Name: Entrega de anticorpos para o cérebro murino via convecção-fornecimento aprimorado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprenda a técnica de entrega por convecção-fornecimento aprimorada para administração de anticorpos no cérebro murino. Este método permite contornar a barreira hematoencefálica com mínimo dano tecidual e refluxo.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Universidade de Zurique (FK-15-057), a Fundação Novartis para pesquisa médico-biológica (16C231) e pesquisa de câncer suíço (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) para Johannes vom Berg e ponte prova de conceito (20B1-1 _ 177300) para linda Schellhammer.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo escritório veterinário suíço cantonal o número de licença ZH246/15.
1. preparação dos cateteres de degrau
<ol><li>Preparação de uma tubagem de sílica fundida para a etapa do cateter
	<ol>
<li>Corte o capilar de sílica fundida com diâmetro interno de 0,1 mm e espessura de parede de tubos de 0, 325 mm a um comprimento de 30 mm.</li>
		<li>Examine a tubulação para rachaduras e lustrador do calor as extremidades usando um microforge para assegurar-se de que as aberturas da tubulação tenham uma superfície lisa.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixação do tubo interno em uma agulha de metal
	<ol>
<li>Monte uma agulha de 27 G numa seringa de 10 μL e coloque a seringa num robô estereotáxico.</li>
		<li>Usando o robô, mova a seringa sobre uma superfície dura e toque-a com a ponta da agulha. Esta posição deve ser anotada ou conservada no software porque servirá como uma superfície de referência para ajustar o comprimento da etapa do cateter.</li>
		<li>Elevar a agulha para permitir a colocação do capilar de sílica fundido dentro da agulha</li>
		<li>Coloque o capilar de sílica fundido na agulha, de forma a que 20 mm do capilar se saliente da agulha.</li>
		<li>Usando uma pipeta, espalhe uniformemente 2 μL de adesivo de cianoacrilato de alta viscosidade sobre o capilar, partindo da agulha metálica e terminando 10 mm acima da extremidade inferior do capilar, conforme representado na Figura 2.</li>
		<li>Usando o robô estereotáxica, abaixe a agulha até que a ponta da agulha metálica seja de 1 mm sobre a superfície de referência. Desta forma, o capilar de sílica fundida será fixado na agulha metálica e formarão uma etapa de 1 mm a partir da ponta da agulha metálica. Retire qualquer excesso de cola formando no final da agulha de metal para evitar embotamento a etapa.</li>
		<li>Aguarde 15 minutos para que a cola endureça e retire a seringa com o cateter do robô estereotáxico. Confirme que na etapa toda a colagem adicional estêve removida verific a ponta do cateter um microscópio.</li>
	</ol></li>
	<li>Testando o cateter da etapa usando um bloco do agarose
	<ol>
<li>Prepare 0,6% de solução de agarose em PBS em uma bandeja de gel convencional e aguarde até que ela polimerize. Corte o agarose em cerca de 20 mm x 20 mm blocos. Até o uso, manter os blocos imersos em PBS.</li>
		<li>Encha manualmente a seringa do cateter da etapa com 10 μL da solução de 0,4% do azul filtrado do Tripan.</li>
		<li>Utilizando o robô estereotáxico, dispense 1 μL a 0,2 μL/min para avaliar a vedação da etapa do cateter durante o procedimento de fixação. A solução de azul de trypan deve ser visível unicamente na ponta do cateter. Limpe-o com um lenço de papel.</li>
		<li>Coloc o bloco do agarose no robô stereotactic e calibre o robô assim que a ponta do cateter é referenciada de encontro à superfície do bloco do agarose.</li>
		<li>Programe os parâmetros de injeção para CED.<ol>
<li>Para o volume de injeção de 5 μL, utilize os seguintes passos: 1 μL a 0,2 μL/min, depois 2 μL a 0,5 μL/min e 2 μL a 0,8 μL/min. Ajuste o volume final da injeção de acordo com o plano experimental específico, alterando proporcionalmente a duração de cada uma das etapas.</li>
			<li>A fim injetar a solução no putamen caudado murino (striatum), realize tal injeção em uma posição frontal de 1 milímetro e 1.5 – 2 milímetros lateral de Bregma na profundidade de 3,5 milímetros.</li>
			<li>Após a injeção, deixe o cateter no lugar por 2 min e depois retraia a 1 mm/min para garantir a dispersão adequada do fluido no cérebro e vedação do trato de injeção durante a remoção do cateter. Nota: Dependendo do robô estereotáxico específico usado, todos os parâmetros podem ser programados em um único script. Um exemplo de script está disponível como <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59675/CED_5_ul_striatum.txt" target="_blank">material complementar.</a>.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inicie o procedimento CED e injete 5 μL de solução azul de Tripan no bloco de agarose.</li>
		<li>Avalie a forma da nuvem do azul do Tripan no agarose e no escapamento potencial ao longo do intervalo do cateter. O azul de trypan deve formar um elipsóide ou uma nuvem redonda com o centro ao redor da ponta do cateter e um diâmetro de pelo menos 1 mm. Nenhum refluxo principal sobre a ponta da agulha de metal deve ser visível.</li>
		<li>Coloque um novo bloco de agarose e inicie uma segunda injeção de 1 μL a 0,2 μL/min para avaliar o entupimento do cateter com o agarose. O azul de trypan deve novamente começar a formar uma nuvem a partir da ponta do cateter imediatamente após o início da injeção.</li>
		<li>Avalie se o volume remanescente na seringa corresponde a 3 μL. Quaisquer variações podem apontar para um vazamento de fluido através da montagem do cateter ou êmbolo da seringa.</li>
		<li>Se todas as injeções do teste forem bem sucedidas, o cateter está bem selado, reto e nenhuma solução azul do Tripan é observada de outros pontos do que a ponta do cateter, lava o cateter com H2o deionizada (DH2o) até que nenhum traço do azul do Tripan esteja visível e depois lave dez vezes da seguinte forma: 70% etanol e 100% etanol seguido de rubor novamente com 70% de etanol e água limpa deionizada.</li>
		<li>Guarde o cateter em condições secas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. convecção-Enhanced entrega de solução de anticorpos para o cérebro murino
Nota: Dependendo dos regulamentos locais de bem-estar animal, vários tipos de anestésicos, analgésicos e antibióticos podem ser implementados para este procedimento. Este protocolo descreve o uso da anestesia da injeção. Os anestésicos inalatórios, como o isoflurano, também podem ser utilizados através da montagem de uma máscara nasal na armação estereotáxica. Além disso, recomendamos a adição de antibióticos para a água potável para a profilaxia da infecção.
<ol><li>Instalação cirúrgica
	<ol>
<li>Prepare soluções anestésicos e antídoto. Os camundongos podem ser anestesiados com segurança por meio de anestesia de três componentes contendo fentanil (0, 5 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) e medetomidina (0,5 mg/kg) diluídos em dH estéril2O. Realizamos um procedimento de despertar em duas etapas usando duas soluções de antídoto, uma contendo flumazenil (0,5 mg/kg) e buprenorfina (0,1 mg/kg) em dH estéril2O (primeira solução de antídoto). O segundo contém atipamezol (2,5 mg/kg) em dH estéril2O (segunda solução de antídoto).</li>
		<li>Preparar a solução de analgesia contendo carprofeno (5,667 mg/kg) diluído com dH estéril2O.</li>
		<li>Limpe a armação estereotáxica, a almofada de aquecimento e os elementos do robô estereotáxico. Tenha em mente que nem todas as partes do robô podem ser limpas sem risco de danos. Consulte o manual do robô para obter detalhes sobre a limpeza e preparação para o uso.</li>
		<li>Monte a seringa com o cateter de degrau e lave-a várias vezes com dH2o, 70% etanol e 100% etanol seguido de rubor novamente com 70% de etanol e DH2o. Finalmente, lave a seringa com PBS ou outros buffers para ser usado para a preparação da solução para injeção intracraniana, por exemplo, líquido cefalorraquidiano artificial. O êmbolo da seringa deve mover-se suavemente e livremente durante todo o procedimento.</li>
		<li>Calibre o software estereotáxica do robô com a armação estereotáxica.</li>
		<li>Teste o software do robô estereotáxica assegurando que os braços do robô se movem livremente e que a bomba de injeção está conectada corretamente e pode executar o procedimento CED sem quaisquer distúrbios. Isto inclui o teste do movimento do robô, a injeção de rampa, verificando a etapa de espera de 2 min e a velocidade da retração do cateter. Todos os parâmetros devem caber o procedimento de CED pré-programado descrito no ponto 1.3.5.</li>
		<li>Insira a broca na broca. Recomenda-se esterilizar os bocados de broca antes de usar.</li>
		<li>Prepare a solução do anticorpo usando PBS ou outras soluções do amortecedor tais como aCSF. 1 a 20 μg de anticorpo em 5 μL podem ser injetados em um único procedimento de CED. Outros volumes e quantidades de proteínas devem ser testados antes da realização do experimento. Esteja ciente de que o uso de soluções de alta viscosidade pode levar ao entupimento do cateter.</li>
		<li>Carregue manualmente a seringa com o anticorpo diluído.</li>
	</ol></li>
	<li>Injeção de anticorpos por CED em estriado
	<ol>
<li>Pesar o rato e injetar a solução da anestesia do três-componente no peritônio de acordo com o peso de corpo. Anote o tempo de injeção. Transfira o mouse para uma gaiola separada aquecida com uma almofada de aquecimento.</li>
		<li>Observe o mouse para determinar quando a sedação começa. Assim que o mouse pára de se mover, aplique pomada oftálmicas sobre os olhos para proteger a córnea de secar durante a cirurgia. A sedação completa geralmente começa 10 – 15 min a partir da injeção da solução de anestesia de três componentes.</li>
		<li>Verifique as reações de dor usando o teste pitada-reflexo para garantir a anestesia completa do animal.</li>
		<li>Raspar a cabeça usando um aparador de cabelo.</li>
		<li>Desinfecte a pele com cotonetes embebidos em solução de iodo. Esfregue a pele três vezes em movimento circular.</li>
		<li>Usando um bisturi, faça uma incisão da pele de 10 milímetros ao longo do midline craniano que termina no nível de olho.</li>
		<li>Fixe o rato na armação estereotáxica utilizando a braçadeira nasal e as barras auriculares. Assegure-se de que a superfície do crânio esteja horizontal e firmemente fixada. Além da correta navegação anatômica, isso também é crucial para evitar a inclinação do crânio durante a perfuração e o procedimento CED.</li>
		<li>Coloque a seringa no robô estereotáxica.</li>
		<li>Sincronize o bit de broca com a ponta do cateter em um ponto de referência. É crucial que a relação entre a posição da broca e a seringa seja determinada precisamente no software, assim que a injeção pode ser executada na região anatômica desejada do cérebro.</li>
		<li>Retrair a pele usando fórceps e localize Bregma na superfície do crânio.</li>
		<li>Referência Bregma no software usando a ponta da broca.</li>
		<li>Mova a broca para uma posição frontal de 1 mm e 2 mm lateral de Bregma e perfure um furo de rebarba. Tenha cuidado para não danificar a dura-máter.</li>
		<li>Mova a seringa sobre o orifício de rebarba.</li>
		<li>Dispense 0,5 – 1 μL da seringa para garantir que não restam bolhas de ar no cateter.</li>
		<li>Inicie o programa CED descrito no ponto 1.3.5. Observe a superfície do crânio para quaisquer vestígios de refluxo fluido do ponto de injeção. Monitore a taxa de respiração do animal.</li>
		<li>Assim que o programa CED terminar e o cateter for retirado do cérebro, inicie a bomba de injecção a 0,2 μL/min para verificar o entupimento do cateter durante o CED. Se nenhum entupimento ocorreu, você deve ver imediatamente uma gota de mistura de injeção proveniente da ponta do cateter.</li>
		<li>Antes de reusar ou armazenar o cateter, examine visualmente a etapa do cateter para quaisquer sinais de dano ou desgaste um microscópio e limpe-o como na etapa 1.3.10.</li>
	</ol></li>
	<li>Acordando o procedimento
	<ol>
<li>Retire suavemente o rato da armação estereotáxica.</li>
		<li>Lave o local da cirurgia com solução salina estéril.</li>
		<li>Usando fórceps, encha o furo de rebarba com cera óssea.</li>
		<li>Feche a pele com fórceps de ponta fina e Aplique cola cirúrgica com uma pipeta de 10 μL sobre o corte. Aguarde 15 – 30 s para que a cola polimerize.</li>
		<li>Aplique a solução de analgesia por injeção subcutânea. Anote o tempo de injeção.</li>
		<li>Aplique a primeira solução de antídoto. Anote o tempo de injeção.</li>
		<li>Transfira o mouse para uma gaiola separada com uma almofada de aquecimento e monitore o animal para reflexos de startle.</li>
		<li>Se o rato não tiver ganhado a consciência cheia 15 minutos após a administração da primeira solução do antídoto, aplique a segunda solução do antídoto pela injeção subcutaneous.</li>
		<li>Monitore animais durante a fase de recuperação.</li>
		<li>Verifique 1 – 2 h mais tarde, bem como no dia seguinte para complicações pós-operatórias. Se necessário, aplique novamente a analgesia.</li>
		<li>Para a profilaxia da infecção, adicionar sulfadoxina (concentração final 0, 8% w/v) e trimetoprim (concentração final 0, 16% p/v) à água potável a que os animais têm acesso ad libitum por 1 semana após a cirurgia.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Boucher, Y., Salehi, H., Witwer, B., Harsh, G. R. t, Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+pressure+in+intracranial+tumours+in+patients+and+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid pressure in intracranial tumours in patients and in rodents.</a> British Journal of Cancer. 75 (6), 829-836 (1997).</li>
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<li>Vom Berg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+IL-12%2FIL-23+signaling+reduces+Alzheimer%27s+disease-like+pathology+and+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inhibition of IL-12/IL-23 signaling reduces Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline.</a> Nature Medicine. 18 (12), 1812-1819 (2012).</li>
<li>Vom Berg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+IL-12+combined+with+CTLA-4+blockade+elicits+T+cell-mediated+glioma+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intratumoral IL-12 combined with CTLA-4 blockade elicits T cell-mediated glioma rejection.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2803-2811 (2013).</li>
<li>Kurdi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+administration+of+the+mTORC1+inhibitor+everolimus+induces+tolerance+and+decreases+autophagy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Continuous administration of the mTORC1 inhibitor everolimus induces tolerance and decreases autophagy in mice.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (23), 3359-3371 (2016).</li>
</ol>

Johannes vom Berg é mencionado como um inventor na aplicação da patente (PCT/EP2012/070088) da Universidade de Zurique. Michal Beffinger, linda Schellhammer e Johannes vom Berg são mencionados como inventores em um pedido de patente (EP19166231) da Universidade de Zurique. Os autores não têm interesses financeiros adicionais.

A entrega aumentada convecção, ou a infusão pressão-negociada da droga no cérebro, foram propor primeiramente no adiantado 19903. Esta aproximação promete a perfusão de grandes volumes do cérebro atrás da barreira do cérebro do sangue em uma maneira controlada2. No entanto, até agora, apenas alguns ensaios clínicos têm sido realizados usando essa abordagem, parcialmente porque CED em uma configuração clínica mostrou ser tecnicamente exigente24,<...

A barreira hematoencefálica (BBB) forma uma borda semipermeável separando o sistema nervoso central (SNC) da circulação sanguínea. Alcançar o CNS com terapêutica é entretanto necessário no contexto de várias doenças, como tumores cerebrais, doença de Alzheimer (AD) ou doença de Parkinson (PD) entre outros1. Isto torna-se importante no desenvolvimento de novas terapias, especialmente se a droga testada exibe permeabilidade BBB pobre ou a sua exposição sistémica pode levar a toxicidade perigosa1,2. Alguns dos anticorpos clinicamente utilizados exibem ambas estas características. Uma solução para este problema seria a de entregar a terapêutica diretamente por trás do BBB.
A entrega reforçada por convecção (CED) é uma técnica neurocirúrgica que permite a perfusão efetiva de grandes volumes cerebrais. Isto é conseguido cirurgicamente instalando um ou mais cateteres na área alvo. Durante a aplicação da droga, um gradiente de pressão é formado na abertura do cateter, que se torna a força motriz da dispersão do infusato no tecido3,4. É, portanto, a duração da infusão e não os coeficientes de difusão que determinam a faixa de perfusão2,4,5. Isto fornece a entrega uniforme do infusato sobre um volume muito maior do cérebro comparado ao convencional, a difusão baseou métodos intracerebral da injeção2,6. Ao mesmo tempo, esta modalidade da entrega tem um risco mais baixo de dano de tecido2. Consequentemente, o CED pode permitir a administração segura e eficaz da quimioterapêutica convencional para o tratamento de tumores do CNS, assim como a entrega de agentes imunomoduladores ou de anticorpos agonístico e antagônicas em uma multidão de outras desordens do CNS2 ,7,8,9. CED é atualmente testado em terapias da doença de Parkinson, a doença de Alzheimer, bem como glioma de alto grau2,7,8,10,11.
O delineamento do cateter e o esquema de injeção estão entre os fatores mais importantes que influenciam o desfecho do CED 10,12,13,14,15,16. Além disso, requer propriedades físico-químicas específicas do infusato, incluindo tamanho moderado das partículas, carga aniônica e baixa afinidade tecidual 10,17. Cada um destes parâmetros tem que ser ajustado potencialmente de acordo com as características histológicas da região do cérebro a ser alvejada2,10,17.
Aqui nós descrevemos a metodologia para executar o CED de uma solução do anticorpo no putamen caudado (striatum) dos ratos. Além disso, o protocolo inclui a preparação de cateteres de degrau em uma instalação laboratorial, testando-os in vitro e realizando o CED.
Existem vários projetos de cateter disponíveis na literatura, diferindo pela forma da cânula, os materiais utilizados e o númerode aberturas de cateter12,15,18,19,20 ,21,22. Nós estamos usando um cateter da etapa feito de um capilar fundido do silicone que projeta 1 milímetro de uma agulha sem corte do metal da extremidade. Este projeto do cateter pode facilmente ser manufacturado em um laboratório de pesquisa e dá resultados bons de CED quando testado in vitro com blocos do agarose com parâmetros físicos que assemelham-se ao parênquima do cérebro in vivo23.
Além disso, nós implementamos um regime de rampa para a entrega de 5 μL de infusato in vivo. Em tal protocolo, a taxa de injeção é aumentada de 0,2 μL/min para um máximo de 0,8 μL/min, minimizando assim as chances de refluxo infusato ao longo do cateter, bem como o risco de dano tecidual16. Usando este protocolo, nós administramos com sucesso ratos com os até 20 μg do anticorpo em 5 μL de PBS sobre o curso de 11 minutos 30 s.
O protocolo pode ser prontamente ajustado para outros volumes de infusão ou para injetar várias outras substâncias, por exemplo, quimioterápicos, citocinas, partículas virais ou lipossomas2,10,14,18 ,22. Em caso do uso do infusato com propriedades físico-químicas drasticamente diferentes comparadas a uma solução salina tamponada fosfato (PBS) ou do líquido cerebrospinal artificial (ACSF) de anticorpos, as etapas adicionais da validação são recomendadas. Para o conjunto do cateter, a validação e o CED, nós descrevemos todas as etapas usando um robô stereotactic com uma unidade da broca e da injeção montada em um frame stereotactic regular. Este procedimento pode igualmente ser executado com um frame stereotactic manual conectado à bomba programável da microinfusão que pode conduzir as Microseringas de vidro descritas.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; Seringa L</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>27 G agulha de ponta romba</td><td>Hamilton</td><td>7762-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Janssen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera óssea</td><td>Braun</td><td>1029754</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Indivior Schweiz AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Pfizer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brocas de aço para odontologia tamanho ISO 009</td><td>Hager & Meisinger</td><td>1RF009</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td> <td>Reuss-Chemie AG</td><td>179-VL03K-/1</td><td></td></tr><tr><td>Fentanil</td><td>Helvepharm AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran, 2000 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>Flumazenil</td><td>Labatec Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Alta viscosidade cola de cianoacrilato</td><td>Migros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de iodo</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidina</td><td>Orion Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Roche Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Bausch + Lomb</td><td>Vitamina A Blache</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-rato IgG (H+L) policlonal de cabra acoplado a Alexa Fluor 647</td><td>Jackson Immuno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Braun</td><td>BB518</td><td></td></tr><tr><td>Diâmetro interno do tubo de sílica 0,1 mm, espessura da parede de 0,0325 mm</td><td>Postnova</td><td>Z-FSS-100165</td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico para camundongos</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>Robô estereotáxico</td><td>Neurostar</td><td>Broca e Robô</td><td></td>de Injeção</tr><tr><td>Succrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo de tecido tópico</td><td>Zoetis</td><td>GLUture</td><td></td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Bichsel</td><td>1000004</td><td></td></tr></tbody></table>

entrega de anticorpos para o cérebro murino via convecção-fornecimento aprimorado

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

A entrega reforçada por convecção (CED) é uma técnica neurocirúrgica que permite a perfusão efetiva de grandes volumes cerebrais usando um sistema de cateter. Tal aproximação fornece um método seguro da entrega que passa a barreira do cérebro de sangue (BBB), assim permitindo o tratamento com a terapêutica com o BBB-permeabilidade pobre ou aqueles para que a exposição sistemática não é desejada, por exemplo, devido à toxicidade. O CED exige a optimização do projeto do cateter, do protocolo da injeção, e das propriedades do infusate. Com este protocolo nós descrevemos como executar o CED de uma solução que contem até 20 μg de um anticorpo no putamen caudado dos ratos. Descreve a preparação de cateteres de degrau, testando-os in vitro e realizando o CED em camundongos usando um programa de injeção em rampa. O protocolo pode ser prontamente ajustado para outros volumes de infusão e pode ser usado para injetar vários traçadores ou substâncias farmacologicamente ativas ou inativas, incluindo quimioterápicos, citocinas, partículas virais e lipossomas.

Este protocolo possibilita a preparação de cateteres de degrau (Figura 1) para uso no procedimento de CED em ambiente laboratorial. A fim de controlar os cateteres para vazamento, refluxo ao longo do trato de agulhas e entupimento, recomendamos a realização de injeções de um corante, por exemplo, solução de Tripan azul, em um bloco de agarose. A Figura 3 retrata uma nuvem de azul de Tripan formando após a injeção de 1 μl em 0,5 μL/minuto usando um cateter CED (<...

A entrega reforçada por convecção (CED) é um método que permite a efetiva entrega da terapêutica no cérebro por perfusão direta de grandes volumes de tecido. O procedimento requer o uso de cateteres e um procedimento de injeção otimizado. Este protocolo descreve uma metodologia para CED de um anticorpo em um cérebro do rato.

Entrega de anticorpos para o cérebro murino via convecção-fornecimento aprimorado

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Este protocolo pode ser usado para realizar a entrega aprimorada de convecção em pequenos roedores usando um sistema de cateter de passo para a perfusão uniforme ajustável de regiões cerebrais alvo. A vantagem da entrega aprimorada da convecção é que permite a entrega de substâncias na região de interesse contornando a barreira hematoencefálica com pouco dano tecidual ou refluxo. Esta técnica é principalmente útil para a entrega de substâncias terapêuticas como anticorpos no cérebro.E, portanto, pode ser usado para atingir muitas condições neurológicas. Demonstrando o procedimento será Michal Beffinger, um pós-doutor do meu laboratório. Comece cortando um pedaço de tubulação capilar de sílica fundida com um diâmetro interno de 0,1 milímetro e uma espessura de parede de 0,325 milímetros a um comprimento de 30 milímetros.Depois de examinar a tubulação para rachaduras use um microforge para aquecer o polimento das extremidades para garantir que as aberturas de tubulação tenham uma superfície lisa. Em seguida, monte uma agulha de calibre 27 em uma seringa de 10 micro litros e coloque a seringa em um robô estereotático. Use o robô para mover a seringa sobre uma superfície dura e tocar a superfície com a ponta da agulha.Depois de notar esta posição elevar a agulha para permitir a colocação da capilar de sílica fundida dentro da agulha de tal forma que 20 milímetros dos salientes capilares da agulha. Use uma pipeta para espalhar uniformemente dois microliters de alta viscosidade cianoacrilato adesivo sobre o capilar a partir da agulha metálica e acabamento dez milímetros acima da extremidade inferior do capilar. Use o robô estereotático para baixar a agulha metálica até que a ponta da agulha esteja um milímetro acima da superfície de referência para fixar o capilar de sílica fundido na agulha metálica formando um passo de um milímetro da ponta da agulha metálica.Remova qualquer excesso de cola se formando na extremidade da agulha metálica para evitar o plantio da etapa do cateter. Verifique a ponta sob um microscópio para confirmar se todo o excesso de cola foi removido. Em seguida, espere 15 minutos para que a cola endureça e remova a seringa com o cateter do robô.Para o teste do cateter de passo, o corte solidificou 0,6% de gel de agarose em blocos de 20 por 20 milímetros e preenche manualmente a seringa do cateter de passo com 10 microliters de solução azul filtrada de 0,4%. Usando o robô estereotático, dispense um microliter de corante a 0,2 micro litros por minuto para avaliar a vedação da etapa do cateter durante o procedimento de fixação. A solução azul trypan deve ser visível apenas na ponta do cateter.Limpe o corante com um tecido de papel e coloque um bloco de agarose no robô estereotático. Calibrar o robô disse que a ponta do cateter é referenciada contra a superfície do bloco de agarose. Defina uma sequência de proporção de volumes de injeção de acordo com o plano experimental específico.Para injetar a solução no putamen murine caudate, ajuste a injeção em um milímetro frontal e um milímetro lateral a dois milímetros da posição bregma a uma profundidade de 3,5 milímetros. Quando a agulha estiver em posição inicie o procedimento de entrega aprimorada da convecção e injete cinco microliters de solução azul trypan no bloco de agarose. Avalie a forma da nuvem azul trypan na ágarose e para possíveis vazamentos ao longo do trato do cateter.Nenhum grande fluxo sobre a ponta da agulha metálica deve ser visível. Após a injeção deixe o cateter no lugar por dois minutos antes de retrair a agulha a um milímetro por minuto para garantir uma dispersão adequada do fluido no cérebro e vedação do trato de injeção durante a remoção. Coloque um novo bloco de agarose no robô e inicie uma segunda injeção de um microliter a 0,2 micro litros por minuto para avaliar o entupimento do cateter dentro da ágarose.O tripano azul deve formar novamente uma nuvem a partir da ponta do cateter imediatamente após o início da injeção. Em seguida, avalie se o volume restante na seringa corresponde a 3 microliters, pois qualquer variação pode indicar um vazamento de fluido através da montagem do cateter ou do êmbolo da seringa. Para a injeção de anticorpos no estriado murina confirme a falta de resposta ao beliscão da pele em um rato anestesiado e raspe a cabeça com um aparador de cabelo.Desinfete a pele com cotonetes de algodão encharcados em solução de iodo. Use um bisturi para fazer uma incisão de pele de 10 milímetros ao longo do acabamento da linha média craniana ao nível dos olhos. Fixar o mouse na estrutura estereotática usando o grampo do nariz e as barras de ouvido, tomando cuidado para que a superfície do crânio esteja horizontal e bem fixada.Coloque a seringa no robô estereotático e sincronize a broca com a ponta do cateter em um ponto de referência. Use fórceps para retrair a pele e localizar a bregma na superfície do crânio. Referência bregma no software usando a ponta da broca e mova a broca para um milímetro frontal e duas milímetros lateral da posição bregma.Faça um orifício de rebarba tomando cuidado para não danificar a dura-secar e mova a seringa sobre o orifício da rebarba. Dispense 0,5 a um microliter da seringa para garantir que não restem bolhas de ar no cateter. Inicie a convecção aprimorada da entrega como demonstrado, observando a superfície do crânio para quaisquer vestígios de fluxo de líquido do ponto de injeção.No final da entrega e remoção do cateter inicie a bomba de injeção a 0,2 micro litros por minuto para verificar se há evidências de entupimento do cateter durante a injeção. Se não ocorreu entupimento, deve-se observar imediatamente uma gota de mistura de injeção proveniente da ponta do cateter. Nesta imagem de uma nuvem de azul trypan formando após a injeção de um microliter de corante a 0,5 micro litros por minuto usando um cateter aprimorado de convecção como demonstrado, nenhum refluxo ao longo do trato da agulha foi visível durante o início da etapa do cateter.E a nuvem dispersa formou uma forma esférica desejada. Nesta imagem, no entanto, foi observado um refluxo significativo. Notavelmente, a entrega aprimorada de convecção permite a perfusão de grandes volumes no cérebro murino de forma uniforme e menos prejudicial ao tecido em comparação com a injeção convencional.Em ambos os tipos de entrega há um perfil típico de distribuição de partículas de anticorpos e dextran sobre o corpo caloso. No entanto, o perfil de dispersão do anticorpo injetado é mais difundido do que é observado para o dextran de alto peso molecular após a distribuição aprimorada da convecção, exemplificando diferenças na distribuição entre diferentes infundidos. Como o cateter pode potencialmente entupir durante a infusão cerebral, é importante verificar imediatamente depois, distribuindo lentamente um pequeno volume de infusão.Este procedimento pode servir como uma forma de fornecer compostos farmacologicamente ativos ao cérebro e deve ser seguido por um monitoramento próximo dos sintomas da doença e efeitos colaterais esperados. Essa técnica permite a infusão de uma região cerebral precisa com terapêutica, incluindo anticorpos, abrindo novas possibilidades para o desenvolvimento de terapias direcionadas ao sistema nervoso central.

delivery-antibodies-into-murine-brain-via-convection-enhanced

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Testes pré-clínicos completa de drogas que atuam no sistema nervoso central, muitas vezes envolve a avaliação e comparação de biodistribuição da droga em associação com rotas específicas de administração. Aqui, três métodos comumente utilizados de entrega sistêmica (intravenosa, intraperitoneal e oral), bem como um método para entrega local (convecção avançada entrega) são demonstrados em camundongos.

Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

Este artigo demonstra dois métodos muito diferentes de injecção: 1) para o cérebro (intracerebroventricular) e 2) sistêmica (intravenosa) para introduzir a agentes terapêuticos para o sistema nervoso central de camundongos recém-nascidos.

Entrega de agentes terapêuticos Através intracerebroventricular (ICV) e injecção intravenosa (IV) em ratos

O encapsulamento do medicamento aumenta a especificidade das células tumorais e reduz a neurotoxicidade.

Entrega aprimorada por convecção de lipossomas carregados revestidos de polietilenoglicol em um tumor cerebral de rato

Fonte: Zamboni, M., et al., Indução de modificação de células leptomeníngeas via injeção intracisternal. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o procedimento de administração de um medicamento indutor na cisterna magna de um camundongo anestesiado. A injeção induz seletivamente a expressão de marcadores fluorescentes em células da superfície cerebral acessíveis via líquido cefalorraquidiano, confirmado por imagens de fluorescência.

Entrega de medicamentos direcionados em um modelo de camundongo via injeção de cisterna magna

Este vídeo demonstra uma técnica de entrega aprimorada por convecção (CED) para entrega de anticorpos no cérebro de camundongos. O crânio de um camundongo anestesiado é exposto e um orifício de rebarba é criado na área-alvo para a entrega de anticorpos. Um cateter escalonado contendo anticorpos é inserido no local alvo e, por meio de uma bomba de infusão, um gradiente de pressão é criado para fornecer anticorpos a uma taxa controlada.

Entrega de anticorpos aprimorada por convecção em um cérebro de camundongo

Este vídeo demonstra um procedimento de entrega de anticorpos assistida por ultrassom em um modelo de camundongo. Microbolhas injetadas retroorbitalmente oscilam sob ultrassom, criando uma interrupção transitória na barreira hematoencefálica, permitindo que anticorpos marcados entrem no cérebro.

Uma administração de anticorpos assistida por ultrassom em um modelo de camundongo

Fonte: Leda, A. R., et al. Técnica de infusão de microcirurgia de camundongo para entrega de substância direcionada no SNC através da artéria carótida interna. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra um procedimento microcirúrgico projetado para facilitar a infusão direcionada de uma substância de teste no cérebro através da artéria carótida interna (ACI). O procedimento envolve sutura precisa e manipulação vascular para restringir temporariamente o fluxo sanguíneo, garantindo uma entrega...

Entrega de substâncias direcionadas ao cérebro do camundongo por meio de infusão na artéria carótida interna

Um modelo do rato de reconstrução endoscópica da base do crânio humano foi desenvolvido que cria uma interface semipermeável entre o cérebro eo nariz com enxertos mucosas nasais. Este método permite que os investigadores a estudar a libertação no sistema nervoso central de terapêutica de elevado peso molecular, que são de outro modo excluídos pela barreira sangue-cérebro, quando administrado sistemicamente.

Heterotópico mucosa enxertando Procedimento para entrega da droga direto para o cérebro em ratos

O presente protocolo descreve uma técnica de infusão de microcirurgia de camundongo, que efetivamente fornece substâncias diretamente no cérebro através da artéria carótida interna.

Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC via Artéria carótida interna

Aqui, nós apresentamos um protocolo usando um dispositivo de posicionamento do rato que permita a colocação apropriada dos ratos para a administração intranasal de uma formulação do peptide-siRNA do cérebro-alvejando permitindo o silenciamento de gene eficaz no sistema nervoso central.

Um dispositivo de posicionamento para a colocação de camundongos durante a entrega de siRNA intranasal ao sistema nervoso central

Apresentado aqui é um protocolo para abrir transitoriamente a barreira hematoencefálica (BBB) focalmente ou em todo o cérebro do rato para fornecer anticorpos fluorescentes e ativar microglia. Também é apresentado um método para detectar a entrega de anticorpos e ativação de microglia por histologia.

Entrega de anticorpos no cérebro usando ultrassom de varredura focalizado

Aprenda a técnica de entrega por convecção-fornecimento aprimorada para administração de anticorpos no cérebro murino. Este método permite contornar a barreira hematoencefálica com mínimo dano tecidual e refluxo.

Entrega de anticorpos para o cérebro murino via convecção-fornecimento aprimorado

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