Name: 식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 배우세요 원자력 현미경 검사법을 사용하여 식물 세포 및 조직의 기계적 특성과 터거 압력을 측정하는 방법을. 비침습적 기법으로 생체 샘플에서 정확한 데이터를 획득할 수 있습니다.

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PLATIM 팀의 기술 지원에 감사드리며, 아레즈키 부다우드와 RDP 연구소의 생물물리학 팀원들에게 도움이 되는 토론에 감사드립니다.

<ol><li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth of the plant cell wall.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).</li>
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<li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).</li>
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<li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li>
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<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+growth+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diffuse growth of plant cell walls.</a> Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).</li>
<li>Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).</li>
<li>Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+rectangular+atomic+force+microscope+cantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).</li>
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<li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+%28SNAP%29+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

식물의 모양의 출현은 주로 시간과 공간 동안 성장의 조정 속도와 방향에 의해 결정된다. 식물 세포는 다사카리딕 매트릭스로 만들어진 단단한 세포벽에 싸여 있으며, 이 세포는 이를 함께 붙입니다. 그 결과, 세포 확장은 세포벽에 당기는 터거 압력과 이 압력에 저항하는 세포벽의 강성 사이의 평형에 의해 제어된다. 근본적인 발달메커니즘을 이해하기 위해서는 주어진 장기의 다른 조직 또는 세포에서 세포벽 기계적 특성뿐만 아니라 터고 압력을 모두 측정할 수 있어야 합니다. 이 백서에서 설명한 것처럼 AFM은 이 컨텍스트에서 선택하는 방법입니다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 탈수증을 피하기에 충분히 빨리해야 조직 준비입니다. 이는 특히 터거 압력을 측정하려는 경우 매우 중요할 수 있습니다. 매우 중요한 것은 시료를 기판에 정확하게 고정시키는 것입니다: 불안정한 샘플은 광학적으로 쉽게 감지할 수 있는 거시적 움직임, 또는 힘 곡선의 강한 변형과 같은 매우 명백한 효과...

원자력 현미경 검사법 (AFM)은 일반적으로 몇 나노미터의 반경을 가진 끝이 견본의 표면을 검사하는 스캐닝 프로브 현미경 검사법 (SPM) 가족에 속합니다. 표면의 검출은 광학 또는 전자 기반 방법을 통해 달성되지 않고 팁과 샘플 표면 사이의 상호 작용 힘을 통해 달성됩니다. 따라서, 이 기술은 샘플 표면의 지형 특성화(몇 나노미터까지 내려갈 수 있는 3D 분해능)에 국한되지 않고 정전기, 반데르발스 또는 접촉력과 같은 모든 유형의 상호 작용 력을 측정할 수 있다. 또한, 팁은 생물학적 샘플의 표면에 힘을 가하고 기계적 특성 (예를 들어, 영의 계수, 점탄성 특성)을 결정하기 위해 생성 된 변형, 소위 "들여 쓰기"를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
식물 세포벽의 기계적 성질은 발달 과정 1,2,3의기본 메커니즘을 이해하려고 할 때 고려해야 할 필수적입니다. 실제로, 이러한 특성은 세포가 성장할 수 있도록 세포벽 연화가 필요하기 때문에 특히 발달 중에 엄격하게 조절된다. AFM은 이러한 특성을 측정하고 장기, 조직 또는 발달 단계 간에 변화하는 방식을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
이 백서에서는 AFM을 사용하여 세포벽 기계적 특성과 터거 압력을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 2개의 응용은 2개의 다른 AFM 현미경에 설명되고 후에 여기에서 상세합니다.

<table><tbody><tr><td><강>성장 배지</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000x 비마틴 원료 용액</td><td></td><td></td><td>은 ACM을 만드는 데 사용됨, 조성은 Stanislas et al., 2017 참조. 오토클레이브 후 붓기 전에 ACM에 추가하십시오.</td></tr><tr><td>1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)</td> <td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>132-66-1</td>은 <td>애기장대 매체에 첨가하며, 10 &mu;M. 붓기 전에 오토클레이브 후 첨가합니다.</td></tr><tr><td>한천</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>9002-18-0</td>은 <td>애기장대 매체에 1% w/v.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Merck Millipore</td><td>9012-36-6</td>은 <td>고체 ACM, 0.8 % w / v를 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>애기장대 배지</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>DU0742.0025</td><td>체외 애기장대 배양용, 11.82g/L.</td></tr><tr><td>질산칼슘 사수화물</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>13477-34-4</td>는 <td>애기장대 배지에 2mM를 추가합니다.</td></tr><tr><td>무라시게 & SKOOG MEDIUM</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>M0221.0025</td><td>ACM, 2.2 g / L를 만드는 데 사용되는 기저 염 혼합물.</td></tr><tr><td>N6-벤질아데닌(BAP)</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>1214-39-7</td>은 <td>ACM, 555nM을 만드는 데 사용됩니다. 오토클레이브 후 붓기 전에 ACM에 추가하십시오.</td></tr><tr><td>Oryzalin</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>19044-88-3</td><td>오리잘린 치료, 10 &mu; g/mL입니다.</td></tr><tr><td>식물 보존 혼합물 (PPM)</td><td>ACM, 0.1 % v / v를 만드는 데 사용되는 식물 세포 기술. 붓기 전에 오토 클레이브 후 ACM에 첨가하십시오.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화 칼륨</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>1310-58-3</td>은 <td>애기장대 배지 및 ACM, 둘 다 pH 5.8을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>설탕</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>57-50-1</td>은 <td>ACM, 1% w/v를 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>AFM용 도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioScope Catalyst BioAFM</td><td>Bruker</td><td></td><td>이 프로토콜에서 터거 압력 측정에 사용되는 AFM입니다.</td></tr><tr><td>Nanowizard III + CellHesion</td><td>JPK (Bruker)</td><td></td><td>기계적 특성을 측정하는 데 사용되는 AFM입니다.</td></tr><tr><td>Patafix</td><td>UHU</td><td>D1620</td><td></td></tr><tr><td>참조 탄성 구조</td><td>NanoIdea</td><td>2Z00026</td><td></td></tr><tr><td>Reprorubber-Thin Pour</td><td>Flexbar</td><td>16135</td><td>생체 적합성 접착제.</td></tr><tr><td>구형 AFM 팁</td><td>Nanoandmore</td><td>SD-SPHERE-NCH-S-10</td><td>기계적 특성 측정에 사용되는 팁.</td></tr></tbody></table>

식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

우리는 여기에 식물 조직을 들여 쓰기 위해 원자력 현미경 검사법의 사용을 제시하고 기계적 특성을 회복합니다. 들여쓰기 모드에서 두 개의 서로 다른 현미경을 사용하여 탄성 계수체를 측정하고 이를 사용하여 세포벽 기계적 특성을 평가하는 방법을 보여줍니다. 또한 turgor 압력을 평가하는 방법도 설명합니다. 원자력 현미경 검사법의 주요 장점은 비 침습적이고 상대적으로 빠르며 (5 ~ 20 분), 피상적으로 평평한 거의 모든 유형의 살아있는 식물 조직이 치료없이 분석 될 수 있다는 것입니다. 팁 크기와 단위 면적당 측정 횟수에 따라 해상도가 매우 좋을 수 있습니다. 이 방법의 한 가지 제한은 표면 세포 층에 직접 액세스 할 수 있다는 것입니다.

그림 1A 및 그림 1B는 QI 맵을 획득할 위치를 찾는 데 사용되는 프로토콜의 1.3.4 ~ 1.3.6 단계의 결과를 보여주는 스크린샷을 보여 준다. 관심 영역이 기울어진 표면 (즉, 가능한 한 평평하지 않도록)에 선택되었음을 언급 할 가치가 있습니다. 사실, Routier 등 5에의해 발견 된 바와 같이, 들여 쓰기 축이 표면에 수직이 아닌 경우, 측정 영의 계수는 과소 평가 될 수있다. 이 효과는 그림1의 C 또는 D 패널의 오른쪽 위 모서리에 표시되며, 여기서 셀 테두리의 일부가 셀의 나머지 부분보다 부드러워 보입니다. 이 효과에 의해 유도된 아티팩트는 국소 기울기 각도가 50 x 50 μm2 스캔 영역을 통해 40°를 쉽게 극복할 수 있는 메...

여기에서, 우리는 세포와 조직에 나노 및 마이크로 들여 쓰기 공구로 작동하는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 제시합니다. 이 계측기는 시료의 3D 표면 지형과 세포벽 Young의 계수및 터거 압력을 포함한 기계적 특성을 동시에 수집할 수 있습니다.

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

식물 세포의 기계적 특성은 근본적인 개발 메커니즘을 이해하려고 할 때 고려해야 합니다. 원자력 현미경 검사는 이러한 특성을 측정하는 데 사용할 수 있으며 장기, 조직, 모든 발달 단계 사이에서 변화하는 방식을 따를 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은, 침습적이지 않으며, 상대적으로 빠르며, 살아있는 샘플에 직접 적용 될 수 있도록 치료가 필요하지 않다는 것입니다.이 절차에 익숙하지 않은 사람의 경우 샘플의 시스 섹션은 매우 중요하므로 샘플의 적절한 기계적 고정이 있는지 확인하십시오. 이 절차의 시각적 데모는 샘플 고정, 육성 및 측정 설정의 품질 관리의 복잡성을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 시몬 보비오, 엔지니어와 유첸 롱, 내 실험실에서 게시물 문서입니다.먼저 양면 테이프 를 직경 5센티미터의 페트리 접시 중앙에 놓습니다. 꽃봉오리에서 테이프에 분리된 창세기 샘플을 추가합니다. 탈수를 피하기 위해 시료가 완전히 덮일 때까지 접시에 물을 빠르게 넣습니다.그런 다음 샘플을 AFM 단계에 배치하고 샘플을 통해 머리를 움직입니다. 캔틸레버를 보정한 후 소프트웨어에서 시스템이 QI 모드에 있는지 확인하고 15나노 뉴턴의 세트 포인트 힘으로 시료에 접근한다. 다음으로, 4개의 미크론의 Z 길이를 설정하고 40으로 설정된 픽셀 수와 함께 80미크론으로 스캔 영역을 80마이크로너로 설정합니다.그런 다음 고급 이미징 설정 패널로 이동하여 모드를 일정한 속도로 설정합니다. 또한, 세트는 초당 200미크론으로 트랙 속도를 입력하고, 샘플 속도는 25킬로 헤르츠로 확장한다. 매개 변수가 설정되면 팁을 샘플의 관심 영역으로 이동합니다.스캔할 영역이 파편이 없는지 확인하고, 가능한 한 평평한 영역을 찾고, 참여를 유도한 다음 스캔을 시작하고 빠른 저력 스캔을 사용하여 샘플이 이동하는지 확인합니다. 관심 영역이 있는 대로 되면 60 마이크론 제곱에 의해 40~60인 영역을 선택하고 픽셀 수를 미크로네당 2픽셀로 늘립니다. 다음으로, 100 나노 나노 뉴턴으로 설정 점을 증가시키고, 백에서 200 나노 미터의 들여쓰기를 얻는다.Z 길이를 2개의 미크론으로 줄이고, 연장은 초당 100미크론으로 요로 속도를 입력한 다음 샘플 속도를 50킬로헤르츠로 증가시키고 시료 를 스캔하기 시작합니다. 완료되면 출력을 이미지와 데이터 파일로 저장합니다. 데이터 처리 소프트웨어를 열고 데이터 파일을 로드합니다.맵의 모든 곡선에서

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

원자력 현미경(AFM)을 사용하여 식물 조직의 기계적 특성을 매핑하는 방법을 설명합니다. 우리는 식물 발달 중 세포벽에서 발생하는 기계적 변화를 광시야 중간 규모로 기록하여 이러한 변화가 성장 및 형태 형성과 상관 관계가 있을 수 있도록 하는 방법에 중점을 둡니다.

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

여기서 우리는 촬영 에 피질 미세 투하 세포 골격의 살아있는 세포 이미징을위한 프로토콜을 설명하고 물리적 인 힘의 변화에 대한 반응을 모니터링.

미생물의 미세 관 세포 골격및 아라비도시스 촬영 Apical 메리스템의 미세 기계적 조작의 라이브 세포 이미징

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

원자력 현미경 압입 프로토콜은 정상 또는 제한된 성장 (즉, 물 부족 상태) 동안 조직 또는 기관의 특정 세포의 세포벽의 물리적 특성의 역할을 해부 할 수있는 가능성을 제공합니다.

살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포의 물리적 특성을 연구하기 위한 원자력 현미경

세포벽 생체 역학에 대한 연구는 식물 성장과 형태 형성을 이해하는 데 필수적입니다. 다음 프로토콜은 원자력 현미경을 사용하여 젊은 식물 기관의 내부 조직에서 얇은 1 차 세포벽을 조사하기 위해 제안됩니다.

원자력 현미경을 사용한 살아있는 식물 장기의 일차 세포벽의 기계적 특성 특성 분석

이 프로토콜은 효과적인 지자기장(GMF)의 역전이 차등 유전자 발현을 유도하고 애기장대 탈리아나의 형태를 변경한다는 가설을 테스트하는 방법을 설명합니다. Helmholtz 코일 쌍의 3축 팔각형 시스템을 사용하여 식물 성장 챔버에서 역전된 GMF 조건을 인위적으로 생성했습니다.

자기장 (GMF)과 식물 진화 : GMF 반전의 효과에 대한 조사<em&gt; 애기 장대</em&gt; 개발 및 유전자 발현

유전자 전사의 미세 조정 규정은 배아 세포 운명 결정의 기초가. 여기서, 우리는 줄기 세포와 마우스 배아 심장 개발 모두 심장 분화의 후생 유전 학적 조절을 조사하기 위해 사용 염색질 면역 침전 분석법을 설명한다.

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

여기에는 높은 수치의 조리개 목적과 침지 매질로서의 퍼플 루오로 데칼린을 사용하여 최대 3 일 동안 뿌리 및 배축 발달의 고해상도 공 초점 저속 이미징을위한 간단한 기술이 제시됩니다.

뿌리와 배설물 개발의 장기 공 촛점 이미징을위한 단순한 챔버

배우세요 원자력 현미경 검사법을 사용하여 식물 세포 및 조직의 기계적 특성과 터거 압력을 측정하는 방법을. 비침습적 기법으로 생체 샘플에서 정확한 데이터를 획득할 수 있습니다.

식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

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