Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

Este protocolo é particularmente relevante porque permite a detecção e seleção de células únicas a partir de um pool de células mistas para análise posterior a jusante em uma única resolução celular. A principal vantagem dessa técnica é o potencial de separar células tumorais individuais circulantes, ou CTCs, de células sanguíneas para uma gama de análises que requerem alta pureza. Comece iniciando o software de micromanipulador e ligando o micromanipulador.

Conecte o micromanipulador ao computador e clique em Conectar e Inicializar dispositivo para inicializar o braço robótico no estágio do microscópio. Limpe as superfícies externas e internas do gabinete de proteção com etanol e feche o gabinete de proteção após cada manipulação da máquina para poder manobrar o dispositivo através do computador. Instale um novo capilar de vidro de 20 a 30 micrômetros no braço robótico e lave o óleo do sistema através do sistema para remover quaisquer bolhas na tubulação.

Encha o tanque de esterilização um com 70% de etanol, tanque de esterilização dois com água sem nuclease estéril e o tanque tampão com PBS estéril de Dulbecco. Esterilize o capilar duas vezes com 70% de etanol e substitua o tanque de esterilização um por tanque de esterilização dois para usar a função de esterilização para lavar o capilar em água pelo menos três vezes. No software micromanipulador, inicie um novo experimento e selecione o tipo de experimento de escolha nos modos automático e manual de seleção.

Configure a bandeja do convés para especificar as posições do tanque de esterilização, tanque tampão e bandeja de depósito, e defina a temperatura dos tanques líquidos na bandeja de depósito selecionada para quatro graus Celsius. Posicione uma placa de fixação ultra-baixa contendo a solução CTC liberada sob o microscópio dentro do gabinete do micromanipulador. Retire a tampa da placa e feche o armário.

Centrifugar uma placa de 384 poços contendo 20 microliters de meio de cultura CTC por poço para garantir que o meio seja sequestrado na parte inferior de cada poço e coloque a placa na posição alvo de uma bandeja de depósito selecionada de quatro graus Celsius. Selecione manualmente o objetivo do microscópio para a colheita e o tempo de exposição de todos os canais necessários. Selecione Mostrar Bem Navegador para visualizar e selecionar o tipo de placa de captação.

Em seguida, calibrar uma posição de captação no meio do poço contendo a solução CTC sem células no centro do campo de visão. Use o sensor para tocar suavemente a parte inferior da placa com um capilar e definir a posição da picape para 0,05 milímetros acima da parte inferior da placa. Abaixe cuidadosamente o braço robótico em 10 micrômetros por vez para evitar danificar o capilar.

Selecione o tipo de célula e os parâmetros de escolha. Para a escolha de células simples, selecione o modo manual. Use o joystick para navegar pelo capilar de vidro dentro do poço e coloque o capilar em cima de uma única célula de interesse a pelo menos um milímetro da borda do poço.

Em seguida, adicione manualmente partículas e selecione Escolher Partículas Ativadas para iniciar a colheita. Quando todas as células tiverem sido colhidas, centrifufique a placa para sedimentar as células na parte inferior de cada poço. A coloração bio-amino com anticorpos de molécula de adesão de células anti-epiteliais permite a visualização de células cancerígenas na suspensão com uma distinção precisa dos eventos positivos do CD45.

O isolamento preciso da CTC é caracterizado pela aspiração apenas do alvo desejado sem as células contaminantes circundantes. Como suspeita, os clusters CTC demonstram um aumento da sobrevida em comparação com os CTCs únicos, dando origem a colônias celulares dentro de 56 dias da cultura in vitro. Notavelmente, os clusters CTC também apresentam maior taxa de proliferação e, portanto, atingem maior número de células finais, indicando que o contato direto com outras células tumorais tem impacto tanto na viabilidade quanto na taxa de proliferação das células tumorais.

O sequenciamento de RNA unicelular de CTCs diretamente isolados de pacientes com câncer de mama revela uma inserção estocástica distribuída por T de células únicas derivadas de CTCs únicos, aglomerados de CTC ou aglomerados de glóbulos brancos CTC. Lembre-se de instalar o capilar de vidro para remover bolhas de ar dentro do sistema fluido do micromanipulador e calibrar a posição de captação para garantir uma colheita unicelular eficiente. As células únicas podem ser semeadas ou processadas para sequenciamento de próxima geração para permitir a análise ex-vivo e a caracterização ctc em uma resolução unicelular para investigar o processo metastático.