Name: Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Aprenda a isolar células tumorais circulantes com micromanipulação robótica para análise molecular e avaliação do potencial metastático em câncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a todos os pacientes que doaram sangue para o nosso estudo, assim como todos os clínicos envolvidos e enfermeiros de estudo. Agradecemos Jens Eberhardt, Uwe Birke, e Dr. Katharina Uhlig da ALS Automated Lab Solutions GmbH para suporte contínuo. Agradecemos a todos os membros do laboratório aceto por feedback e discussões. A investigação no laboratório aceto é apoiada pelo Conselho Europeu de investigação, pela União Europeia, pela Swiss National Science Foundation, pela Swiss Cancer League, pela Basel Cancer League, pelos dois cantons de Basileia através da ETH Zürich e pela Universidade de Basileia.

<ol><li>Talmadge, J. E., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AACR+centennial+series%3A+the+biology+of+cancer+metastasis%3A+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective.</a> Cancer Research. 70 (14), 5649-5669 (2010).</li>
<li>Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Biological+Principles+of+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Emerging Biological Principles of Metastasis.</a> Cell. 168 (4), 670-691 (2017).</li>
<li>Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((En+Route+to+Metastasis%3A+Circulating+Tumor+Cell+Clusters+and+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).</li>
<li>Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+clusters%3A+What+we+know+and+what+we+expect+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review).</a> International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Pantel, K., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The biology of circulating tumor cells.</a> Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).</li>
<li>Hou, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+molecular+characteristics+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+microemboli+in+patients+with+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).</li>
<li>Long, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+TRF2%2C+SOX10%2C+and+CD10+in+circulating+tumor+microemboli+detected+in+metastatic+melanoma+patients.+A+potential+impact+for+the+assessment+of+disease+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness.</a> Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinally+collected+CTCs+and+CTC-clusters+and+clinical+outcomes+of+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).</li>
<li>Mu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+assessment+of+the+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+and+their+clusters+in+patients+with+advanced-stage+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+microemboli+%28CTM%29+and+vimentin%2B+circulating+tumor+cells+%28CTCs%29+detected+by+a+size-based+platform+predict+worse+prognosis+in+advanced+colorectal+cancer+patients+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy.</a> Cancer Cell International. 17, 6(2017).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+Microemboli+in+Gastric+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer.</a> Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).</li>
<li>Chang, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Significance+of+Circulating+Tumor+Microemboli+as+a+Prognostic+Marker+in+Patients+with+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma.</a> Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).</li>
<li>Aceto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+clusters+are+oligoclonal+precursors+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis.</a> Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).</li>
<li>Cheung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyclonal+breast+cancer+metastases+arise+from+collective+dissemination+of+keratin+14-expressing+tumor+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).</li>
<li>Giuliano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+Circulating+Tumor+Cell+Clusters%3A+Why+It+Takes+a+Village+to+Metastasize%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize.</a> Cancer Research. 78 (4), 845-852 (2018).</li>
<li>Gkountela, S., Aceto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-like+features+of+cancer+cells+on+their+way+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Direct%22%5BJournal%5D)">Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis.</a> Biology Direct. 11, 33(2016).</li>
<li>Gkountela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cell+Clustering+Shapes+DNA+Methylation+to+Enable+Metastasis+Seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding.</a> Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).</li>
<li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. , (2019).</li>
<li>Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+enumeration+by+the+CellSearch+system%3A+the+clinician%27s+guide+to+breast+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reviews%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment?</a> Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).</li>
<li>Sarioglu, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+label-free%2C+physical+capture+of+circulating+tumor+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters.</a> Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+Evaluation+of+a+Novel+Size+Based+Circulating+Tumor+Cell+Isolation+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System.</a> PLoS One. 10 (9), e0138032(2015).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+focusing+for+tumor+antigen-dependent+and+-independent+sorting+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells.</a> Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147(2013).</li>
<li>Went, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+EpCam+protein+expression+in+human+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Frequent EpCam protein expression in human carcinomas.</a> Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).</li>
<li>Soysal, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM+expression+varies+significantly+and+is+differentially+associated+with+prognosis+in+the+luminal+B+HER2%28%2B%29%2C+basal-like%2C+and+HER2+intrinsic+subtypes+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer.</a> British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133 (4), 704-715 (2008).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+microfilter+device+for+selective+capture%2C+electrolysis+and+genomic+analysis+of+human+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells.</a> Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345 (6193), 216-220 (2014).</li>
</ol>

N.A. e BMS são alistados como inventores em aplicações da patente que se relacionam às pilhas de circulação do tumor e ao tratamento do cancro. N.A. é um consultor pago para empresas farmacêuticas e seguradoras com interesse em biópsia líquida.

A caracterização molecular dos CTCs tem a promessa de melhorar nossa compreensão do processo metastático e orientar o desenvolvimento de novas terapias antimetástases. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada daqueles protocolos que permitem a micromanipulação de CTC e a análise a jusante, incluindo ensaios funcionais de uma única pilha-baseada, análise da expressão de gene e in vivo transplantação para o potencial metastático avaliação20.
Entre os passos ma...

A manifestação clínica da metástase em órgãos distantes representa o estágio final da progressão do câncer e responde por mais de 90% das mortes relacionadas ao câncer1. A transição da doença localizada para a metastática é um processo de múltiplas etapas, muitas vezes mediada por células tumorais circulantes (CTCs)2,3,4. Estas células são derramadas do tumor primário na circulação sanguínea e são transportadas para órgãos distantes, onde podem extravasar e estabelecer Lesões metastáticas5,6. Embora os tumores sólidos possam liberar um número relativamente elevado de CTCs, a maioria dos CTCs estão destinados a morrer, devido às altas forças de cisalhamento em circulação, morte celular mediada por anoikis, ataque imunológico ou capacidades limitadas para se adaptar a um microambiente estrangeiro7. Portanto, é fundamental estabelecer ferramentas que permitam a dissecção das características moleculares desses CTCs que são dotados de capacidade de propagação de metástases. Estudos pré-clínicos e clínicos recentes sugerem que a presença e a quantidade de CTCs individuais e de clusters de CTC está associada a um pior desfecho em pacientes com vários tipos de tumores sólidos8,9,10 , 11 anos de , 12 anos de , 13 anos de , 14 anos de . Os clusters CTC são grupos de dois ou mais CTCs conectados entre si durante a circulação e são mais eficientes na formação de metástases em comparação com CTCs simples3,15,16. Células dentro de um cluster mantêm forte adesão de células celulares através de desmossomas e junções aderências, o que pode ajudar a superar anoikis17,18. Recentemente, observou-se que o agrupamento de CTCs está vinculado à hipometilação de sítios de ligação para fatores de transcrição associados à stemness e proliferação, levando a uma maior capacidade de iniciar com sucesso a metástase19. A dissociação do agrupamento CTC resulta na remodelação de sítios de ligação chave e, consequentemente, na supressão do seu potencial metastático19. Adicionalmente aos conjuntos de células cancerosas, os CTCs podem igualmente associar ao glóbulo branco (o mais freqüentemente neutrophils) para manter níveis elevados da proliferação na circulação e para aumentar sua capacidade metastática20. No entanto, a biologia dos CTCs é entendida apenas em parte e várias questões permanecem abertas, incluindo as características moleculares subjacentes e vulnerabilidades de células simples e agrupadas.
Nos últimos anos, foram estabelecidas várias estratégias que exploram padrões de expressão celular-superfície, bem como propriedades físicas de CTCs para seu isolamento21,22,23,24, 25. Antigen-os métodos dependentes da isolação dependem na maior parte da expressão da molécula da adesão da pilha epithelial da superfície da pilha (epcam)26. O mais freqüentemente usado e (atualmente) a única plataforma aprovada pela FDA para a enumeração CTC, é o sistema CellSearch, que é baseado em um procedimento de duas etapas para isolar CTCs21. Na primeira etapa, os componentes do plasma são removidos por centrifugação, enquanto CTCs são capturados com Ferrofluidos magnéticos acoplados a anticorpos anti-EpCAM. Na segunda etapa, a solução enriquecida com CTC é manchada para células nucleadas (DAPI-positivas) expressando citoqueratina (CK)8,18,19, enquanto os glóbulos brancos (WBCs) são identificados usando o marcador de leucocitário CD45. Finalmente, as pilhas capturadas são coloc em uma plataforma de seleção integrada e os CTCs são identificados com a expressão de EpCAM, CKs, e DAPI ao ser negativo para CD45. Embora este seja considerado o padrão ouro para a enumeração de CTC, a análise molecular a jusante é desafiante com esta tecnologia devido às limitações inerentes na recuperação do CTC. Além disso, dado o seu procedimento de isolamento, CellSearch pode favorecer o enriquecimento de CTCs com níveis de EpCAM mais elevados em comparação com CTCs com menor expressão EpCAM, devido, por exemplo, a heterogeneidade do cancro27 ou downregulation de marcadores epiteliais 28,29. Para superar essas limitações, surgiram tecnologias independentes do antígeno para o enriquecimento de CTCs. Por exemplo, o CTC-ichip integra a separação hidrodinâmico de pilhas nucleadas, incluindo CTCs e WBCs dos componentes restantes do sangue, seguidos por um esgotamento imunomagnética de WBCs anticorpo-etiquetados, permitindo a purificação de CTCs untagged e viáveis em solução25. Adicionalmente, o fato de que a maioria dos CTCs são ligeiramente maiores do que os glóbulos vermelhos (RBCs) ou WBCs levou ao desenvolvimento de tecnologias de enriquecimento de CTC baseadas em tamanho23,30 (por exemplo, o sistema parsortix (Angle)) que faz uso de um tecnologia microfluídico-baseada, compreendendo um canal de estreitamento através da gaveta da separação, conduzindo as pilhas a uma abertura terminal de 10, 8, 6,5 ou 4,5 μm (os tamanhos diferentes estão disponíveis dependendo do diâmetro esperado de pilhas de cancro do alvo). A maioria das células sanguíneas passam pela lacuna estreita, enquanto CTCs ficar preso devido ao seu tamanho (mas também devido à sua baixa deformabilidade) e são, portanto, retidos na gaveta. Revertendo a direção do fluxo permite a liberação de CTCs capturados, que estão em um estado viável e adequado para análise downstream. Independentemente do protocolo escolhido para o isolamento de CTC, no entanto, os procedimentos típicos de pós-enriquecimento ainda produzem CTCs que são misturados com um número relativamente pequeno de RBCs e WBCs, fazendo a análise de CTCs puros ou em massa simples desafiador. Para abordar esta questão, estabelecemos um fluxo de trabalho que permite a manipulação de CTC sem potencial viés introduzido por contaminantes de células sanguíneas. A adição de imunocoloração de antemão, com combinações de anticorpos variáveis, distingue CTCs das células sanguíneas e até permite identificar subgrupos de CTC com perfis distintos de expressão de marcadores de superfície. Este procedimento altamente personalizável pode ser posteriormente combinado com aplicações específicas a jusante.
Aqui, nós descrevemos um fluxo de trabalho que comece de um produto CTC-enriquecido (obtido com toda a tecnologia do enriquecimento do CTC da escolha) e combine diversas aproximações para ganhar a introspecção na biologia do CTC na definição da único-pilha. Em poucas palavras, nosso fluxo de trabalho possibilita a identificação de CTCs simples, clusters CTC e clusters CTC-WBC por imunocoloração ao vivo, seguidos de micromanipulação de células simples e análise a jusante usando protocolos de cultivo ex vivo , uma única célula sequenciamento e ensaios in vivo de metástases.

<table><tbody><tr><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td> <td>Anti-humana EpCAM-AF488</td><td>CST5198</td><td>clone: VU1D9</td></tr><tr><td>1X DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td>sem cálcio, sem magnisium</td></tr><tr><td>6-poços Placa de fixação ultra-baixa</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD45-BV605</td><td>Biolegend</td><td>304041</td><td>clone: HI30</td></tr><tr><td>Anti-humano EGFR-FITC&nbsp;</td><td>Clone GTX11400 GeneTex</td><td></td><td>: ICR10</td></tr><tr><td>Anti-humano HER2-AF488&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>324410</td><td>clone: 24D2</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45-BV605</td><td>Biolegend</td><td>103139</td><td>clone: 30-F11</td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2EDTA</td><td>BD</td><td>366643</td><td>para coleta de sangue humano</td></tr><tr><td>Cell Celector</td><td>ALS</td><td>CC1001</td><td>unidade central&nbsp;</td></tr><tr><td>Software CellD</td><td>ALS</td><td></td><td>versão 3.0</td></tr><tr><td>Cultrex PathClear Fator de Crescimento Reduzido BME, Tipo 2</td><td>R& D Systems</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubo 1.3 mL K3EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>41.3395.005</td><td>para coleta de sangue</td></tr><tr><td>de camundongo Tubos PCR</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>RLT Plus</td><td>Quiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&nbsp; Inibidor de RNase Thermo</td><td>Fisher</td><td>AM2696</td><td>&nbsp; 1 U/&micro; L&nbsp;</td></tr></tbody></table>

micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

As metástases transmitidas pelo sangue representam a maioria das mortes relacionadas ao câncer e envolvem células tumorais circulantes (CTCs) que são bem-sucedidas no estabelecimento de novos tumores em locais distantes. Os CTCs são encontrados na corrente sanguínea de pacientes como células únicas (CTCs simples) ou como agregados multicelulares (clusters CTC e clusters de células sanguíneas CTC-brancas), com este último exibindo uma maior capacidade metastática. Além da enumeração, a análise fenotípica e molecular é extraordinariamente importante para dissecar a biologia de CTC e para identificar vulnerabilidades acionáveis. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de um fluxo de trabalho que inclui imunocoloração e micromanipulação de CTC, cultura ex vivo para avaliar as capacidades proliferativas e de sobrevivência de células individuais e ensaios in vivo de formação de metástases. Adicionalmente, nós fornecemos um protocolo para conseguir a dissociação de clusters de CTC em pilhas individuais e a investigação da heterogeneidade do intra-conjunto. Com essas abordagens, por exemplo, quantificamos com precisão a sobrevida e o potencial proliferativo de CTCs individuais e células específicas dentro dos clusters de CTC, levando-nos à observação de que células dentro de clusters exibem melhor sobrevida e proliferação em ex em comparação com CTCs individuais. em geral, nosso fluxo de trabalho oferece uma plataforma para dissecar as características dos CTCs no nível de célula única, visando a identificação de vias relevantes para metástases e uma melhor compreensão da biologia da CTC.

O fluxo de trabalho apresentado permite a preparação de CTCs individuais, seja de CTCs simples ou separados de clusters CTC. Os CTCs dos pacientes ou dos ratos tumor-tendo são enriquecidos do sangue inteiro com métodos disponíveis do CTC-enriquecimento e manchados então com os anticorpos de encontro aos marcadores Cancer-associados (por exemplo, EpCAM, verde) e marcadores WBC-específicos (por exemplo, CD45, vermelho) (Figura 1a ). O produto de CTC manchado é ...

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado para identificar características fenotípicas e moleculares que caracterizam células tumorais circulantes (CTCs). Combinamos imunocoloração ao vivo e micromanipulação robótica de CTCs simples e clusterizadas com técnicas baseadas em células únicas para análise a jusante e avaliação da capacidade de propagação de metástases.

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Este protocolo é particularmente relevante porque permite a detecção e seleção de células únicas a partir de um pool de células mistas para análise posterior a jusante em uma única resolução celular. A principal vantagem dessa técnica é o potencial de separar células tumorais individuais circulantes, ou CTCs, de células sanguíneas para uma gama de análises que requerem alta pureza. Comece iniciando o software de micromanipulador e ligando o micromanipulador.Conecte o micromanipulador ao computador e clique em Conectar e Inicializar dispositivo para inicializar o braço robótico no estágio do microscópio. Limpe as superfícies externas e internas do gabinete de proteção com etanol e feche o gabinete de proteção após cada manipulação da máquina para poder manobrar o dispositivo através do computador. Instale um novo capilar de vidro de 20 a 30 micrômetros no braço robótico e lave o óleo do sistema através do sistema para remover quaisquer bolhas na tubulação.Encha o tanque de esterilização um com 70% de etanol, tanque de esterilização dois com água sem nuclease estéril e o tanque tampão com PBS estéril de Dulbecco. Esterilize o capilar duas vezes com 70% de etanol e substitua o tanque

micromanipulation-circulating-tumor-cells-for-downstream-molecular

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Células tumorais circulantes são isolados a partir do sangue de pacientes com cancro sem causar danos celulares. Isolamento de células tumorais é realizada usando uma superfície bimolecular da E-selectina para além de anticorpos contra marcadores epiteliais. Um revestimento de nanotubo especificamente promove a adesão de células cancerosas, resultando em purezas de captura elevadas.

Isolamento rápido de células tumorais viáveis ​​circulantes de amostras de sangue de doentes

As células tumorais circulantes (CTCs) são prognóstico em vários tipos de câncer metastático. Este manuscrito descreve o sistema padrão ouro CellSearch (CSS) CTC plataforma enumeração e destaca os erros comuns erros de classificação. Além disso, dois protocolos adaptados são descritos para o marcador caracterização definida pelo usuário de CTCs e CTC enumeração em modelos de ratos pré-clínicos de metástase que utilizam esta tecnologia.

Adaptação do Semi-Automática de circulação Tumor de Células (CTC) Ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de Pesquisa

As células tumorais circulantes (CTCs) demonstraram desempenhar um papel importante na metástase tumoral. Aqui, um método para o isolamento e propagação de CTCs a partir do sangue total de um modelo de tumor singênico de camundongo de metástase de carcinoma hepatocelular (CHC) é descrito.

Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Um protocolo para utilizar um poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro revestido para captura e libertação eficaz thermoresponsive de células viáveis tumorais circulantes (CTC) é apresentada. Este método permite a captura de CTC de sangue dos pacientes e posterior liberação dos CTC viável para a cultura off-chip jusante, análises e caracterização.

Captura e libertação de viáveis ​​circulantes células tumorais do sangue

Descrevemos o estabelecimento de tumores colorretais ortotópicos através da injeção de células tumorais ou organoides no ceco de camundongos e o subsequente isolamento de células tumorais circulantes (CTCs) deste modelo.

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Este protocolo é para recuperar e preparar células alvo rara de uma mistura com células de fundo não-alvo molecular caracterização genética a nível de célula única. Qualidade do DNA é igual a não-tratados de células únicas e permite a aplicação de célula única (ambos triagem com base e direcionados a análise).

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.

Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional

O chip microfluídico clínico é uma importante técnica de análise biomédica que simplifica o pré-processamento de amostras de sangue de pacientes clínicos e cora por imunofluorescência as células tumorais circulantes (CTCs) in situ no chip, permitindo a rápida detecção e identificação de uma única CTC.

Plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis

As células tumorais circulantes (CTCs) são críticas para o estudo da progressão e metástase do câncer. Este artigo apresenta um protocolo integrado de alto rendimento para enriquecimento de CTC e sequenciamento de CTC única, melhorando a eficiência de captura e a pureza da CTC, reduzindo os custos de contaminação e sequenciamento, avançando assim na pesquisa de oncologia de precisão e aplicações clínicas.

Tecnologia de Classificação de Células Tumorais Circulantes de Alto Rendimento e Tecnologia de Sequenciamento de Célula Única Baseada em Microfluídica

Aprenda a isolar células tumorais circulantes com micromanipulação robótica para análise molecular e avaliação do potencial metastático em câncer.

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

Explorar mais vídeos