Name: Uma plataforma Microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a usar um dispositivo microfluídico pneumático para estudar mecanobiologia em culturas 3D de condrócitos de placa de crescimento. Esta plataforma permite aplicação simultânea de múltiplas magnitudes de compressão em pequenos volumes amostrais.

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Agradecemos aos Drs. Christopher Moraes e Stephen A. Morin por seu suporte para design e fabricação de dispositivos. Este estudo foi apoiado pela bioengenharia para subsídio de saúde humana da Universidade de Nebraska-Lincoln (UNL) e da Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC), e Grant AR070242 da NIH/NIAMS. Agradecemos a Janice A. Taylor e James R. talaska, da central de microscopia avançada do centro médico da Universidade de Nebraska, por fornecer assistência com microscopia confocal.

Nota: Use equipamento de proteção individual (EPI) como luvas e jaleco para cada passo neste protocolo.
1. fabricação do molde mestre
Nota: execute a etapa 1,1-1,3 em uma capa das emanações.
<ol><li>Tratamento de vidro Nota: Use um escudo facial, luvas e um jaleco para o passo 1,1.<ol>
<li>Faça a solução da piranha (60 mL) misturando O ácido sulfúrico (H2assim4) e O peróxido de hidrogênio (h2O2) com uma relação do volume de 3:1. Cuidado: não use a solução de piranha e a acetona na mesma capa de fumaça devido ao risco de explosão.</li>
		<li>Coloque uma placa de vidro (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) em solução de piranha por 30 min a 40 ° c.</li>
		<li>Enxágüe a placa de vidro com água deionizada (diH2o).</li>
		<li>Coloque a placa de vidro em acetona à temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Enxague a placa de vidro com isopropanol e seque-a com gás nitrogênio (N2).</li>
		<li>Asse a placa de vidro a 200 ° c por 20 min em uma placa quente. Todas as etapas subseqüentes do cozimento usam uma placa quente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formação da camada de semente SU-8 na placa de vidro<ol>
<li>Espalhe SU-8 5 na placa de vidro com uma pipeta descartável para cobrir ao redor 2/3 da área de superfície da placa.</li>
		<li>Gire a placa de vidro com os fotororesists SU-8 5 em 500 RPM para 35 s (ciclo de giro inicial) e então 2.500 RPM para 40 s (ciclo de giro final) usando um Coater da rotação. Todas as etapas subsequentes do revestimento da rotação incluem o mesmo ciclo de giro inicial.</li>
		<li>Asse a placa de vidro revestida SU-8 5 a 65 ° c durante 2 min e, em seguida, a 95 ° c durante 5 min.</li>
		<li>Expor a placa de vidro revestida Su-8 5 à luz UV (60 mW/cm2, distância entre a lâmpada UV e o Fotomáscara é 20 cm, quantidade total de energia luminosa UV = 60 MJ/cm2) para 1 s. Nota: o tempo de exposição UV deve ser ajustado de acordo com o poder de uma luz UV usada.</li>
		<li>Asse a placa de vidro revestida SU-8 5 a 65 ° c durante 2 min e a 95 ° c durante 5 min.</li>
		<li>Coloque a placa de vidro cozido no desenvolvedor SU-8 por 2 min.</li>
		<li>Asse o vidro revestido SU-8 5 a 180 ° c durante 20 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fabricação de padrão de canal SU-8 usando fotolitografia (Figura 2a etapa 1-3)<ol>
<li>Despeje SU-8 100 na placa de vidro semeado SU-8 5 para cobrir cerca de 2/3 da área de superfície da placa.</li>
		<li>Gire a placa de vidro com SU-8 100 em 3.000 rpm para 38 s (≈ 90 μm de espessura).</li>
		<li>Asse a placa de vidro revestida SU-8 100 a 65 ° c durante 10 min e, em seguida, a 95 ° c durante 30 min. Se SU-8 100 é ainda pegajoso após este procedimento, asse a placa de vidro por um tempo mais longo em 95 ° c até que SU-8 100 se torne não-pegajoso.</li>
		<li>Coloque uma Fotomáscara de microcanal de alta resolução (25.400 dpi, ver Figura complementar 1) na placa de vidro revestida SU-8 100 e expor a placa de vidro coberta de Fotomáscara à luz UV por 4 s (quantidade total de energia de luz uv = 240 MJ/cm2). Nota: o tempo de exposição UV deve ser ajustado de acordo com o poder de uma luz UV usada.</li>
		<li>Retire a máscara fotográfica da placa de vidro e asse a placa de vidro a 65 ° c durante 2 min e, em seguida, 95 ° c durante 20 min.</li>
		<li>Mantenha a placa de vidro cozida em um recipiente, que seja envolvida com a folha de alumínio para obstruir toda a luz, para a cura durante a noite.</li>
		<li>Desenvolva padrões de canal SU-8 100 na placa de vidro no desenvolvedor SU-8 por 15 min.</li>
		<li>Lave a placa de vidro com padrão SU-8 (molde mestre) com álcool isopropílico e seque-a com gás N2 . Se as partículas brancas permanecerem durante este processo, repita o passo 7 por 5 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. unidade de acionamento pneumático
<ol><li>Camada de microcanais (camada 1) Nota: execute a etapa 2.1.1-2.1.2 em uma capa das emanações.<ol>
<li>Gota 200 μL de (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)- -1-Trichlorosilane em uma lamínula e coloc o em uma câmara de vácuo com o molde mestre.</li>
		<li>Aplique vácuo por 2 min na câmara e aguarde 6 h (ou durante a noite) para a silanização do molde.</li>
		<li>Misture PDMS com uma relação de peso de 10:1 (pré-polímero: agente de cura) por 5 min. Nota: toda a etapa subseqüente da carcaça de PDMS contem a mesma relação do peso do Prepolímero e do agente de cura (10:1).</li>
		<li>Despeje PDMS no molde mestre e Degas PDMS em uma câmara de vácuo por 30 min.</li>
		<li>Sanduíche PDMS com um pedaço de filme de transparência.</li>
		<li>Prenda o conjunto acima imprensado com uma placa de vidro, almofadas de espuma e placas de plexiglass (Figura 2a passo 4).</li>
		<li>Cure PDMS em forno a 80 ° c por 6 h.</li>
		<li>Isole a camada PDMS (camada 1) com o filme de transparência da estrutura imprensada (Figura 2a etapa 5).</li>
		<li>Ative as superfícies da camada 1 e uma placa de vidro limpa (placa de vidro 1; 50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) usando um limpador de plasma por 1 min. Nota: o tempo de limpeza do plasma pode variar com base na potência de um limpador de plasma usado.</li>
		<li>Bond Layer 1 na placa de vidro 1 e coloque-as no forno a 80 ° c durante 30 min.</li>
		<li>Remova o filme de transparência da camada 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Membrana fina de PDMS (camada 2)<ol>
<li>Spin Coat não curado PDMS em um filme de transparência em 1.000 rpm por 1 min para obter uma camada PDMS de 60 μm de espessura.</li>
		<li>Parcialmente cura spin revestido PDMS (camada 2) no forno a 80 ° c por 20-30 min.</li>
		<li>Ative a camada 1 na placa de vidro 1 e na camada 2 usando o limpador de plasma por 1 min. Nota: o tempo de limpeza do plasma pode variar com base na potência de um limpador de plasma usado.</li>
		<li>Bond a camada 2 na camada 1 e coloque-as no forno a 80 ° c durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloco da tubulação<ol>
<li>Coloc os tubos do metal verticalmente em um prato de Petri.</li>
		<li>Delicadamente despeje PDMS no prato para submergir cerca de 3/4 dos tubos de metal.</li>
		<li>Cure PDMS no forno a 60 ° c por 6 h (ou durante a noite).</li>
		<li>Corte um pedaço de bloco PDMS contendo um tubo de metal.</li>
		<li>Perfure um furo na camada 2 para a entrada.</li>
		<li>Ative o bloco PDMS e a camada 2 usando o limpador de plasma por 1 min.</li>
		<li>Fixe o bloco PDMS na parte de entrada da camada 2 e coloque toda a unidade de acionamento no forno a 80 ° c durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. alginato-condrócitos (ou talão) construções
<ol><li>Placa de vidro amino-silanized<ol>
<li>Corte uma placa de vidro (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) em duas placas de vidro de tamanho médio (50,8 mm × 38,1 mm × 1,2 mm) usando um scriber diamante.</li>
		<li>Coloque as placas de vidro em 0,2 M de cloreto de hidrogênio (HCl) e agitar suavemente (por exemplo, 55 rpm)-los durante a noite.</li>
		<li>Enxágüe as placas de vidro com diH2o.</li>
		<li>Agitar as placas de vidro em 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH) por 1 h a 55 rpm e enxágüe-os com diH2O.</li>
		<li>Agitar as placas de vidro em 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) para 1 h em 55 rpm e enxágüe-os com diH2O.</li>
		<li>Seque as placas de vidro amino-silanized em uma capa das emanações durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Molde do gel do agarose para construções do gel do alginato<ol>
<li>Misture 5% (w/v) agarose e cloreto de cálcio 200 mM (CaCl2) em DIH2O.</li>
		<li>Ferva a solução de gel de agarose com um forno de microondas (ou uma placa quente). O tempo de ebulição varia com base no volume da solução de gel de agarose e a potência do forno de microondas (ou a temperatura da chapa quente).</li>
		<li>Despeje a solução de gel de agarose cozido em um molde de alumínio (ver Figura complementar S2), e sanduíche-lo com uma placa de vidro.</li>
		<li>Aguarde 5 min e desenforme o gel de agarose solidificado do molde de alumínio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colheita da condrócitos da placa do crescimento<ol>
<li>Isole placas do crescimento dos membros traseiros de ratos neonatais.</li>
		<li>Coloque as placas de crescimento em 1 mL de 0,25% de colagenase por 3 h em uma incubadora a 37 ° c e 8% de dióxido de carbono (CO2), para remover a matriz extracelular (ECM).</li>
		<li>Centrifugue a amostra digerida por 5 min em 125 x g para fazer uma pelota do condrócitos e remova o sobrenadante da amostra. Aqui, 1 x g é a aceleração da gravidade.</li>
		<li>Ressuscitar a pelota do condrócitos em 1 ml de Dulbecco ' s modificou o meio da águia (DMEM).</li>
		<li>Conte o número de condrócitos no DMEM usando um contador de células.</li>
		<li>Centrifugue os condrócitos em DMEM durante 5 min a 125 x g para fazer uma pastilha de condrócitos novamente e remova o sobrenadante da amostra.</li>
		<li>Opcionalmente, ressuscitar a pelota do condrócitos nos meios de cultura do condrócitos (CCM)34 que contêm a calceína am de 2 μm, e incubar a amostra em 37 ° c por 30 minutos. Repita o passo 3.3.6 e mova para a etapa 3.3.8.</li>
		<li>Resuspend a pelota do condrócitos em um volume desejado de CCM e mantê-los na incubadora em 37 ° c e em 8% co2 antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construções de alginato-condrócitos (ou talão) (Figura 2C)<ol>
<li>Misture 1,5% (w/v) alginato em solução salina tampão fosfato (PBS) com 5 mg/mL de sulfo-NHS, 10 mg/mL de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) cloridrato de carbodiimida (EDC).</li>
		<li>Adicione 8 x 106 condrócitos no 1 ml de solução de gel de alginato [ou adicione 3 μL de grânulos fluorescentes de 1 μm de diâmetro (542/612 nm) em 1 ml de solução de gel de alginato (0,3% (v/v))].</li>
		<li>Colocar 150 μL da solução de alginato-condrócitos (ou talão) na placa de vidro amino-silanized fabricada no passo 3,1.</li>
		<li>Cubra a solução de gel de alginato com o molde de gel de agarose por 3 min.</li>
		<li>Remova a solução excessiva do gel do alginato que transborda do molde do gel do agarose com uma lâmina de lâmina e remova o molde do gel do agarose. Então, as construções cilíndricas do alginato-chondrocyte (ou grânulo) são obtidas na placa de vidro amino-silanized.</li>
		<li>Coloc os constructos do alginato-chondrocyte na solução cross-linking (50 de milímetro CaCl2 /140 milímetro NaCl em DIH2O) por 1 minuto para uma polimerização mais adicional.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. montagem do dispositivo (Figura 2D)
Nota: os espaçadores PDMS e os grampos impressos em 3D precisam ser preparados separadamente.
<ol><li>Localize quatro espaçadores PDMS de 1 mm de espessura nos quatro cantos da camada 2 da unidade de acionamento.</li>
	<li>Coloque 700 μL de CCM para cobrir as câmaras de ar da camada 2.</li>
	<li>Coloque as construções de alginato-condrócitos (ou talão) na camada 2 enquanto alinha cuidadosamente as construções com as câmaras de ar.</li>
	<li>Fixe o dispositivo com grampos impressos em 3D (Figura 1C).</li>
</ol>5. accionamento do dispositivo
<ol><li>Conecte a tomada de uma bomba de ar (veja a tabela de materiais) com a entrada de uma válvula de solenóide com uma tubulação do silicone.</li>
	<li>Conecte a tomada da válvula de solenóide com a entrada do dispositivo montado com uma tubulação do silicone.</li>
	<li>Ligue a válvula solenóide com um gerador de função.</li>
	<li>Manipule a válvula solenóide com uma onda quadrada (por exemplo, 1 Hz) gerada pelo gerador de função.</li>
	<li>Ligue a bomba de ar para accionar o dispositivo pneumaticamente.</li>
</ol>6. imagem latente dos condrócitos no dispositivo
Nota: para obter uma boa qualidade de imagem, condrócitos de imagem (ou grânulos fluorescentes) em gel de alginato através de placa de vidro 2 porque expandido balões PDMS e câmaras de ar pode distorcer imagens ópticas. Se um microscópio invertido é usado para a imagem latente, o dispositivo precisa de ser instalação de modo que a placa de vidro 2 enfrenta para baixo.
<ol><li>Prepare o dispositivo com condrócitos (ou grânulos fluorescentes) como mostrado nas secções anteriores.</li>
	<li>Tome imagens z-Stack de condrócitos (ou grânulos fluorescentes) com um microscópio confocal antes e compressão, respectivamente. Escolha um tamanho z-Step com base na profundidade de campo de um sistema de imagem confocal usado.</li>
	<li>A altura dos condrócitos (ou uma construção de alginato-talão) pode ser medida com o método de processamento automático de imagem mostrado em literaturas anteriores26,35.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Para testar os efeitos do estresse compressivo nos condrócitos da placa de crescimento, desenvolvemos o dispositivo de compressão microfluídico do condrócito (Figura 1) para aplicar vários níveis de estresse compressivo aos condrócitos no andaime de hidrogel de alginato para 3D cultura em formas de alta taxa de transferência. Para ajudar outros pesquisadores a adotar nosso dispositivo ou desenvolver dispositivos semelhantes, fornecemos detalhes das etapas de fabricação do dispositivo neste a...

As plataformas micro-projetadas são ferramentas valiosas para estudar a biologia molecular, celular, e do nível de tecido porque permitem o controle dinâmico dos microambientes físicose químicos1,2,3 ,4,5,6,7,8. Assim, as hipóteses múltiplas podem simultaneamente ser testadas em uma maneira firmemente controlada. No caso da cartilagem da placa de crescimento, há evidências crescentes de um importante papel do estresse compressivo na modulação do crescimento ósseo através da ação sobre a cartilagem da placa de crescimento9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. No entanto, o mecanismo de ação do estresse compressivo – em particular, como o estresse orienta a formação de colunas de condrócitos na placa de crescimento – é pouco compreendido.
O objetivo deste protocolo é criar um dispositivo de compressão de condrócitos microfluídico de acionamento pneumaticamente26 para elucidar mecanismos de mecanobiologia em condrócitos de placa de crescimento (Figura 1a-c). O dispositivo consiste em duas porções: a unidade pneumática da atuação e a construção do gel do alginato. A unidade de acionamento pneumático microfluídico é fabricada com polidimetilsiloxano (PDMS) com base na foto e na Soft-litografia. Esta unidade contem uma disposição 5 x 5 de balões finos da membrana de PDMS que podem ser inflados diferentemente baseados em seus diâmetros. A construção do gel do alginato consiste nos condrócitos encaixados em uma disposição 5 x 5 de cilindros do gel do alginato, e os constructos inteiros do alginato-chondrocyte são montados com a unidade da atuação. As construções de gel de alginato são compactadas pelos balões PDMS inflacionados pneumaticamente (Figura 1b). O dispositivo microfluídico pode gerar cinco níveis diferentes de estresse compressivo simultaneamente em uma única plataforma baseada em diferenças no diâmetro do balão PDMS. Assim, um teste da elevado-taxa de transferência do mechanobiology do condrócitos circunstâncias múltiplas da compressão é possível.
O dispositivo microfluídico descrito neste protocolo tem muitas vantagens sobre o dispositivo de compressão convencional, tais como fixadores externos14,21,23 e dispositivos de compressão macroscópica16, 19 anos de , 27 anos de , 28 para estudar a mecanobiologia do condrócitos: 1) o dispositivo microfluídicos é cost-effective porque consome o volume menor das amostras do que o dispositivo macroscópico da compressão, 2) o dispositivo microfluídicos é tempo eficaz porque pode testar o múltiplo condições de compressão simultaneamente, 3) o dispositivo microfluídico pode combinar estímulos mecânicos e químicos, formando um gradiente de concentração de produtos químicos com base na mistura limitada em microcanais, e 4) várias técnicas de microscopia (lapso de tempo microscopia e microscopia confocal da fluorescência) podem ser aplicados com o dispositivo microfluídicos feito de PDMS transparente.
Adotou-se e modificou o método de Moraes et al.7,29 para criar diferentes níveis de estresse compressivo em um único dispositivo para possibilitar estudos de mecanobiologia de alta produtividade de compressão de condrócitos. Nossa aproximação é apropriada para pilhas (por exemplo, chondrocytes) que precisam o ambiente tridimensional (3D) da cultura e para ensaios biológicos após ter comprimindo pilhas. Embora alguns dispositivos de compressão celular microfluídico possam comprimir células cultivadas em substratos bidimensionais (2D)30,31,32, eles não podem ser usados para condrócitos porque os condrócitos cultivados em 2D desdiferenciam-se. Existem plataformas microfluídico para comprimir células 3D cultivadas em hidrogéis fotopolimerizados7,33, mas eles são limitados em isolar as células após experimentos de compressão porque isolar as células de fotopolimerizadas hidrogel não é fácil. Adicionalmente, os efeitos da exposição ultravioleta (UV) e dos iniciadores de reticulação da foto nas pilhas podem precisar de ser avaliados. Em contraste, nosso método permite o isolamento rápido de células após experimentos de compressão para ensaios pós-biológicos, pois os hidrogéis de alginato podem ser despolimerizados rapidamente por quelantes de cálcio. Os métodos detalhados da fabricação e da caracterização do dispositivo são descritos neste protocolo. Um breve procedimento para fabricar o dispositivo de compressão microfluídico de condrócitos é mostrado na Figura 2.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropil) trietoxissilano (ATPES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>741442-100ML</td><td></td></tr> <tr><td>(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahidrooctil) -1-triclorosilano</td><td>United Chemical Technologies</td><td>T2492-KG</td><td></td></tr><tr><td>Folha de ar</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K354</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de ar</td><td>Schwarzer Precision</td><td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td><td>Utilizamos o modelo adquirido em 2015. O design interno e o desempenho da bomba de ar (SP 500 EC-LC) mudaram no início de 2016. Além disso, o desempenho da bomba de ar mudou com o passar do tempo. Assim, a pressão do ar gerada por uma bomba de ar SP 500 EC-LC deve ser calibrada antes do uso.</td></tr><tr><td>Pó de alginato</td><td>FMC Corporation</td><td>Pronova UP MVG</td><td></td></tr><tr><td>Barb Conectores retos (tubo de metal)</td><td>Pneumadyne</td><td>EB40-250</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Partículas fluorescentes aquosas tingidas de vermelho</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0100</td><td></td></tr><tr><td>EDC (cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de espuma</td><td>GRAINGER</td><td>Item # 5GCE8</td><td></td></tr><tr><td>Função / Gerador de Forma de Onda Arbitrária</td><td>Keysight Technologies</td><td>33210A</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Fisher BioReagentes</td><td>BP2633500</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>BDH1174-4LP</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-267-013</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>Keysight Technologies</td><td>E3630A</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Coletor solenóide</td><td>Pneumadyne</td><td>MSV10-1</td><td></td></tr><tr><td>Válvula solenóide</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-30-12-3</td><td></td></tr><tr><td>Revestidor giratório</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650Mz-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>SU8 Desenvolvedor</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>SU8-100</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y131273 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8-5</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y131252 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>EMD Millipore</td><td>MSX12445</td><td></td></tr></tbody></table>

uma plataforma microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Estímulos mecânicos são conhecidos por modulam funções biológicas de células e tecidos. Estudos recentes sugerem que o estresse compressivo altera a arquitetura da cartilagem da placa de crescimento e resulta na modulação do crescimento de ossos longos de crianças. Para determinar o papel do stress compressivo no crescimento ósseo, criamos um dispositivo microfluídico acionado por pressão pneumática, para dinamicamente (ou estaticamente) comprimir condrócitos de placa de crescimento embutidos em cilindros de hidrogel de alginato. Neste artigo, descrevemos métodos detalhados para fabricar e caracterizar este dispositivo. As vantagens de nosso protocolo são: 1) cinco magnitudes diferentes do esforço compressivo podem ser gerados em cinco repetições técnicas em uma única plataforma, 2) é fácil visualizar a morfologia da pilha através de um microscópio de luz convencional, 3) as pilhas podem ràpida ser isoladas a partir do dispositivo após a compressão para facilitar os ensaios a jusante, e 4) a plataforma pode ser aplicada para estudar mecanobiologia de qualquer tipo de célula que pode crescer em hidrogéis.

Este artigo mostra etapas detalhadas da fabricação do dispositivo de compressão de condrócitos microfluídico (Figura 2). O dispositivo contém uma matriz de 5 x 5 de construções cilíndricas de alginato-condrócito, e essas construções podem ser compactadas com cinco magnitudes diferentes de compressão (Figura 1, figura 3 e Figura 4). A altura do Microchannel pneumático é ao redor 90 μm, e os diâmetros do ...

Este artigo fornece métodos detalhados para fabricar e caracterizar um dispositivo microfluídicos de actuação pneumaticamente para a compressão do condrócitos.

Uma plataforma Microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Este dispositivo de compressão microfluida ativado pneumaticamente pode ser usado para estudar a mecanobiologia em culturas de hidrogel 3D de condrócitos de placas de crescimento. O dispositivo microfluido é econômico e demorado porque pode simultaneamente gerar múltiplas magnitudes de uma compressão em pequenos volumes de amostras, e várias imagens microscópicas podem ser aplicadas com o dispositivo. Nosso método também pode ser aplicado ao estudo da mecanobiologia de outros tipos de células.Para configurar a camada microcanal, misture primeiro o PDMS com uma razão de peso de 10 prepolímeros para um agente de cura por cinco minutos. Em seguida, coloque o molde em uma almofada de espuma e despeje a mistura no molde mestre. Degas o PDMS em uma câmara de vácuo por 30 minutos e sanduíche o PDMS desgaseado com um pedaço de filme de transparência.Aperte o conjunto sanduíche com a placa de vidro, almofadas de espuma e placas de plexiglass. Cure o PDMS a 80 graus Celsius por seis horas e isole a camada PDMS e o filme de transparência da estrutura sanduíche. Ative as superfícies do PDMS e uma placa de vidro limpa com o limpador de plasma por um minuto antes de ligar o PDMS à placa de vidro no forno Celsius de 80 graus por 30 minutos.Em seguida, remova o filme de transparência. Para a preparação da fina membrana PDMS, gire o PDMS sem correção em uma película de transparência a 1.000 rotações por minuto durante um minuto para obter uma camada PDMS de 60 micrômetros de espessura. Cure parcialmente o PDMS revestido de spin a 80 graus Celsius por 20 a 30 minutos antes de usar o limpador de plasma para ativar a camada PDMS microcanal na placa de vidro e na fina camada PDMS por um minuto.Em seguida, conecte a fina camada de membrana PDMS à camada PDMS microcanal e coloque as camadas no forno Celsius de 80 graus durante a noite. Para a preparação do bloco de tubulação, coloque os tubos metálicos verticalmente em uma placa de petri e despeje suavemente PDMS nãocurados na placa até que cerca de 3/4 dos tubos estejam submersos. Depois de desgasear o PDMS em uma câmara de vácuo por 30 minutos, cure o PDMS no forno a 60 graus Celsius por mais de seis horas.No final do processo de cura, corte um pedaço de bloco PDMS contendo um tubo e faça um furo na fina camada PDMS para a entrada. Ative o bloco PDMS e a fina camada PDMS com o limpador de plasma. Após um minuto, conecte o bloco PDMS ao orifício de entrada da fina camada PDMS e coloque toda a unidade de atuação no forno a 80 graus Celsius durante a noite.Para a preparação do molde de gel de agarose, misture 5% de agarose e 200 cloreto de cálcio mililitro em água deionizada e aqueça a solução de gel de agarose até ferver. Despeje a solução de gel de agarose cozida em um molde de alumínio e sanduiche o molde com a placa de vidro. Após cinco minutos, remova o gel de agarose solidificado do molde de alumínio.Placa 150 microliters de solução de alginato-condrocyte na placa de vidro aminosilanizada e cubra a solução com molde de gel agarose por três minutos. No final da incubação, use uma lâmina de barbear para remover a solução excessiva de gel alginato e remover o molde de gel de agarose da placa. Em seguida, coloque as construções de alginato-condrocito em solução transversal contendo 50 mililitros de cálcio e 140 milimilas de cloreto de sódio em água desionizada por um minuto.Para montar o dispositivo, localize quatro espaçadores PDMS de um milímetro de espessura nos quatro cantos da fina camada PDMS da unidade de atuação. Cubra as câmaras de ar da fina camada PDMS com 700 microliters de meio de cultura condrócito. Utilizando um microsope estéreo, coloque o construto alginato-condrocito sobre a fina camada PDMS, tomando o cuidado de alinhar os construtos com as câmaras de ar e fixar o dispositivo com grampos impressos em 3D.Para atuação do dispositivo, use um pedaço de tubo de silício para conectar a saída de uma bomba de ar com a entrada de uma válvula solenoide. Use um pedaço adicional de tubulação para conectar a saída da válvula solenoide com a entrada do dispositivo montado. Conecte a válvula solenoide com um gerador de função e use uma onda quadrada de hertz gerada pelo gerador de função para manipular a válvula solenoide.Em seguida, ligue a bomba de ar para acionar o dispositivo pneumaticamente. O dispositivo de compressão de condrocitos microfluidos contém cinco por cinco matrizes de construtos cilíndricos alginato-condrócito e esses construtos podem ser comprimidos com cinco magnitudes diferentes de compressão. Neste exemplo, a coluna de gel foi comprimida por 33,8% de altura pelo maior balão PDMS e a cepa compressiva resultante dos construtos de gel aumentou aproximadamente 5% por incremento de 0,2 milímetros e o diâmetro do balão PDMS.A deformação compressiva dos condrócitos foi determinada por imagem das células em um volume de 613 por 613 por 40 a 55 micrômetros perto do centro de construção de gel. Aqui é mostrada uma imagem de um condrócito que foi comprimido por 16% pelo maior balão PDMS. Neste gráfico, pode-se observar a distribuição dos valores da cepa de compressão celular medida.Nesta análise, as células foram compactadas mais globalmente por balões PDMS maiores. Juntos, esses dados sugerem que as quantidades de gel alginato e compressão de condrocitos são controladas pelo diâmetro dos balões PDMS sob uma pressão constante de 14 quilopascals. Para garantir a repetibilidade do desempenho do dispositivo, é crucial criar uma membrana PDMS fina com espessura e elasticidade constantes.Após esse procedimento, podem ser realizados diversos ensaios biológicos, como a imunofluorescência e a hibridização in situ. Utilizando essa técnica, muitas perguntas sobre mecanotransdução em placa de crescimento ou condrócitos articular podem ser respondidas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de uma matriz microactuator de posts verticalmente deslocadas em que a tecnologia é baseada, e como essa tecnologia base pode ser modificado para conduzir alto rendimento de cultura de células mecanicamente dinâmica em ambos cultura bidimensional e tridimensional paradigmas.

Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

Um sistema 3D de condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial é descrita. Líquido sinovial reflete o microambiente mais natural para a cartilagem articular, e pode ser facilmente obtido e armazenado. Esse sistema, portanto, pode ser usado para estudar a regeneração da cartilagem e para terapêutica de triagem para tratamento da artrite.

Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial

A biossíntese da matriz extracelular cartilaginosa por condrócitos podem ser afectadas pela aplicação de estímulos mecânicos. Este método descreve a técnica de aplicação de dinâmicas tensões compressivas para condrócitos encapsulados em construções em 3D e de avaliação de alterações induzidas no metabolismo dos condrócitos.

A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis

Nós projetamos um novo biorreator carga mecânica que pode aplicar uniaxial ou biaxial de tensão mecânica para um biocomposite cartilagem antes do transplante em um defeito da cartilagem articular.

Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

O reparo da cartilagem representa um desafio médico não atendido e as abordagens baseadas em células para projetar a cartilagem articular humana são uma solução promissora. Aqui, descrevemos os hidrogéis biomiméticos tridimensionais (3D) como uma ferramenta ideal para a expansão e maturação de condrócitos articulares humanos.

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Apresentamos um método para avaliar a extensão espacial da lesão/morte celular na superfície articular das articulações murino intactas após a aplicação de cargas mecânicas controladas ou impactos. Esse método pode ser usado para investigar como osteoartrite, fatores genéticos e/ou regimes de carregamento diferentes afetam a vulnerabilidade dos condrócitos em situ .

Visualização em tempo real e análise do condrócito prejuízo devido ao carregamento mecânico em explantes de cartilagem murino totalmente intacta

Aqui, apresentamos protocolos para analisar a remodelagem óssea dentro de uma plataforma lab-on-a-chip. Um dispositivo de carregamento mecânico impresso em 3D pode ser emparelhado com a plataforma para induzir a mechanostransdução de osteócitos, deformando a matriz celular. A plataforma também pode ser usada para quantificar os resultados funcionais de remodelação óssea de osteoclastos e osteoblastos (reabsorção/formação).

Uma plataforma lab-on-a-chip para estimular a mecanotransdução de osteócitos e analisar resultados funcionais da remodelagem óssea

Fornecemos métodos detalhados para gerar quatro tipos de tecidos a partir de células-tronco mesenquimais humanas, que são usadas para recapitular a cartilagem, osso, coxim gorduroso e sinóvia na articulação do joelho humano. Esses quatro tecidos são integrados em um biorreator personalizado e conectados através de microfluídica, gerando assim uma articulação do joelho em um chip.

Criação de uma articulação do joelho em um chip para modelagem de doenças articulares e testes de medicamentos

Este estudo descreve um método para produzir esferoides condrocíticos agregando células em esferoides sob condições de baixa adesão usando gravidade, seguido de cultura dos esferoides resultantes em mini-biorreatores.

Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros

Aprenda a usar um dispositivo microfluídico pneumático para estudar mecanobiologia em culturas 3D de condrócitos de placa de crescimento. Esta plataforma permite aplicação simultânea de múltiplas magnitudes de compressão em pequenos volumes amostrais.

Uma plataforma Microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica

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