Construção de Plasmids CRISPR e Detecção de Eficiência de Nocaute em Células Mamíferas através de um Sistema de Repórteres Dual Luciferase
5 de dezembro de 2020
Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo um método simplificado para a geração eficiente de plasmídeos expressando tanto a enzima CRISPR quanto o RNA guia único associado (sgRNAs). A co-transfecção de células mamíferas com este vetor sgRNA/CRISPR e um vetor de repórter de luciferase dupla que examina o reparo de quebra de dois fios permite avaliação da eficiência do nocaute.
Este protocolo descreve os principais passos na geração e otimização de vetores sgRNA eficientes. Nossa pré-celeração de candidato sgRNA visa tempo relativo e inferência. A principal vantagem deste protocolo é que torna possível analisar as impressões de codificação de DNA para cada uma das sgRNAs sem editar genes endógenos.
Este método de pré-seleção também pode ser aplicado a outras medidas de edição de genes através de quebras duplas. Comece diluindo os oligonucleotídeos linofphilizados para uma concentração final de 10 micromolar em água dupla destilada. Misture oligonucleotídeos para a frente e para frente em um tubo PCR de paredes finas em uma proporção de um para um sem adicionar nenhum buffer extra.
Incubar a mistura a 95 graus Celsius por cinco minutos, depois diminuir a temperatura para 72 graus Celsius por 10 minutos. Remova a mistura de oligonucleotídeo da máquina PCR e deixe esfriar à temperatura ambiente. Para digerir o vetor pX330-xCas9, com Bbs1, misture o vetor, a enzima e o tampão de digestão em um volume de 50 microliter e incubar a reação a 37 graus Celsius por duas horas.
Após realizar a transformação celular, escolha de cinco a dez colônias bacterianas da placa LB e use cada uma delas para inocular um mililitro de mídia LB com 60 miligramas de ampicillina em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, incubar os tubos em um agitador rotativo por duas a três horas. Execute PCR para tela para plasmídeos recombinantes, conforme descrito no manuscrito do texto, em seguida, execute os produtos em um gel Agarose de 2% abaixo de 10 volts por centímetro.
Depois de identificar os plasmídeos positivos, use-os, juntamente com um vetor repórter, para co-transfectar uma linha celular apropriada. Para lise as células, remova o meio de crescimento das células cultivadas. Lave suavemente a superfície do vaso de cultura com PBS e dispense 100 microliters de PLB em cada cultura bem para cobrir completamente a camada mono celular.
Deixe a placa incubar à temperatura ambiente por 20 minutos e, em seguida, transfira o lise para um tubo ou frasco para mais manuseio ou armazenamento. Para realizar o ensaio de luciferase dupla, programe os luminômetros para proporcionar um atraso pré-leitura de dois segundos seguido de um período de medição de 10 segundos. Em seguida, distribua 100 microliters de reagente de ensaio de luciferase no número apropriado de tubos luminômetros.
Adicione cuidadosamente 20 microliters de lise celular no tubo luminômetro e misture por pipetação duas ou três vezes. Coloque o tubo no luminômetro e inicie a leitura. Remova o tubo de amostra do luminômetro.
Adicione 100 microliters de reagente stop e vórtice brevemente para misturar. Devolva a amostra ao luminômetro e inicie a leitura. Regisso recorde a atividade Renilla Luciferase, normalizada para a atividade Desalumbrada Luciferase, especificamente a recíproca da razão exibida na tela.
Descarte o tubo de reação quando terminar. Este método foi usado para gerar três vetores sgRNA para ovelhas DKK2 Exon 1. sgRNA e xCas9 expressando vetores foram construídos pré-digerindo a espinha dorsal vetorial seguido por ligando-o em uma série de fragmentos de DNA curtos e de dois fios através de pares de oligo de renas.
Sete colônias bacterianas foram examinadas com par de primer específico guiado PCR e as colônias positivas foram detectadas. As capacidades de segmentação genética de pX330-xCas9 T1, T2 e T3 foram detectadas simultaneamente com o ensaio de luciferase dupla. O último vetor sgRNA exibiu o maior sinal de detecção e foi posteriormente usado para pesquisa de edição de genes de ovelhas.
Seguindo este protocolo, um ensaio T7EI ou um ensaio de Ribonuclease podem ser realizados. Essas medidas adicionais dão impressões mais precisas da edição de genes endógenos.
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Visão geral
Este protocolo descreve um método simplificado para gerar plasmídeos que expressam a enzima CRISPR e o RNA guia único (sgRNAs) associado. Permite a avaliação da eficiência de knockout através da co-transfecção com um vetor repórter de luciferase dupla.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Edição genética
- Tecnologia CRISPR
- Construção de plasmídeos
Fundo
- A geração eficiente de vetores sgRNA é crucial para a edição genética.
- O protocolo permite a análise de impressões de codificação de DNA sem editar genes endógenos.
- A pré-seleção de alvos de sgRNA pode melhorar a eficiência da edição.
- Este método pode ser aplicado a várias medidas de edição genética.
Propósito do estudo
- Fornecer um protocolo para gerar vetores sgRNA eficientes.
- Facilitar a análise da eficácia do sgRNA na edição genética.
- Simplificar o processo de avaliação da eficiência de knockout.
Métodos utilizados
- Diluição de oligonucleotídeos liofilizados para uma concentração final de 10 micromolar.
- Mistura de oligonucleotídeos diretos e reversos em um tubo de PCR.
- Co-transfecção de células de mamíferos com vetor sgRNA/CRISPR e vetor repórter.
- Avaliação da eficiência de reparo de quebra de dupla fita.
Principais resultados
- O protocolo permite a geração eficiente de vetores sgRNA.
- A eficiência de knockout pode ser avaliada efetivamente.
- A pré-seleção de alvos de sgRNA melhora o processo de edição.
- O método é aplicável a outras estratégias de edição genética.
Conclusões
- Este protocolo fornece uma abordagem confiável para gerar vetores sgRNA.
- Facilita a análise da edição genética sem alterar genes endógenos.
- O método pode ser adaptado para várias aplicações em edição genética.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Efficient sgRNA vector construction and rapid knockout efficiency assessment are critical for accelerating CRISPR-based target validation in early discovery pipelines. The dual luciferase reporter system enables quantitative, pre-endogenous screening of candidate sgRNAs, reducing time and resource expenditure before full-scale gene editing. This workflow supports portfolio triage by prioritizing sgRNAs with the highest editing potential for downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid preselection of sgRNAs with high editing efficiency before endogenous gene targeting.
- Supports functional target validation by quantifying double-strand break repair via reporter assays.
- Reduces mechanistic ambiguity by isolating sgRNA performance in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in CRISPR reagent selection for subsequent studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative readout for sgRNA activity using dual luciferase ratios.
- Improves assay reproducibility and comparability across candidate sgRNAs.
- Enables scalable screening of multiple sgRNA constructs in parallel.
- Prepares validated sgRNA/CRISPR vectors for downstream gene editing workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sgRNA selection with translational goals by ensuring only high-efficiency reagents advance.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by minimizing failed edits in disease-relevant models.
- De-risks preclinical studies by front-loading sgRNA efficacy assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling efficient sgRNA selection prior to endogenous gene editing and downstream functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway interrogation by enabling rapid sgRNA efficacy screening.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible luciferase-based outputs for sgRNA comparison.
- Analytics: Provides normalized dual luciferase ratios to objectively rank sgRNA performance.
- Translational Research: Ensures only validated, high-performing sgRNAs progress to disease-relevant or preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for sgRNA validation across multiple gene targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in CRISPR reagent selection.
- Operational Value: Standardizes sgRNA screening and accelerates vector construction timelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by prioritizing high-efficiency sgRNAs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and reduces late-stage failure due to ineffective gene editing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell transfection, and luciferase assay execution.
- Needs access to PCR, gel electrophoresis, and luminometer instrumentation.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data normalization.
- Adaptable to various mammalian cell lines and gene targets with appropriate optimization.
- Dependent on accurate oligonucleotide design and vector preparation for reproducible results.
