Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA

O protocolo é usado para mutagênese de saturação de um local de ligação de proteínas. Se o seu site de ligação de proteínas não for conhecido, ele pode ser identificado usando este protocolo. A técnica tem relevância para diagnóstico da doença e terapia.

Acredito que seu potencial total em ciências biomédicas continua a ser totalmente explorado. Este método pode ser amplamente aplicado a qualquer proteína ou reação onde moléculas desejadas possam ser separadas de moléculas indesejadas. Certifique-se de que a biblioteca está devidamente randomizada, e certifique-se de que durante cada ligação e separação o enriquecimento da dobra de etapas das moléculas desejadas seja alto.

Envolve várias etapas e muitos detalhes que são melhor demonstrados, em vez de explicados em palavras. Depois de assistir a este vídeo, você deve estar confortável com como preparar uma biblioteca aleatória, sintetizar uma piscina de RNA inicial e realizar uma reação vinculante a moléculas desejadas e indesejadas separadas para obter alta afinidade e aglutinantes específicos. Primeiro, síntese da cartilha dianteira e da cartilha inversa por síntese química em um sintetizador de DNA.

Além disso, sintetiza um modelo de oligonucleotídeo de biblioteca aleatória com 31 posições aleatórias. Em um tubo PCR, misture um modelo de biblioteca aleatória de DNA de um micromolar, primer avançado de um micromolar contendo promotor de polimerase T7 RNA e primer reverso, Tris de 20 milimilôlares no pH oito, 1,5 milimônio cloreto de magnésio, 50 milimil milimólares de cloreto de potássio, 1-microgramas por mililitro acetilado de soro bovino, duas unidades de polimerase Taq, e 200 micromolar cada um de dNTPs. Configure a máquina PCR com cinco ciclos de desnaturação, renascendo e etapas de extensão, seguida de um ciclo de extensão para anexar o promotor à biblioteca de DNA.

Configure uma reação de transcrição de 100 microliter contendo buffer de transcrição T7, DNA de piscina de biblioteca aleatória de um micromolar, DTT de cinco milimolalar, GTP de dois milimil, um mililitro cada de ATP, CTP e UTP, e duas unidades por microliter T7 RNA polymerase. Agora coloque um escudo de vidro acrílico e luvas. Introduza a radioatividade adicionando 5 microliters ou menos de UTP alfa-32P na reação de transcrição para autoradiografia.

Incubar a mistura de reação em um tubo de microcentrifuuagem por duas horas a 37 graus Celsius. Para purificar o RNA em gel, prepare um gel de poliacrilamida de 10% desnaturado. Carregue amostras nos poços do gel.

Exponha o gel a uma película de raio-x, e identifique a localização das transcrições do gel e corte a fatia de gel. Coloque a fatia de gel em um tubo de centrífuga e quebre em pedaços menores com uma ponta homogeneizadora. Adicione tampão Proteinase K para imergir as peças de gel.

Deixe o tubo em um nutador por pelo menos duas horas em temperatura ambiente. Em seguida, gire em um microcentrifuuge de alta velocidade por cinco minutos à temperatura ambiente para remover os detritos do gel e recuperar a solução tampão. Adicione um volume igual de fenol-clorofórmio no tubo com o supernatante, vórtice e centrífuga.

Repita a extração com fenol-clorofórmio mais uma vez e depois com clorofórmio mais uma vez. Em seguida, misture a fase aquosa do tampão proteinase K com 1/10 volume de acetato de sódio de três molares em pH 5,2, 10 microgramas de tRNA ou 20 microgramas de glicogênio, e dois a três volumes de etanol armazenados a menos 20 graus Celsius. Deixe o tubo a menos 80 graus Celsius por uma hora.

Gire o tubo contendo a solução por cinco a 10 minutos a quatro graus Celsius em uma microcentrifuagem. Descarte o supernatante cuidadosamente, e adicione 70% de etanol para enxaguar a pelota de RNA. Gire por dois a cinco minutos.

Aspire o etanol cuidadosamente, e seque a pelota de RNA. Em seguida, adicione 50 microliters de água tratada com DEPC para solubilizar a pelota de RNA. Deixe a amostra a menos 20 graus Celsius para armazenamento.

Para ligar proteína e RNA em um volume de reação de 100 microliters, primeiro prepare o cloridrato tris de 10 milimilas no pH 7.5 contendo cloreto de potássio de 50 milimilitos, um milimolar DTT, 09 microgramas por microliter boina bovina albumina, 5 unidades por microliter RNAsin, 15 microgramas por microliter tRNA, e um mililitro EDTA. Em seguida, adicione 30 microliters de proteína recombinante PTB e 10 microliters de RNA da piscina apropriada. Coloque os tubos contendo as reações de ligação em um bloco de temperatura por cerca de 30 minutos a 25 graus Celsius.

Em seguida, fracione o RNA vinculado do RNA desvinculado através de quatro rodadas de seleção e amplificação. Primeiro, filtrar a amostra de 100 microliter à temperatura ambiente através de um filtro de nitrocelulose ligado a um coletor de vácuo. O complexo de proteína RNA permanece no filtro.

Com uma lâmina de barbear estéril, corte o filtro em fragmentos e insira-os em um tubo de centrífuga. Mergulhe as peças do filtro no tampão proteinase K, e coloque-a em um copo por pelo menos três horas ou durante a noite para recuperar o RNA. Para desproteinizar a amostra de RNA, adicione um volume igual de fenol-clorofórmio, vórtice e, em seguida, centrífuga em alta velocidade por cinco minutos à temperatura ambiente.

Obtenha a fase aquosa, e extrair com clorofórmio novamente. Depois disso, misture o supernascido com 1/10 de volume de acetato de sódio de três molares no pH 5.2 e dois a três volumes de etanol absoluto. Deixe o tubo em um congelador Celsius de menos 80 graus por 30 minutos e, em seguida, centrifuá-lo em alta velocidade por 10 minutos.

Repita as etapas de lavagem e secagem com 70% de etanol e solubilize o RNA em água tratada pelo DEPC. Após a primeira rodada de ensaio de ligação do filtro, realize mais três rodadas. Em seguida, realize duas rodadas de transcrição, vinculação e amplificação para separar as frações de RNA ligadas à proteína das frações não vinculadas.

Pré-procmitei um gel nativo de 5% de poliacrilamida com 60 para um acrilamida-bis-acrilamida em 5x tampão TBE. Em seguida, configure a reação de ligação RNA-proteína. Coloque o gel em um dispositivo de eletroforese preenchido com tampão 5x TBE em uma sala fria a quatro graus Celsius.

Aplique 250 volts por 15 minutos e pipeta a reação de ligação em diferentes poços. Em seguida, fracione ainda mais o RNA vinculado do RNA desvinculado, executando a eletroforese a 250 volts por uma a duas horas. Em seguida, exponha o gel a uma película de raio-x, e identifique a localização do RNA vinculado usando autoradiografia.

Corte a fatia de gel com o RNA ligado e insira-a em um tubo. Esmague a fatia de gel e incuba no tampão proteinase K por três horas ou durante a noite. Repita a extração com fenol-clorofórmio e clorofórmio como descrito anteriormente.

Sintetizar cDNA do RNA dissolvido. Prepare 20 microliters de reação, incluindo dois microliters de tampão 10x RT, dois microliters de transcriptase reversa AMV, um microliter de primer reverso, cinco microliters de água e 10 microliters do RNA dissolvido. Incubar a 42 graus Celsius por 60 minutos.

Amplie o cDNA usando ciclos de 20 a 25 ciclos PCR como descrito anteriormente. Repita o processo de síntese de RNA, ligação proteica e separação de frações ligadas à proteína e não vinculadas. Para analisar a ligação proteica, use o ensaio de mudança de mobilidade do gel ou o ensaio de ligação do filtro para determinar a afinidade e a especificidade de ligação para piscinas selecionadas ou sequências individuais dentro de cada pool.

Use autoradiografia ou um imager de fósforo para detectar e quantificar bandas na fração vinculada e fração desvinculada. Continue o protocolo com clonagem e alinhamento de sequência. Neste estudo, foi alcançada uma ampliação de seleção bem sucedida.

A proteína de ligação do trato polipirimidina mamífera com concentração proteica 300 vezes maior mostra uma ligação pouco detectável à sequência zero da piscina, mas alta afinidade para a piscina de sequência selecionada. Amplificação de seleção identificada com sucesso em proteínas de ligação de RNA com local de vinculação preferencial ou consenso. A adição do PTB recombinante, que se liga a um local de emenda de três prime a montante, leva à ativação do local alternativo ou a jusante de três primes.

Em contraste, a adição de hnRNP C recombinante leva à repressão de ambos os locais de emenda de três prime. A adição do fator de emenda geral recombinante U2AF65 inverteu a repressão do local de emenda de três prime mediado pelo HNRNP C. É importante lembrar que uma boa biblioteca aleatória e condições adequadas de ligação que dão alto enriquecimento em cada etapa de ligação são necessárias para o sucesso.

Ensaios funcionais adequados e testes in vivo podem ser usados para validar o resultado dessa abordagem. No campo da expressão genética, funções de inúmeras proteínas têm sido estudadas utilizando essa técnica. É importante usar luvas e vedação radioativa para proteção enquanto trabalha com poliacrilamida e radioatividade.