Controle espacial e temporal da iniciação de melanoma murino de células-tronco de melanócitos mutantes

O melanoma é amplamente diagnosticado em todo o mundo, com incidência crescente. Esses protocolos permitem que os estágios iniciais do início do melanoma sejam cuidadosamente controlados, facilitando o estudo de seu desenvolvimento. Controlando a hora e a localização da ativação de células-tronco de melanócitos, temos a capacidade de discernir as mudanças dentro da população de células-tronco e sua nova iniciação de melanoma de cepa.

Demonstrando o procedimento serão Dahihm Kim e Luye An, estudantes de pós-graduação do laboratório. Dois a três dias antes de iniciar o procedimento, use um aparador elétrico para raspar a pele dorsal de cada rato anestoetizado de sete semanas de idade. No dia do experimento, use um cotonete para aplicar uma fina camada de creme depilatório à pele exposta.

Uma vez aplicado o creme uniformemente, use cotonetes de algodão limpos para remover o creme, seguido de limpeza suave com um pano úmido para remover qualquer creme residual. Em seguida, devolva cada rato para sua gaiola doméstica com monitoramento até a recuperação completa. Para irradiação UV-B, cubra a pele dorsal com material protetor UV-B para que apenas a região desejada seja exposta, e cubra a câmara UV com uma tampa resistente a UV.

Em seguida, ligue a lâmpada UV-B para irradiar o mouse para o período experimental adequado antes de devolver o mouse a uma gaiola vazia com monitoramento até a recuperação completa. Para isolar as amostras de pele, use um aparador elétrico para remover qualquer cabelo da área dorsal da pele dos camundongos irradiados eutanizados, e escove levemente a pele exposta com um tecido livre de fiapos para limpar a área. Faça uma pequena incisão com uma tesoura afiada logo acima da base da cauda e insira uma tesoura grande e sem cortes na incisão para separar os tecidos conjuntivos subdérmicos.

Usando uma tesoura afiada, corte cuidadosamente ao longo da borda da região da pele de interesse para isolar a amostra de tecido e colocar o tecido da pele excisado em uma toalha de papel limpa. Em seguida, use fórceps maçante para esticar a pele para que ela adere à toalha e fique esticada. Quando todas as amostras tiverem sido colhidas, coloque uma amostra de pele e papel toalha em um pedaço de papel filtro dobrado imediatamente adjacente ao vinco, tomando cuidado para que a amostra seja lisa e não dobrada ou amassada.

Feche as laterais do papel do filtro com grampos e corte o papel. Em seguida, submergir totalmente as amostras em formalina tamponada 10% neutra por três a cinco horas à temperatura ambiente antes de lavar os tecidos com duas lavagens de cinco minutos em água desionizada. Após a segunda lavagem, remova cuidadosamente qualquer material residual dos tecidos da pele e corte as bordas das amostras para que elas não sejam irregulares.

Em seguida, faça três cortes sagiais em cada amostra para que a largura das tiras não seja superior a cinco milímetros, e faça cortes transversais para que as amostras não sejam mais do que 20 milímetros de largura. Posicione um molde criogeno contendo temperatura de corte ideal ou meio OCT em uma orientação retrato, e coloque quatro a cinco pedaços de pele em cima do OCT. Quando todas as peças estiverem no lugar, use dois pares de fórceps finos para trazer a longa borda de cada pedaço de pele para o fundo do molde criogeno para que as amostras sejam verticais dentro do OCT e perpendiculares à base do molde.

Em seguida, encha o molde com OCT adicional para o segundo lábio e coloque o molde em uma superfície plana de um pedaço de gelo seco, usando fórceps para ajustar quaisquer pedaços de pele que possam ter mudado durante a transferência à medida que o bloco começa a congelar conforme necessário. Quando os ratos são sete semanas pós-natal, sua pele dorsal está em telogen. Durante o telogen, as células-tronco do folículo piloso e melanócito são conhecidas por estarem em estado de repouso quiescente, e a pele não deve apresentar crescimento capilar significativo após a barba.

A depilação química, no entanto, pode induzir a ativação de células-tronco do folículo piloso, induzindo um crescimento capilar significativo na região de interesse. Como a depilação química pode induzir significativamente a ativação de células-tronco folículos capilares e melanócitos, células-tronco propensas a melanoma em um estado ativo podem formar tumores e a iniciação de melanoma microscópico pode ser observada dentro de duas semanas após a depilação química. A irradiação UV-B também pode induzir a iniciação tumoral a partir de células-tronco quiescentes e propensas a tumores.

É importante ressaltar que o UV-B induz a translocação direta de células-tronco de melanócitos de seu nicho de células-tronco foliculares para a epiderme inter folicular. Além disso, o UV-B pode induzir a formação de melanoma cutâneo originário de células-tronco de melanócitos ao longo da epiderme interfollicular. Semelhante à pele dorsal, a iniciação de melanoma induzido por UV-B pode ser notavelmente observada em outras áreas da pele, como a pele do ouvido.

De fato, em comparação com a pele do ouvido de controle, coberta por pano resistente a UV, a pele do ouvido exposta ao UV-B demonstra uma pigmentação maior devido a uma maior carga de iniciação de melanoma. Diferentes doses de UV-B podem ter efeitos diferentes na pele do rato e na atividade de melanócitos. Portanto, é importante determinar e otimizar a dose de irradiação antes de iniciar seu experimento.