Name: Isolamento e cultura de células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprenda a isolar células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura usando digestão enzimática com colagenase IV. Este método eficiente fornece células com mais de 97% de pureza para pesquisas em xenotransplantação.

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O trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação de ciências naturais da província de Guangdong, concessão/número do prêmio: 2016A030313028; Fundação médica da pesquisa científica da província de Guangdong, concessão/número da concessão: B2018003; Fundação de Shenzhen da ciência e da tecnologia, concessão/número da concessão: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 e JCYJ20160428142040945; Fundação do distrito de Shenzhen Longhua da ciência e da tecnologia, concessão/número da concessão: 2017013; Programa nacional da chave R & D de China, concessão/número da concessão: 2017YFC1103704; Sanming projeto de medicina em Shenzhen, Grant/Award Number: SZSM201412020; Fundos especiais para a construção de hospitais de alto nível na província de Guangdong (2019); Fundo para a construção da disciplina médica de nível elevado de Shenzhen, concessão/número da concessão: 2016031638; Shenzhen Fundação de saúde e planejamento familiar Comissão, Grant/Award Number: SZXJ2017021 e SZXJ2018059. Agradecemos a Hancheng Zhang e Zhicheng Zou da Universidade de Shenzhen por ajudar na preparação do manuscrito.

O uso de animais foi aprovado pelo Comitê de ética de revisão do hospital do segundo povo de Shenzhen, de acordo com os princípios do bem-estar animal.
1. preparação de animais, médios e buffers
<ol><li>Prepare o porco em miniatura. Nota: todos os porcos em miniatura foram chineses Wuzhishan ou Bama porcos (masculino). A idade e o peso dos suínos foram de 100 dias ± 8 dias e 5,7 kg ± 1,0 kg (média ± DP, n = 3), respectivamente.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura: meio de células endoteliais (ECM) suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal inativado por calor (FBS), 1% (v/v) penicilina/estreptomicina (P/S) e 1% (v/v) suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS).</li>
	<li>Prepare o tampão de lavagem: solução de 1X PBS (pH 7,4) com 1% (v/v) P/S.</li>
	<li>Prepare uma solução digestiva de colagenase 0, 5% IV: 1 mg de pó de colagenase IV em 20 ml de solução de PBS. Pré-aqueça a solução digestiva do colagenase em 37 ° c antes da digestão.</li>
	<li>Prepare o tampão de parada: o meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% calor-inactivated FBS e 1% P/S.</li>
</ol>2. cirurgia e preparo para isolamento da célula endotelial aórtica porcina
<ol><li>Desinfecção da sala de operação com luz UV para 1 h e desinfetante médico 84 líquido (o teor de cloro disponível é 4,0%-5,0%, tabela de materiais) antes de realizar a cirurgia.</li>
	<li>Após o suíno em miniatura ter recebido uma injecção intramuscular formada por 15 mg/kg de cetamina, 15 mg/kg de cloridrato de Xylazina e 0, 5 mg/kg de cloridrato de fenacetina (volumes: 100μL/kg, tabela de materiais) (Figura 1a), confirme a Estado de anestesia com a verificação de estímulo doloroso porcino (por exemplo, beliscando uma orelha ou agitando um forelimb) e índice fisiológico (por exemplo, pressão arterial, coração e frequência respiratória). Nota: outra meia dose de injecção pode ser administrada ao porco se mostrar os sinais de acordar.</li>
	<li>Cortar o abdômen com um bisturi, expor a veia cava inferior e, consequentemente, injetar heparina sódica (5.000 U, tabela de materiais) na veia cava inferior com seringa de 5 ml.</li>
	<li>Cinco minutos depois, insira um cateter na aorta abdominal com sangue, corte a pele do tórax e incise o diafragma com um bisturi e, subsequentemente, corte o ventrículo esquerdo. Nota: Certifique-se de que o porco é eutanasiado verificando o pulso aórtico após o sangue e cortando o coração.</li>
	<li>Exponha as costelas com fórceps ósseo (tabela de materiais), e expor o coração e os pulmões. Encontre a aorta posterior para o coração e os pulmões e prenda as duas extremidades. Lave a aorta uma vez com tampão de lavagem pré-arrefecido (Figura 1B, C).</li>
	<li>Corte a aorta com tesoura e mantenha a aorta presa em cada extremidade. Excesso de tecido de consumo em torno da aorta com fórceps estéril e tesoura. Coloque a aorta em um tubo de centrífuga de 50 mL, lave a aorta com tampão de lavagem pré-arrefecido 3x (30 mL por lavagem) e transfira a aorta para o laboratório (Figura 1D).</li>
</ol>3. isolamento de células endoteliais aórticas porcinas
<ol><li>Em condições assépticas, retire a aorta do porco do tampão de lavagem e coloque-a em uma placa de Petri de 150 mm (Figura 2a).</li>
	<li>Cortar suavemente as duas extremidades da aorta e o excesso de tecido de consumo em torno da aorta com fórceps estéril e tesouras novamente (Figura 2b). Lave o exterior e o interior da aorta (sobre o prato de cultura à temperatura ambiente) com 20 − 50 mL de tampão de lavagem. Nota: tentar cortar apenas a área onde os grampos foram colocados durante a cirurgia, uma vez que alguns ECs foram danificados nesta área, e remover o excesso de tecidos e ramos laterais arteriais.</li>
	<li>Passar uma sutura cirúrgica através da aorta e, em seguida, amarrar uma extremidade da aorta usando a sutura cirúrgica (5-0, 90cm, tabela de materiais). Manter a sutura cirúrgica no interior da aorta (Figura 2C,D).</li>
	<li>Fixar suavemente a aorta perto da extremidade amarrada com fórceps e, em seguida, puxar a sutura cirúrgica lentamente para reverter a aorta até que a superfície endotelial da aorta seja exposta (Figura 2E-G). Nota: Assegure-se de fixar a aorta perto da extremidade amarrada e não fixar a aorta firmemente, ou então a aorta não pode ser revertida puxando a sutura cirúrgica.</li>
	<li>Lave a superfície endotelial da aorta com tampão de lavagem 3x (10 mL por lavagem) e, em seguida, descarte esta solução. Coloque a aorta em um tubo de centrífuga de 15 ml e cubra a aorta com 10 ml de solução digestiva de colagenase IV a 0, 5% no tubo (Figura 2h). Nota: pré-aqueça a solução digestiva colagenase 0, 5% IV a 37 ° c antes da digestão.</li>
	<li>Incubar a 37 ° c durante 15 min. Coloque a aorta digerida e a solução digestiva em um prato de cultura de 100 mm e interrompa os efeitos de 0, 5% de colagenase IV adicionando 10 − 15 ml de tampão de parada pré-arrefecido. Nota: o tempo de digestão recomendado é entre 10 e 20 minutos. Certifique-se de que a superfície endotelial da aorta esteja coberta pelo tampão de parada.</li>
	<li>Raspe suavemente os pAECs da superfície interna da aorta usando um raspador de células (Figura 2I). Lave a aorta raspada 3x com tampão de lavagem (5 mL por tempo). Põr a solução do prato da cultura em um tubo de centrifugação de 50 mL. Lave a parte inferior do prato de cultura 2x com tampão de lavagem (5 mL por o tempo), e põr a solução em um tubo de centrifugação de 50 mL outra vez. Nota: raspe em uma direção suavemente e não comprima. Não toque no tecido perto das bordas e furos. A raspagem 5 − 8x é recomendada.</li>
	<li>Centrifugue o tubo a 600 x g durante 6 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante e deixe 10 mL de solução na parte inferior de um tubo de centrífuga de 50 mL. Adicione 20 mL de tampão de lavagem ao tubo de centrífuga de 50 mL e resuma os pellets. Evite bolhas durante esta etapa.</li>
	<li>Centrifugador a 600 x g durante 6 min a 4 ° c. Elimine lentamente o sobrenadante. Resuspend as pelotas da pilha com 1 mL do meio de cultura e misture bem. Nota: o número médio obtido de ECs por cm de aorta é de 1,9 x 105 ± 1,4 x 104 (média ± DP, n = 3).</li>
	<li>Conte as células com um contador de células. Placa e cultura as células em uma embarcação sem revestimento de quaisquer materiais de acordo com o número da célula. Se o número da célula for menor ou igual a 1,0 x 106, células de cultura em um balão de 25 cm2 . Se o número da célula for maior que 1,0 x 106, células de cultura em vários frascos de 25 cm2 (1,0 x 106 células por balão). Coloque o balão numa incubadora (sem agitação) a 37 ° c com 5% de CO2 e substitua o meio a cada 2 − 3 dias. Nota: algumas células são danificadas pelo raspador de células. Um ensaio de viabilidade celular encontrou o percentual de células ao vivo para 95,7% ± 1,7% (média ± DP, n = 3). O tempo de duplicação das células isoladas é de cerca de 1 − 2 dias.</li>
</ol>4. colheita e caracterização de células endoteliais puras
<ol><li>Deixe as células crescerem por cerca de 4 − 5 dias. Quando as células atingem 80% confluência (Figura 3a), digerir as células com 0,25% tripsina e passagem das células. Em seguida, recolher algumas das células isoladas (dia 3, passagem 1 e passagem 2) e identificar por citometria de fluxo (com um anticorpo CD31).</li>
	<li>Rótulo isolado de pAECs (número de células: 1 x 105) (dia 3, passagem 1 e passagem 2) com anticorpo conjugado CD31-Fluorescein antiporcina (FITC) (10 μL de anticorpo para células por 100 μl, corados por 30 min a 4 ° c) para análise de citometria de fluxo.</li>
	<li>População total da pilha viva da porta com uma parcela dispersada para diante, amostra unmanchado como um controle negativo. Em seguida, apresente as células CD31 positivas das células fechadas com histograma. Nota: a eficácia das células CD31-positivas é 97,4% ± 1,2% (dia 3), 94,4% ± 1,1% (P1) e 92,4% ± 1,7% (P2) (média ± DP), respectivamente (Figura 3B).</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+transplantation+in+China%3A+concerns+remain%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Organ transplantation in China: concerns remain.</a> Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).</li>
<li>Ekser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+xenotransplantation%3A+the+next+medical+revolution%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?</a> Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).</li>
<li>Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+genetically+engineered+pigs+in+xenotransplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research.</a> The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).</li>
<li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).</li>
<li>McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells%3A+role+in+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells: role in infection and inflammation.</a> World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).</li>
<li>Ekser, B., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+barriers+to+xenotransplantation%3A+prospects+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).</li>
<li>Yeom, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+aortic+endothelial+cell+genes+responsive+to+selected+inflammatory+stimulators%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators.</a> The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).</li>
<li>Beigi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+isolating+highly+purified+and+functional+porcine+aortic+endothelial+and+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).</li>
<li>Jansen of Lorkeers, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+Human+Cardiomyocyte+Progenitor+Cells+Does+Not+Improve+Cardiac+Function+in+a+Porcine+Model+of+Chronic+Ischemic+Heart+Failure.+Results+from+a+Randomized%2C+Blinded%2C+Placebo+Controlled+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial.</a> PLOS One. 10 (12), e0143953(2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+Antigens+Involved+in+Delayed+Xenograft+Rejection+in+a+Ggta1%2FCmah+Dko+Pig-to-Monkey+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10024(2017).</li>
<li>Paris, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASGR1+expressed+by+porcine+enriched+liver+sinusoidal+endothelial+cells+mediates+human+platelet+phagocytosis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro.</a> Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).</li>
<li>Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+human+and+porcine+platelet+oligosaccharides+may+influence+phagocytosis+by+liver+sinusoidal+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro.</a> Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).</li>
<li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+70%2C+heat+shock+protein+32%2C+and+vascular+endothelial+growth+factor+production+and+their+effects+on+lipopolysaccharide-induced+apoptosis+in+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+%26+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells.</a> Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).</li>
<li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li>
<li>Graupera, M., Claret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cells%3A+New+Players+in+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%3A+TEM%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).</li>
<li>Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+endothelial+progenitor+cells+for+therapeutic+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Radiation+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization.</a> Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).</li>
<li>Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+stem+and+progenitor+cell+transplantation+for+organ+vascularization+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration.</a> Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).</li>
<li>Jain, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+death%2C+angiogenesis%2C+and+microvascular+function+after+castration+in+an+androgen-dependent+tumor%3A+role+of+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).</li>
<li>Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+transplantation+of+cardiac+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells.</a> BioMed Research International. 2013, 359412(2013).</li>
<li>Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).</li>
<li>Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Purification+of+Epithelial+and+Endothelial+Cells+from+Mouse+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).</li>
<li>Naschberger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Endothelial+Cells+from+Normal+Colon+and+Colorectal+Carcinoma+-+An+Improved+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57400(2018).</li>
<li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+endothelial+colony-forming+cells+from+mononuclear+cells+of+rat+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).</li>
<li>Chi, L., Delgado-Olguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Mouse+Placental+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).</li>
<li>Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+strategies+to+bring+islet+xenotransplantation+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).</li>
<li>Yi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Accelerate+Collagen+Digestion+by+Bacterial+Collagenase+in+Lung+Tissue+Strips%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips.</a> Frontiers in Physiology. 7, 287(2016).</li>
<li>Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase-+and+trypsin-dissociated+heart+cells%3A+a+comparative+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).</li>
<li>Yonenaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+of+collagenase+treatment+for+isolation+of+articular+chondrocytes+from+aged+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues.</a> Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).</li>
<li>French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+proteolysis+of+type+I+collagen+at+hyperreactive+sites+by+class+I+and+II+Clostridium+histolyticum+collagenases%3A+complementary+digestion+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns.</a> Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).</li>
<li>Hara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+investigation+of+pig+cells+for+resistance+to+human+antibody-mediated+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%3A+Official+Journal+of+the+European+Society+for+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection.</a> Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).</li>
<li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of fibroblast cultures.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As células endoteliais são comumente utilizadas na pesquisa de disfunção vascular, diabetes, regeneração tecidual, transplante e cânceres14,15,16,17,18. Para compreender e caracterizar a biologia e a função de ECS nestas doenças, os métodos numerosos para isolar o ECS de órgãos ou de tecidos doentes diferentes foram relatados8,</su...

A escassez de órgãos disponíveis para a transplantação é um problema proeminente World-Wide1. De acordo com a Cruz Vermelha da sociedade de China, somente um número pequeno de pacientes com falha de órgão da fase final recebeu um órgão apropriado em China em 2018.
O xenotransplante é uma forma promissora de resolver o problema da escassez de órgãos. Os órgãos do porco são considerados ser os órgãos os mais apropriados para seres humanos por causa das similaridades anatômicas e fisiológico2,3. A falha de um xenograft do porco é relacionada pela maior parte às respostas imunes da rejeição e da coagulação do primata. As células endoteliais porcinas (ECS) são críticas, uma vez que essas células são as primeiras a interagir com o sistema imunológico do primata, que inclui anticorpos, complemento, citocinas e células imunes (por exemplo, células T, células B e macrófagos)4,5. A porcina ECS desempenha um papel vital no órgão de suínos e no Islet xenotransplante6,7. Assim, os ECs são células importantes para investigar as respostas de rejeição e coagulação a um enxerto de porco. A isolação de ECS suínos de alta qualidade é exigida para a pesquisa do xenotransplante.
Em tentativas de isolar ECS de diferentes órgãos (por exemplo, coração, rim, fígado e aorta), vários protocolos têm sido relatados em uma configuração de xenotransplante8,9,10,11,12. Entretanto, manter uma cultura ultrapura de ECs isolado é um problema proeminente em protocolos padrão. O aumento da concentração da solução digerida, o tempo de digestão inadequado e a intensidade de raspagem podem contribuir para o aumento da contaminação do fibroblastos nos estudos atuais8,10,13. Além disso, o método de pAECs isolados de suínos em miniatura é menos estudado. Aqui, nós descrevemos um método enzimático otimizado para isolar pAECs altamente purificados de suínos em miniatura (Wuzhishan ou Bama). Várias etapas do protocolo foram projetadas para reduzir a contaminação de fibroblastos e obter ECs de alta pureza.

<table><tbody><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boneforceps</td><td>Pequim HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China</td><td>HL-YGQ&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Descartável BOON (10ml)</td><td>Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31-FITC anticorpo</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1746F</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3010#</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138#-1G</td><td></td></tr><tr><td>Composto de injeção de cetamina&nbsp;</td><td>Fábrica farmacêutica veterinária de Shenyang, China</td><td></td><td>Cloridrato de cetamina? 0,3 g / 2 ml, cloridrato de xilazina: 0,3 g / 2 ml, cloridrato de fenacetina? 1 mg / 2 ml</td></tr><tr><td>DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-fenilidol, dicloridrato)</td> <td>Life Technologies</td><td>D1306 #</td><td></td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965118 #</td><td></td></tr> <tr><td>ECM</td><td>Sciencell</td><td>1001 #</td><td></td></tr> <tr><td>ECGS</td><td>Sciencell</td><td>1052#</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL)&nbsp;</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C#</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100mm Placa de Cultura de Células</td><td>Corning</td><td>353003#</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino</td><td>GIBCO</td><td>10270-106#</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fórceps&nbsp;</td><td>Xangai instrumentos médicos Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Jiangsu WanBang biofarmacêutica Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tintura de iodo</td><td>Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porco em miniatura (Bama ou Wuzhishan)</td> <td>Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio Mshot&nbsp;</td><td>Fornecedor verificado - Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd.</td><td>M152</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (150 x 15 mm)</td><td>Biologixgroup</td><td>66-1515#</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070063#</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Cultura de Células de Pescoço Inclinado Retangular com Tampa de Ventilação? T25?</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3289#</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência Sorológica (10ml)</td><td>JET Biofil</td><td>GSP010010#&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur Estéril</td><td>GeneBrick</td><td>GY0025#</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Seringa Estéril (0.22&micro; m)</td> <td>Millipore</td><td>SLGV033RS #</td><td></td></tr> <tr><td>bisturi cirúrgico</td><td>Xangai instrumentos médicos Co., Ltd.China</td><td>22 #</td><td></td></tr> <tr><td>sutura cirúrgica</td><td>Xangai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd</td><td>5-0 #</td><td></td></tr> <tr><td>Seringa?</td><td>Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>GIBCO</td><td>25200056 #</td><td></td></tr> <tr><td>75% Álcool médico</td><td>Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 x solução PBS (pH 7,4, livre de nuclease)</td> <td>Sangon Biotech</td><td>B540627 #</td><td></td></tr> <tr><td>Desinfetante médico 84 líquido</td><td>Província de Sichuan Yijieshi Medical Technology Co., Ltd</td><td>450ml/bottle</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura de células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplante é uma maneira promissora para resolver a escassez de órgãos humanos para pacientes com insuficiência de órgãos em estágio final, e o porco é considerado como uma fonte de órgão adequada. A rejeição imune e a coagulação são dois obstáculos principais para o sucesso do xenotransplante. A lesão e a disfunção da célula endotelial vascular (EC) são importantes para o desenvolvimento das respostas de inflamação e coagulação no xenotransplante. Assim, o isolamento de células endoteliais aórticas porcinas (pAECs) é necessário para investigar as respostas de rejeição imune e coagulação. Aqui, desenvolvemos uma abordagem enzimática simples para o isolamento, caracterização e expansão de pAECs altamente purificados de suínos em miniatura. Primeiramente, o porco diminuto foi anestesiado com cetamina, e um comprimento da aorta foi extirpado. Em segundo lugar, a superfície endotelial da aorta foi exposta a 0, 5% de solução digestiva de colagenase IV por 15 min. terceiro, a superfície endotelial da aorta foi raspada em apenas uma direção com raspador de células (< 10 vezes), e não foi comprimida durante o processo de Raspagem. Finalmente, os paecs isolados do dia 3, e após a passagem 1 e a passagem 2, foram identificados pelo fluxo citometria com um anticorpo CD31. As porcentagens de células CD31-positivas foram 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1% e 92,4% ± 1,7% (média ± DP), respectivamente. A concentração de Collagenase IV, o tempo digestivo, o sentido, e a freqüência e a intensidade da raspagem são críticas para diminuir a contaminação do fibroblasto e obter a elevado-pureza e um grande número ECs. Em conclusão, nosso método enzimático é um método altamente effctive para isolar ECs da aorta diminuta do porco, e as pilhas podem ser expandidas in vitro para investigar as respostas imunes e da coagulação no xenotransplante.

Nosso método visa fornecer uma maneira eficaz de isolar ECs altamente purificados das aortas de suínos em miniatura. O processo de cirurgia da aorta é mostrado na Figura 1. O primeiro passo é que toda a aorta é extirpada do porco. Prevenir outra célula ou contaminação bacteriana é muito importante. Assim, não ferir outros órgãos ou tecidos no caso de células não segmentadas ou bactérias contaminar a aorta, e lavar a aorta com tampão de lavagem pré-arrefecido 3x (Figura 1...

Um método enzimático eficaz para o isolamento de células endoteliais aórticas primárias porcinas (pAECs) de suínos em miniatura é descrito. Os pAECs preliminares isolados podem ser usados para investigar a resposta imune e da coagulação no xenotransplante.

Isolamento e cultura de células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

O método é um método altamente eficaz para isolar células endoteliais de suínos em miniatura. E as células também podem ser expandidas, investigar a resposta imune e coagulação na xenotransplante. A principal vantagem da técnica é que não só é fácil, altamente eficaz isolar células de endotélio altamente purificadas do porco, mas também melhor para manter outros pAECs quando passagem.Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo da dor no porco anestesiado, lave a parede abdominal suína três vezes com 75% de álcool médico e uma tintura de iodo. Após a última lavagem, use um bisturi para fazer uma incisão abdominal para expor a veia cava inferior, e use uma seringa de cinco mililitros para injetar 5000 unidades de sódio de heparina na veia cava inferior. Após cinco minutos, insira um cateter na aorta abdominal e use um bisturi para incisar o diafragma.Com a ajuda de um segundo investigador, remova o ventrículo esquerdo e use fórceps ósseos para extirpar as costelas para expor o coração e os pulmões. Localize a aorta posterior para o coração e pulmões, e aperte as extremidades. Use uma tesoura para extiridar a aorta e lave-a uma vez com tampão de lavagem pré-resfriado.Remova qualquer excesso de tecido ao redor da aorta com fórceps estéreis e tesouras, e coloque o vaso em um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo tampão de lavagem pré-resfriado fresco para transferência para o laboratório. Para o isolamento da célula endotelial porcina, transfira a aorta de porco para uma placa de petri de 150 milímetros em condições assépticas, e remova suavemente ambas as extremidades do vaso. Apare qualquer excesso adicional de tecido onde o vaso tenha sido fixado, com fórceps estéreis e tesouras, e use 20 a 50 mililitros de tampão de lavagem fresco para enxaguar o exterior e o interior da aorta.Em seguida, passe uma sutura cirúrgica através da aorta, e amarre vagamente uma extremidade do vaso, mantendo a sutura dentro do lúmen. Fixar suavemente a aorta perto da extremidade amarrada com fórceps e, em seguida, puxar a sutura cirúrgica lentamente, para reverter a aorta, até que a superfície endotelial da aorta seja exposta. Lave a superfície endotelial da aorta três vezes com 10 mililitros de tampão de lavagem fresco por lavagem, e coloque a aorta em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Cubra a amostra com 10 mililitros de 37 graus Celsius aquecidos 0,005% de solução digestiva IV de colagenase, e incubar o tecido a 37 graus Celsius por 15 minutos. No final da incubação, transfira todo o conteúdo do tubo para um prato de cultura de 100 milímetros, e prenda a digestão com 10 a 15 mililitros de tampão de parada pré-resfriado. Usando um raspador de célula, remova suavemente as células endoteliais aórticas da superfície interna do vaso, e lave o vaso três vezes com cinco mililitros de tampão de lavagem por lavagem.Após a última lavagem, transfira o supernatante para um tubo de centrífugas de 50 mililitros, e lave o fundo do prato de cultura duas vezes com cinco mililitros de tampão de lavagem fresco, por lavagem, puxando as lavagens no tubo de 50 mililitros. Recolher as células por centrifugação, e descartar todos, menos os últimos 10 mililitros de supernascedor. Adicione 20 mililitros de tampão de lavagem para resuspensar a pelota, tomando cuidado para evitar bolhas, e coletar as células com outra centrifugação.Resuspenque a pelota em um mililitro de meio de cultura celular para contar, e plaque as células em uma única vez dez para as seis células por 25 centímetros de concentração de frascos quadrados. Em seguida, coloque as células na incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, refrescando o meio a cada dois ou três dias. Após o isolamento, as células endoteliais são inspecionadas nos dias zero, um e dois, e após passagens um e dois para contaminação e sua avaliação morfológica.A análise citométrica de fluxo usando um anticorpo anti-CD31-FITC indica uma população tipicamente maior do que 97% de marcador de células endoteliais no terceiro dia de cultura, que é mantida com mais de 90% de pureza mesmo após duas passagens. A superfície endotelial da aorta foi raspada em apenas uma direção, com um raspador de células, por menos de 10 vezes, e não foi comprimida durante o processo de raspagem. Melhor resposta, método otimizado de isolamento de pAECs, podemos usar pAECs purificados para realizar experimentos individuais e investigar a rejeição imune e a resposta à coagulação na xenotransplante.

isolation-culture-primary-aortic-endothelial-cells-from-miniature

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós fornecemos um método para isolar e populações de cultura pura de células endoteliais válvula cardíaca (VEC). VEC pode ser isolado de ambos os lados da cúspide ou folheto e imediatamente a seguir, a célula intersticial subjacente isolamento (VIC) é simples.

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Um método para semeadura de titânio de sangue entrar em contato com biomateriais com células autólogas e biocompatibilidade teste é descrito. Este método utiliza células progenitoras endoteliais e tubos de titânio, semeadas em poucos minutos de implante cirúrgico em suínos as cavas. Esta técnica é adaptável a muitas outras implantáveis ​​dispositivos biomédicos.

Autólogas progenitoras endoteliais Cell Technology Semear e Teste de biocompatibilidade para dispositivos Cardiovascular em Modelo Animal Grande

Neste vídeo, demonstramos um procedimento para a remoção cirúrgica da aorta de porcos em miniatura. As células endoteliais colhidas dessas aortas isoladas podem ser cultivadas em condições in vitro para estudar a coagulação e as respostas imunes.

Isolamento da aorta suína: um procedimento cirúrgico para extirpar a aorta torácica de porcos em miniatura para análise a jusante

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células endoteliais da aorta abdominal de um modelo de porco usando digestão de colagenase em uma etapa. As células endoteliais podem ser cultivadas para outras aplicações a jusante.

Isolamento de células endoteliais da aorta suína (pAEC): um método baseado em enzimas para isolar células endoteliais da aorta abdominal suína colhida

A capacidade de isolar células endoteliais da válvula cardíaca (VECs) é fundamental para a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento, manutenção e doença da válvula.  Aqui descrevemos o isolamento de VECs de camundongos Tie2-GFP embrionários e adultos usando FACS que permitirá estudos determinando a contribuição de VECs em processos de desenvolvimento e doença.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

As células endoteliais vasculares desempenham um papel significativo em muitos distúrbios cardiovasculares importantes. Este artigo descreve um método simples para isolar e expandir as células endoteliais da aorta do camundongo sem o uso de nenhum equipamento especial. Nosso protocolo fornece um meio eficaz de identificar mecanismos na fisiopatologia das células endoteliais.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

São necessários novos métodos de isolamento de células endoteliais primárias de vasos sanguíneos. Este protocolo descreve uma nova técnica que inverte completamente os vasos sanguíneos de interesse, expondo apenas o lado endotelial à digestão enzimática. A cultura de células endoteliais puras resultante pode ser usada para estudar doenças cardiovasculares, modelagem de doenças e angiogênese.

Isolamento e cultura de células endoteliais primárias de Artérias e Veias canina

Vários protocolos foram desenvolvidos e descritos para o isolamento de diferentes tipos de células cardíacas a partir de um coração de rato. Aqui, descreve-se um protocolo otimizado que permite o isolamento de tipos de células cardíacas maiores (cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos) de alta qualidade de uma única preparação, reduzindo os custos experimentais.

Isolamento Simultâneo de Cardiomiócitos de Alta Qualidade, Células Endoteliais e Fibroblastos de um Coração de Rato Adulto

Apresentamos um modelo in vitro que permite o estudo e a análise de coagulação em inteiro, sangue não anticoagulado. Anticoagulação no sistema depende do efeito anticoagulante natural das células endoteliais saudáveis e ativação de células endoteliais resultará na coagulação.

Avaliação das propriedades das células endoteliais utilizando cultura de células 3D e sangue não anticoagulado anticoagulantes e anti-inflamatório

Este protocolo descreve a coleta de valvas aórticas humanas extraídas durante procedimentos cirúrgicos de substituição valvar aórtica ou de tecido cadavérico e o subsequente isolamento, expansão e caracterização de células endoteliais e intersticiais valvares primárias específicas do paciente. Estão incluídos detalhes importantes sobre os processos necessários para garantir a viabilidade celular e a especificidade do fenótipo.

Isolamento de Células Valvares Primárias Humanas para Modelagem de Doenças In Vitro

Neste artigo, células endoteliais primárias do pulmão foram isoladas e cultivadas de camundongos neonatais.

Isolamento de Células Endoteliais Primárias de Pulmão de Camundongo

Aprenda a isolar células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura usando digestão enzimática com colagenase IV. Este método eficiente fornece células com mais de 97% de pureza para pesquisas em xenotransplantação.

Isolamento e cultura de células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura

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