injeção de células tumorais em um animal transgênico com macrófagos rotulados e vasculatura.Aqui estão imagens intravitais de um filme de imagem intravital de alto peso molecular rotulado de Vasos neo-angiogênicos dentro de um carcinoma invasivo de dendra2 transplantado da mama. A linha amarela pontilhada denota o contorno da área de vazamento vascular transitório antes, durante e depois do evento de vazamento. Uma porta TMEM é capturada em imagens ao vivo.A imunofluorescência multicanal mostra endomucina, de alto peso molecular Dextran, sua imagem mesclada junto com o DAPI, bem como o vaso sanguíneo limiar correspondente e máscaras Extravasculares Dextran. A seção sequencial correspondente da imunohistoquímica TMEM também é mostrada. O perfil vascular afastado do TMEM aparece como um perfil vascular não vazado, enquanto o perfil vascular associado ao TMEM aparece como um perfil vascular vazado.É muito importante evitar o corte dos vasos sanguíneos que fornecem o tumor durante a exposição cirúrgica do tumor. A metodologia aqui descrita pode ser combinada com o tratamento medicamentoso, o mesmo que inibir a função TMEM, prevenir a permeabilidade vascular, ou até mesmo normalizar a vasculatura tumoral para medir seu impacto e eficácia. Com estes protocolos, demonstramos anteriormente que a quimioterapia aumenta a permeabilidade vascular e a disseminação de células cancerosas e, na verdade, que essas alterações pró-metastáticas podem ser contornadas pela coadministração de inibidores da função TMEM.

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Research

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Pesquisa sobre o Câncer

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento...

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

Descreve-se um método relativamente simples para a imagiologia ex vivo, ao vivo das interacções de células de estroma tumoral dentro de metástase pulmonar, utilizando repórteres fluorescentes, em ratinhos. Utilizando microscopia confocal de disco rotativo, esta técnica permite a visualização de células vivas durante pelo menos 4 horas e pode ser adaptado para estudar outras condições inflamatórias do pulmão.

Ex vivo de imagens ao vivo de pulmão Metástase e seu microambiente

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para executar imagiologia prolongado de lapso de tempo de interacções multicelulares em tempo real, in vivo, a resolução de células simples.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para realizar imagens de célula única de alta resolução de longo prazo do pulmão intacto em tempo real usando uma janela de imagem estabilizada a vácuo.

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Este protocolo descreve a intravital imagem de ratos transgênicos expressando marcadores fluorescentes específicos de célula. Intravital imagem fornece um método não-invasivo para observações de alta resolução em animais vivos usando windows implantáveis, através do qual a visualização microscópica de processos é possível. Este método é especialmente útil para estudar processos longitudinais.

A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e esculpir uma barreira cerebral sanguínea microambienta tumoral metastático e, em seguida, quantificar seu estado usando imagens confocal e inteligência artificial (machine learning).

Quantificando o microambique do tumor metastático cerebral usando um modelo 3D de chip de órgão, aprendizado de máquina e tomografia confocal

Este é um método eficaz para testar supressores ou condutores de metástase de câncer. As células, transduzidas com uma biblioteca de expressão, são injetadas na vasculatura da membrana corioallantóica do frango para formar colônias metastáticas. Colônias que têm diminuído ou aumentado a invasividade são extirpadas, expandidas, reinjetadas para confirmar seu fenótipo e, finalmente, analisadas usando alto sequenciamento de rendimento.

Descoberta de reguladores metastáticos usando um modelo de membrana corioallantóica intravital rápida e quantitativa

Aqui, apresentamos um protocolo para a implantação cirúrgica de uma janela óptica permanentemente habitante para o tórax murino, que permite imagens intravitais de alta resolução do pulmão. A permanência da janela torna-a adequada ao estudo de processos celulares dinâmicos no pulmão, especialmente aqueles que estão evoluindo lentamente, como a progressão metastática das células tumorais disseminadas.

Uma janela permanente para investigar metástase do câncer no pulmão

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

Este protocolo apresenta um modelo tumor-on-a-chip fisiologicamente relevante para realizar pesquisa básica e translacional de câncer humano de alto rendimento, rastreamento avançado de drogas, modelagem de doenças e abordagens de medicina personalizada com uma descrição de procedimentos de carregamento, manutenção e avaliação.

Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

A tradução dos achados da microscopia intravital é desafiada por sua penetração em profundidade rasa no tecido. Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com câmara de janela dorsal que permite o co-registro de microscopia intravital e modalidades de imagem clinicamente aplicáveis (por exemplo, TC, RM) para correlação espacial direta, potencialmente simplificando a tradução clínica dos achados da microscopia intravital.

Um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobra cutânea dorsal para microscopia intravital combinada e ressonância magnética na pesquisa translacional do câncer

Aprenda a avaliar a permeabilidade vascular dependente de TMEM em tumores usando imagem intravital e análise de tecido fixo com dextran de alto peso molecular. Estes métodos correlacionam-se com disseminação de células cancerígenas.

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Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

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