Name: Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a estabelecer modelos de xenotransplante humanizados com PBMC humanos em camundongos NOD/SCID para pesquisa em imuno-oncologia. Este protocolo oferece uma abordagem reprodutível e econômica para avaliar terapias imunológicas contra câncer.

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Agradecemos aos membros dos nossos laboratórios por discussões úteis. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo programa de pesquisa de inovação e cultivo biomédico e de Ciências da vida da Comissão Municipal de ciência e tecnologia de Pequim, o acordo de subvenção n º. Z151100003915070 (projeto "estudo pré-clínico sobre uma nova droga antitumoral de Oncologia imunológica BGB-A317"), e também foi parcialmente apoiado pelo financiamento interno da empresa para pesquisa pré-clínica.

Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo participantes humanos estavam de acordo com os padrões éticos do BeiGene e/ou Comitê Nacional de pesquisa e com a declaração de Helsínquia 1964 e suas emendas posteriores ou padrões éticos comparáveis. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes individuais incluídos no estudo. Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de revisão interna do BeiGene. Este protocolo foi ajustado especificamente para a avaliação de BGB-A317 (Tislelizumab) em camundongos humanizados NOD/SCID.
1. estabelecimento do modelo humano baseado em PBMC

<ol><li>
Mieloablação de camundongos NOD/SCID usando ciclofosfamida: determinação de doses ideais
	<ol>
<li>Compre camundongos NOD/SCID femininos (6-8 semanas). Nota: Todos os camundongos envolvidos neste estudo eram do sexo feminino.</li>
		<li>Prepare a ciclofosfamida (PC) em doses diferentes (50, 100 e 150 mg/kg) em soro fisiológico. Preparar dissulfiram (DS) em 0,8% Tween-80 em soro fisiológico a 125 mg/kg. Nota: diferentes concentrações de PC foram preparadas para permitir a administração de volumes iguais de solução de medicamentos para camundongos recebendo diferentes doses de PC.</li>
		<li>Trate os animais com CP (i.p.) e DS (p.o.) uma vez por dia durante 2 dias. Dar DS (p.o.) 2 h após cada dose de PC. Nota: O DS diminui a urotoxicidade da PC em camundongos, e a CP combinada com DS tem sido sugerida para ter neutropenia de maior duração do que os animais tratados apenas com PC10 o regime posológico de PC pode necessitar de ser pré-determinado antes dos estudos reais e foi encontrado para variar ligeiramente entre diferentes estirpes de rato imunodeficientes.</li>
		<li>Colete amostras de sangue do seio venoso orbital e transfira para tubos revestidos de EDTA-K no gelo no dia 0 (1 h antes da dose de 1St ), dia 2 (24 h após a 2ª dose) e dia 4 (72 h após a 2ª dose).</li>
		<li>Examine o efeito da mieloablação após o tratamento com PC e DS por FACS. Use Rat anti-mouse CD11b (M1/70), Rat anti-mouse Ly6C (HK 1.4,) e Rat anti-mouse Ly6G (1a8) para gating CD11b+ Ly6Galta como neutrófilos, CD11b+Ly6Calta como monócitos11,12.</li>
		<li>Grave o peso corporal e as condições de saúde dos ratos diariamente durante uma semana. A dose óptima de PC e de DS é determinada como o regime que conduz ao esgotamento máximo dos neutrófilos e dos monócitos sem causar a toxicidade severa aos ratos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transplantação humana do PBMC e Engraftment do tumor: ajuste do modelo
	<ol>
<li>Isole PBMCs humanos de doadores saudáveis por centrifugação de gradiente de densidade de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Pré-trate os ratos com CP e DS como indicado pela etapa 1.1.2 e 1.1.3 para aumentar a eficiência da transplantação.</li>
		<li>20 a 24 h após a segunda dose de PB e DS, injetar linha celular tumoral humana, como células A431 (ATCC, 2,5 x 106) e 5 x 106 PBMCs isolados (misturado em um total de 200 μL de soro tampão fosfato (PBS) contendo 50% de matrigel) , ou fragmentos tumorais (3 x 3 x 3 mm3, em um volume total de 200 ΜL de PBS contendo 50% de Matrigel) e 200 μL de 5 x 106 PBMCs (100 μl cada um para o lado esquerdo e direito do fragmento de tumor enenxertado) (s.c.) subcutaneamente no flanco direito dos animais.</li>
		<li>Meça o volume preliminar do tumor e recorde duas vezes por semana por 4-6 semanas. Nota: Os ratos serão eutanasiados uma vez que seus pesos corporais perdem mais de 20% ou seu volume tumoral atinge 2.000 mm3 ou o tumor é Ulcerado.</li>
		<li>Eutanizar os camundongos em câmaras de gás com dióxido de carbono. Colete todos os tecidos tumorais em camundongos sacrificados com tesoura oftálmicas e processe-os para análise histológica e imuno-histoquímica (IHC). Examine as expressões humanas CD8, PD-1 e PD-L1 nestes tecidos. Consulte o protocolo passo 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>
2. tela de doador PBMC

<ol><li>Tela de um painel de doadores PBMC devido às variações antecipadas resultantes de PBMCs coletados de indivíduos. Use células A431 coinjetando com PBMCs de diferentes doadores de acordo com os procedimentos, conforme indicado pela etapa 1,2. Nota: Mais de 50 doadores saudáveis de PBMC foram rastreados no estudo, a fim de obter número suficiente de doadores adequados. Pesquisadores que gostariam de adotar esse protocolo podem decidir por conta própria quantos doadores saudáveis de PBMC devem ser rastreados, com base no projeto dos estudos planejados.</li>
	<li>Monitore o volume tumoral duas vezes por semana medindo com um paquímetro. Nota: A taxa de crescimento tumoral pode variar com PBMC de diferentes doadores.</li>
	<li>Colete os tecidos tumorais em um volume médio de 200-500 mm3 e processe-os para análise histológica e imuno-histoquímica (IHC). Examine as expressões humanas CD8, PD-1 e PD-L1. Consulte a etapa 4 para obter um protocolo detalhado.</li>
	<li>Selecione doadores de PBMC que resultam em crescimento moderado do tumor (volume tumoral > 200 mm3 14 dias após a inoculação) e relativamente altas expressões PD-1, PD-L1 e CD8 (escores médios do ihc > 2). Consulte a etapa 4 para obter um protocolo detalhado de Pontuação do IHC.</li>
</ol>
3. linha celular do cancro humano e tela de PDX

<ol><li>Linhas de células de tela e PDXs de acordo com os procedimentos indicados na etapa 1,2, para avaliar a taxa de crescimento tumoral, a expressão de PD-L1 humana dos tumores e infiltrações de células imunes. Nota: Mais de 30 linhagens de células cancerosas humanas e mais de 20 PDXs de diferentes tipos de câncer foram rastreadas pelos autores. Os dados dos modelos de tumores selecionados foram mostrados na seção de resultados.</li>
</ol>
4. imunoistoquímica (IHC)

<ol><li>Colheita como indicado pela etapa 1.2.5 e fixar tecidos tumorais por imersão em formalina. Deshidratar e incorporar tecidos fixos em parafina. Corte os tecidos fixos a 3 μm e coloque-os em lâminas revestidas com polylysine.</li>
	<li>Desparaffinize em xilenos três vezes 7 min cada. Hidratar as secções através de álcoois classificados: 100% etanol duas vezes por 3 min cada, seguido por 90%, 80% e 70% etanol por turno por 3 min cada. Enxágüe por H2o desionizado três vezes e remova o excesso de líquido das lâminas.</li>
	<li>Realize a recuperação do antígeno colocando as lâminas em um recipiente e cubra com tampão do citrato de sódio de 10 mM (pH 6,0), ou Tris-EDTA (pH 9,0). Aqueça o recipiente de slides por microondas por 3 min. Ferva em um banho de água a 95 ° c por 30 min e depois esfrie até a temperatura ambiente. Enxágüe por H2O desionizado três vezes e aspirar o excesso de líquido das lâminas.</li>
	<li>Bloquear as secções em 3% de albumina sérica bovina em PBS durante 1 h e 0,3% H2O2 solução em PBS durante 10 min. mancha por anticorpos contra o CD8 humano (EP334), PD-1 (NAT105,) e PD-L1 (E1L3N) a 4 ° c durante a noite, e HRP conjugado 2ND anticorpos na RT para 1 h. soltar o substrato DAB (3, 3 '-diaminobenzidina) sobre as lâminas e controlar o tempo de reação (segundos a minutos), monitorando a cor marrom do microscópio.</li>
	<li>Cubra as lâminas com bálsamo neutro depois de mergulhar as lâminas em 0,5% álcool ácido clorídrico e 0,5% de água de amônia por sua vez para 5 s cada, em seguida, em 80%, 90% e 100% etanol em seqüência por 3 min cada, e, finalmente, em xilenos usando três mudanças para 5 min cada. Detecte os anticorpos observando a cor marrom do DAB usando o microscópio. Nota: A expressão humana de CD8 e de PD-1 em leucócito tumor-infiltrando (TIL) foi avaliada atribuindo uma contagem da expressão em uma escala de 5 pontos (contagem de IHC, escala 0-4) na ampliação objetiva elevada (20x, 40x). 0, ausente; 1, fraca intensidade/menos de 20% células; 2, intensidade fraca a moderada/20%-50% células; 3, moderada a forte intensidade/50%-80% células; 4, intensidade forte/mais de 80% células. A mancha PD-L1 humana dentro das pilhas do tumor foi anotada usando um sistema de Pontuação ajustado em uma escala de 5 pontos (contagem de IHC, escala 0-4) por causa de seu sinal relativamente difuso. 0, ausente; 1, fraca intensidade/menos de 10% células; 2, fraca-a-moderada intensidade/10%-30% células; 3, moderada/30%-50% células; 4, intensidade forte/mais de 50% células.</li>
</ol>
5. estudos de eficácia e farmacodinâmica in vivo em modelos de PBMC-NOD/SCID xenograft humanizados

<ol><li>Pré-trate camundongos NOD/SCID como indicado pela etapa 1.1.3. Em suma, trate os camundongos com 100 mg/kg CP (i.p.) e 125 mg/kg DS (p.o.) uma vez por dia durante 2 dias.</li>
	<li>20 a 24 h após a segunda dose, injete por via subcutânea (s.c.) com número indicado de células cancerosas humanas e 2,5-5 x 106 PBMCs (um total de 200 μL de mistura de células em 50% de Matrigel) no flanco dianteiro direito dos animais. Nota: O número de PBMC usado para qualquer mouse individual em um único estudo deve ser o mesmo. No entanto, devido a variações na disponibilidade de PBMC isolados totais no momento de cada estudo, os autores optaram por usar 2,5 x 106, 4 x 106ou 5 x 106 PBMC em diferentes estudos. Embora essa diferença de 2 vezes na quantidade administrada de PBMCs possa afetar o grau de humanização, os autores não observam diferenças significativas na avaliação de eficácias antitumorais das imunoterapias testadas.</li>
	<li>Para o Engraftment de pdxs, injete fragmentos por via subcutânea do tumor (3 x 3 x 3 milímetros3) no flanco dianteiro direito dos animais. Injete por via subcutânea 200 μL de 5 x 106 PBMCs (100 μl cada lado) à esquerda e à direita do fragmento enxertado do tumor. Nota: Os tecidos do tumor de PDX foram administrados em uma solução de Matrigel, mesmo que descrito para os modelos da linha celular.</li>
	<li>No dia da inoculação celular, agrupe aleatoriamente os animais e trate-o como o protocolo de estudo planejado.  Avalie a atividade antitumoral de drogas candidatas, BGB-A317 (QW, i.p.) neste caso, nas doses indicadas em vários modelos tumorais. Nota: As três linhagens de células cancerosas humanas (i.e., A431 (Carcinoma epidemoide), SKOV3 (cancro do ovário) e SK-MES-1 (cancro do pulmão)), bem como dois modelos PDX (i.e., BCLU-054 (cancro do pulmão) e BCCO-028 (cancro do cólon)), são considerados bons modelos tumorais para avaliação neste modelo humanizado do rato.</li>
	<li>Meça o volume preliminar do tumor duas vezes cada semana, usando um compasso de calibre. Nota: A perda de pesos corporais de Gand foi observada em torno de 4-6 semanas após o Engraftment de PBMC em nossos estudos, permitindo uma janela de 1-2 meses para avaliações terapêuticas da eficácia.</li>
	<li>Para a análise da farmacodinâmica de células imunes infiltradas tumorais, corte os tecidos tumorais em pequenos pedaços e digerir-os com colagenase tipo i (1 mg/ml) e DNase i (100 μg/ml) em RPMI1640 mais 5% soro fetal bovino (FBS) por 30 min a 37 ° c. Passe os tecidos digeridos através de filtros de células de 40 μm para obter suspensões de células únicas.</li>
	<li>Lave as células e ajuste o número da célula para uma concentração de 1 x 107 células/ml em gelo frio FACS buffer (PBS, 1% FBS) em 96-bem fundo redondo placas. Lave as células por centrifugação e bloqueá-las adicionando 20 μg/mL de IgG humana por 30 min, seguida de coloração com anticorpos anti-humanos CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) e PD-1 (MIH4) a 4 ° c durante 30 min. Em seguida, sujeitar as amostras manchadas a citometria de fluxo e analisar usando guavaSoft 3.1.1.</li>
</ol>

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<li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4%28%2B%29+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li>
</ol>

Todos os autores têm o interesse da posse em BeiGene. Tong Zhang e Kang li são inventores em uma patente cobrindo BGB-A317 descrito neste estudo.

Nosso conhecimento do desenvolvimento e da progressão do cancro avançou significativamente nos últimos anos, com foco em uma compreensão detalhada das pilhas do tumor e de seu estroma associado. Aproveitar os mecanismos imunes do hospedeiro poderia induzir um maior impacto contra as células cancerosas, representando uma estratégia de tratamento promissora. Os modelos murinos com sistemas imunológicos de rato intacto, como os modelos syngeneic e GEM, têm sido amplamente utilizados para estudar a imunidade mediada por pont...

A imuno-Oncologia (I-O) é um campo de tratamento de câncer em rápida expansão. Os pesquisadores começaram recentemente a apreciar o potencial terapêutico das funções moduladoras do sistema imunológico para atacar tumores. Bloqueios de ponto de verificação imunológico demonstraram atividades encorajadoras em uma variedade de tipos de câncer, incluindo melanoma, Carcinoma de células renais, cabeça e pescoço, pulmão, câncer de bexiga e próstata1,2. Ao contrário das terapias direcionadas que matam diretamente as células cancerosas, as terapias I-O potenciam o sistema imunológico do corpo para atacar os tumores3.
Até à data, foram estabelecidos numerosos modelos de animais de I-O relevantes. Estes incluem: 1) linhas de pilha do tumor do rato ou homoenxerto do tumor em ratos syngeneic; 2) tumores espontâneos derivados do rato geneticamente projetado (GEM) ou da indução carcinogênica; 3) gemas quiméricas com o knock-in de alvo de droga humana (s) em um sistema imunológico funcional murino; e 4) camundongos com imunidade humana reconstituída transplantados com células cancerosas humanas ou xenoenxertos derivados do paciente (PDXs). Cada um destes modelos têm vantagens óbvias, bem como limitações, que foram descritos e revistos extensivamente em outros lugares4.
A reconstituição da imunidade humana em camundongos imunodeficientes tem sido valorizada como uma abordagem clinicamente relevante para a pesquisa de I-O translacional. Isto é conseguido geralmente com o 1) Engraftment de pilhas imunes adultas (por exemplo, pilhas mononucleares do sangue periférico (pmbc))5,6, ou 2) Engraftment de pilhas de haste hematopoietic (HSC) de, por exemplo, sangue do cordão umbilical ou fetal fígado7,8. Estes ratos humanizados poderiam apoiar o crescimento de tumores humanos, permitindo assim a avaliação de terapias do I-O no contexto da imunidade humana e dos cancros humanos. Apesar das vantagens, as aplicações de camundongos humanizados na pesquisa I-O foram geralmente prejudicadas por diversas preocupações, como o tempo de desenvolvimento do modelo longo e o custo consideravelmente elevado.
Aqui, nós descrevemos um modelo PBMC-baseado humano que poderia extensamente ser aplicado para estudos translacional do I-O. Este modelo é comparativamente tempo-e custo-eficaz com reprodutibilidade elevada em estudos da eficácia. Tem sido utilizado em casa para as avaliações de várias terapêuticas I-O atualmente desenvolvimento pré-clínico e clínico. BGB-A317 (Tislelizumab), um anticorpo anti-PD-1 humanizado investigacional9 , é utilizado como exemplo para discutir o desenvolvimento do modelo, caracterização e possíveis aplicações para análises de eficácia antitumoral.

<table><tbody><tr><td>PBMC separação / cultura de células</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Isolamento de células</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CVR</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-076-CV</td><td>Cultura</td></tr> <tr><td>de célulasPenicilina-estreptomicina,</td><td>Líquido Gibco</td><td>15140-163</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25200-114</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>inoculação CDX</td></tr> <tr><td>< forte > análise FACS< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>Amostra preparação</td></tr><tr><td>Colagenase Tipo I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>Preparação de amostras</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo/humano CD11b (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101206</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-camundongo Ly-6C (HK1.4) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>128008</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-camundongo Ly-6G (1A8)</td><td>BioLegend</td><td>127614</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD8 humano (OKT8)</td><td>Sungene Biotech</td><td>H10082-11H</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD279 humano (MIH4)</td><td>eBioscience</td><td>12-9969-42</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-humano CD3 (HIT3a) anticorpo</td><td>4A Biotech</td> <td>-</td> <td>FACS</td></tr><tr><td>Goiaba easyCyte 8HT Citômetro de fluxo de bancada</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td>FACS</td></tr><<tr><td>strong>Tumor/PDX implantação/dosagem/medição</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciclofosfamida</td><td>J& K</td><td>Cat#419656, CAS#6055-19-2</td><td>Eficácia in vivo</td></tr><tr><td>Dissulfiram</td><td>J& K</td><td>Cat#591123, CAS#97-77-8</td><td>Eficácia in vivo</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD</td><td>300841</td><td>inoculação CDX</td></tr><tr><td>Agulhas hipodérmicas (14 G)</td><td>Shanghai SA Mediciall & Fornecedor verificado - Plastic Instruments Co., Ltd.</td><td>0.7*32 TW SB</td><td>PDX inoculação</td></tr><tr><td>Vernier Caliper (MarCal)</td><td>Mahr</td><td>16ER</td><td>Medição de tumor</td></tr><tr><td>IVC gaiolas ventiladas individuais</td><td>Lingyunboji Ltd.</td><td>IVC-128</td><td>Biotémio</td></tr><tr><td>IHC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP200 Processador de tecidos a vácuo</td><td>Leica</td><td>ASP200</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Leica RM2235 Micrótomo rotativo manual para seccionamento de rotina</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Leica EG1150 H Módulo de incorporação de parafina aquecida</td><td>Leica</td><td>EG1150 H</td><td></td></tr><tr><td>IHC Ariol-Clinical IHC e FISH Scanner</td><td>Leica</td><td>Ariol</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD8 humano (EP334)</td><td>ZSGB-Bio</td><td>ZA-0508</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Anti-humano PD1 [NAT105] anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab52587</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Anti-humano PD-L1 (E1L3N) Anticorpo</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>13684S</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Polink-2 mais Sistema de Detecção de Polímero HRP</td><td>ZSGB-Bio</td><td>PV-9001/9002</td><td>IHC</td></tr></tbody></table>

uma célula mononuclear do sangue periférico humano (pbmc) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-oncology (i-o)

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A descoberta e desenvolvimento da terapia de imuno-Oncologia (I-O) nos últimos anos representa um marco no tratamento do câncer. No entanto, persistem desafios de tratamento. Modelos animais robustos e relevantes para a doença são recursos vitais para a continuação da investigação pré-clínica e do desenvolvimento, a fim de abordar uma série de pontos de verificação imunológicos adicionais. Aqui, nós descrevemos uma pilha mononucleares humana do sangue periférico (PBMC)-modelo humanizado baseado do xenograft. BGB-A317 (Tislelizumab), um anticorpo anti-PD-1 humanizado investigacional no desenvolvimento clínico em estágio tardio, é usado como exemplo para discutir a criação da plataforma, a caracterização do modelo e as avaliações da eficácia do fármaco. Estes ratos humanizados apoiam o crescimento da maioria dos tumores humanos testados, permitindo assim a avaliação de terapias de I-O no contexto da imunidade humana e dos cânceres humanos. Uma vez estabelecido, nosso modelo é comparativamente tempo-e custo-eficaz, e geralmente produzem resultados altamente reprodutíveis. Nós sugerimos que o protocolo esboçado neste artigo pudesse servir como uma diretriz geral para estabelecer os modelos do rato reconstituídos com O PBMC humano e os tumores para a pesquisa do I-O.

Seguindo os procedimentos aqui apresentados, foi estabelecido com sucesso um modelo humanizado de Xenoenxerto com base em PBMC. Em síntese, os efeitos da mieloablação de PB nos camundongos NOD/SCID foram determinados pela análise de citometria de fluxo de populações de neutrófilos e monócitos pós-tratamento de CP e DS (Figura 1). 100 mg/kg CP mais 125 mg/kg DS foi determinada como a dose óptima e utilizada em estudos posteriores, uma como o regime resulta na depleção máxima de neutrófilos e ...

Nós descrevemos uma pilha mononucleares do sangue periférico humano (PBMC)-modelo humanizado baseado do rato do xenograft para a pesquisa translacional do immuno-Oncology. Este protocolo poderia servir como diretriz geral para O estabelecimento e caracterização de modelos similares para a avaliação da terapia de I-O.

Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O)

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Nosso protocolo pode servir como uma diretriz geral para estabelecer modelos de camundongos reconstituídos com PBMC humano e tumores para pesquisa de imuno-oncologia. Esses procedimentos fornecem uma abordagem econômica e altamente reprodutível para a reconstituição parcial da imunidade humana em camundongos portadores de tumores humanos através de mistura subcutânea e mistura de PBMC humano com xenoenxertos de câncer. Demonstrando os procedimentos comigo estarão Xinxin Cui, Yanjuan Zhang, Huichen Bai e Xiaolong Yang, enviados do Departamento de Farmacologia.Para o esgotamento das células mieloides intra peritoneally entregar 100mg por quilograma de ciclofosfame e entregar oralmente 125mg por quilograma de disulfiram a camundongos fêmeas NOD/SCID de seis a oito semanas de idade uma vez por dia durante dois dias. 24 horas após a segunda dose de ciclofosfameto e dissulfiram, resuspensa cinco vezes 10 dos seis PBMC humanos recém-isolados e 2,5 vezes 10 das seis células de células tumorais humanas e 200 microliters de PBS mais 50% metrogel por animal e injetar todo o volume subcutâneamente no flanco direito de cada animal experimental. Meça e regise o volume primário do tumor duas vezes por semana durante quatro a seis semanas.Quando os tumores atingem um volume médio de 200 a 500 milímetros cubos, use tesouras otómicas para colher tumor inteiro de cada animal. Devem ser utilizadas linhas de células tumorais e xenoenxertos derivados do paciente que resultem em um crescimento tumoral moderado com expressão PD-1, PD-L1 e CD8 relativamente alta. Para análise imunohistoquímica dos tecidos tumorais colhidos, fixar as amostras e formalina 24 a 72 horas antes da desidratação e incorporação dos tecidos em parafina.Obtenha três seções de micrômetros dos tecidos incorporados em lâminas revestidas de polilise e desparafinar as amostras com três imersões de xileno de sete minutos. Após o terceiro tratamento, hidrate as seções com imersões de álcool de três minutos. Em seguida, enxágue o slide em água desionizada três vezes e remova qualquer excesso de líquido dos slides.Para realizar a recuperação de antígenos, coloque os slides em um recipiente e cubra os slides com um tampão de sodiocitrate de 10 milimões. Aqueça os slides, recipiente, em um micro-ondas por três minutos antes de colocar os slides em um banho de água de 95 graus Celsius por 30 minutos. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, enxágue os slides três vezes em água desionizada e aspire qualquer excesso de líquido dos slides.Incubar com peróxido de hidrogênio de 0,3% por 10 minutos para bloquear a atividade peroxidase endógena seguida de bloqueio com 3%BSA e PBS por uma hora. No final da incubação de peróxido de hidrogênio, rotule os slides com os anticorpos primários apropriados a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, trate os slides com anticorpo secundário conjugado peroxidase de rabanete por uma hora à temperatura ambiente antes de aplicar o substrato dropwise nos slides até que um nível apropriado de coloração marrom seja observado por microscopia leve.Em seguida, manche as amostras com hematoxilina. Após um minuto, pare a reação com água destilada seguida de uma submersão de cinco segundos em álcool ácido clorídrico de 0,5% e cinco segundos em 0,5% de água de amônia. Em seguida, desidratar as amostras com três etanol ascendentes de três minutos e três, cinco minutos de imersão em xileno.Para avaliar a atividade antitumoral de uma droga de interesse candidata, inicie o tratamento no dia da inoculação celular de acordo com o protocolo experimental planejado e monitore o volume do tumor primário duas vezes por semana durante quatro a seis semanas. Para a análise dinâmica pharmaCODE das células imunes infiltradas do tumor, pique os tecidos tumorais em pequenos pedaços e digera os fragmentos com colagenase tipo um e DNase I e RPMI-1640 médio mais 5%FBS por 30 minutos a 37 graus Celsius. No final da digestão, filtre o tecido digerido através de um coador de células de 40 micrômetros para obter uma única suspensão celular e coletar as células por centrifugação.Resuspenque a pelota em uma vez 10 das sete células por mililitro de concentração de buffer de fax frio gelado e transfira um volume igual de células para o número apropriado de poços em uma placa inferior redonda de 96 poços. Colete as células por centrifugação e resuspenja as pelotas em 20 microgramas por mililitro de IGG humano por 30 minutos para bloquear qualquer ligação inespecífica. Em seguida, colorigue as células com os anticorpos primários apropriados por 30 minutos a quatro graus Celsius antes de sua análise por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão.Como demonstrado, 100 miligramas por quilograma de ciclofosfamatto e 125 miligramas por quilograma de mieloablação dissulfiram resulta em um esgotamento significativo de neutrófilos e monócitos quatro dias após o tratamento. Após o PBMC humano e o transplante de tumores, a presença de infiltrados de células imunes humanas pode ser verificada dentro do microambiente tumoral por imunohistoquímica. Uma triagem in vivo de um painel de doadores de PBMC pode ser realizada para confirmar a presença de uma infiltração relativamente alta de células imunes no microambiente tumoral em uma taxa de crescimento tumoral aceitável.Linhas de células cancerígenas humanas em xenoenxertos derivados de pacientes de diferentes tipos de câncer também podem ser avaliadas para avaliar a taxa de crescimento do tumor e a infiltração de células imunes. Neste experimento representativo, o tratamento do PBMC e camundongos humanizados enxertados com anticorpo anti-PD1 humanizado resultou em atividades antitumorais significativas. Disulfiram diminui a urotoxicidade do ciclofosfamatto, a combinação pode exercer efeitos de neutropenia mais duradouros em camundongos.O regime de dose exata de ciclofosfamatida e dissulfiram pode precisar ser predeterminado. Novas cepas de camundongos mais imunodeficientes para a reconstituição mais fácil da imunidade humana e diminuição do efeito Xenógênico GvHD foram estabelecidas e estão pendentes de novas investigações com nosso protocolo documentado. Nosso modelo é útil para avaliar terapias imunológicas de câncer de células T, particularmente quando se trabalha em cronogramas curtos ou para selecionar agentes antes de se mudar para um modelo de imunidade multilineagem mais complexo.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

A geração e caracterização de células T específicas de tumor utilizando ratinhos humanizados é descrita aqui. Tecido do timo humano e geneticamente modificadas de células-tronco hematopoiéticas são transplantadas em ratos imunocomprometidos. Isto resulta na reconstituição de um sistema imune humano permitindo engenharia para exame in vivo de anticorpos anti-tumorais respostas imunes.

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar um modelo de camundongo xenoenxerto humanizado. Um camundongo imunocomprometido é injetado com ciclofosfamida para causar depleção de células imunológicas. Células tumorais derivadas de pacientes misturadas com células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) em um hidrogel são injetadas por via subcutânea no camundongo, formando um tumor com células T infiltrantes.

Uma técnica para gerar um modelo humano de camundongo xenoenxerto humanizado enxertado com PBMC

As células humanas mieloma múltiplo (MM) requerem o microambiente favorável de células mesenquimais e componentes da matriz extracelular para a sobrevivência e proliferação. Nós estabelecemos um modelo vivo de embriões em frango com células de mieloma e mesenquimais humanas enxertados para estudar os efeitos de medicamentos contra o câncer no crescimento do tumor, invasão e angiogênese.

Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

Linfoma de células do manto (MCL) é um difícil de tratar a doença associada a células B e é igualmente difícil estabelecer um modelo de rato de enxerto heterólogo do MCL primário para estudar e desenvolver a terapêutica. Aqui, descrevemos a criação bem sucedida de xenografts MCL em camundongos para ajudar a compreender a sua biologia subjacente.

Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir e marcar a doença em um modelo xenogénica da doença do transplantar-contra-anfitrião (xenogvhd). o xenoGVHD fornece um modelo in vivo para estudar a imunossupressão de células T humanas. Adicionalmente, nós descrevemos como detectar pilhas de T humanas nos tecidos com PCR digital como uma ferramenta para quantificar o immunosuppression.

Indução e pontuação da doença do enxerto versus hospedeiro em modelo murino Xenogeneico e quantificação de células T humanas em tecidos de camundongo utilizando PCR digital

A doença enxerto versus hospedeiro é uma grande complicação após o transplante de medula óssea alogênico. As células dendríticas desempenham um papel crítico na patogênese da doença enxerto-versus-hospedeiro. O artigo atual descreve uma nova plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas no desenvolvimento da doença enxerto versus hospedeiro e o efeito enxerto-versus-leucemia.

Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro

O presente protocolo descreve como enxertar pele humana em camundongos diabéticos não obesos (NOD)-scid interleucina-2 receptor de cadeia gama (NSG) camundongos. Uma descrição detalhada da preparação da pele humana para transplante, preparação de camundongos para transplante, transplante de pele humana de espessura dividida e procedimento de recuperação pós-transplante estão incluídas no relatório.

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Este protocolo descreve a geração de camundongos do sistema imunológico humano (HIS) para estudos de imuno-oncologia. Instruções e considerações sobre o uso deste modelo para testes de imunoterápicos humanos em tumores humanos implantados neste modelo são apresentadas com ênfase na caracterização da resposta do sistema imune humano ao tumor.

Testando imunoterápicos contra o câncer em um modelo humanizado de camundongo com tumores humanos

Este protocolo descreve o xenoenxerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) B e T derivadas do paciente, que ocorre 4 dias após a injeção.

In Ovo Xenoenxerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-LLA)

Aprenda a estabelecer modelos de xenotransplante humanizados com PBMC humanos em camundongos NOD/SCID para pesquisa em imuno-oncologia. Este protocolo oferece uma abordagem reprodutível e econômica para avaliar terapias imunológicas contra câncer.

Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O) (Vídeo) | JoVE Journal

Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O)

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