Name: Método avançado da imunoprecipitação da reticulação (eCLIP) para a identificação eficiente do RNA proteína-ligado no testis do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda o método eCLIP para identificar alvos de RNA de proteínas de ligação em testículo de rato. Esta técnica não radioativa oferece maior especificidade e eficiência na análise de regulação pós-transcricional durante a espermatogênese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Eric L Van Nostrand e a Gene W Yeo por uma orientação útil com o protocolo original. K.Z. foi apoiado pelo programa nacional da chave R & D de China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), e Fundação Nacional da ciência natural de China (31771653). Ly foi apoiado pela National natural Science Foundation da China (81471502, 31871503) e programa inovador e empreendedor da província de Jiangsu.

<ol><li>Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pachytene+asynapsis+drives+meiotic+sex+chromosome+inactivation+and+leads+to+substantial+postmeiotic+repression+in+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids.</a> Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).</li>
<li>Turner, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+sex+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li>
<li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li>
<li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li>
<li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+a+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37 (4), 376-386 (2005).</li>
<li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+right+RNA%3A+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Acadamy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).</li>
<li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).</li>
<li>Zheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+MOV10L1+associates+with+Piwi+proteins+and+is+an+essential+component+of+the+Piwi-interacting+RNA+%28piRNA%29+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Acadamy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).</li>
<li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+Is+a+5%27+to+3%27+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3%27+UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).</li>
<li>Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coordinated+local+translational+control+point+at+the+synapse+involving+relief+from+silencing+and+MOV10+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation.</a> Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).</li>
<li>Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+RNASEH2+and+MOV10+controls+LINE-1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition.</a> Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).</li>
<li>Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+RNA+helicase+is+a+potent+inhibitor+of+retrotransposition+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1002941(2012).</li>
<li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capped+small+RNAs+and+MOV10+in+human+hepatitis+delta+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).</li>
<li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).</li>
<li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li>
<li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160(2012).</li>
<li>Skariah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mov10+suppresses+retroelements+and+regulates+neuronal+development+and+function+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain.</a> BMC Biology. 15 (1), 54(2017).</li>
<li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038(2012).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li>
<li>Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitored+eCLIP%3A+high+accuracy+mapping+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).</li>
<li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP%3A+protein-RNA+interactions+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142(2018).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre%2Flox+based+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24(2011).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Customizable+Protocol+for+String+Assembly+gRNA+Cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR).</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+genome+browser+and+associated+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The UCSC genome browser and associated tools.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mili+and+Miwi+target+RNA+repertoire+reveals+piRNA+biogenesis+and+function+of+Miwi+in+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).</li>
<li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+is+an+RNA-binding+protein%2C+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li>
<li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+%28CLIP-Seq%29+for+mouse+Piwi+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Com a compreensão crescente do papel universal de rbps contextos biológicos e patológicos, os métodos do grampo foram utilizados extensamente para revelar a função molecular de rbps20,32,33, 34,35. O protocolo descrito aqui representa uma aplicação adaptada do método de eCLIP ao testis do rato.
Um desafio em executar eCLIP no testi...

O testis mammalian representa um modelo desenvolvente excelente onde um programa intricado da diferenciação da pilha funcione ciclicamente para render espermatozóides numerosos. Um valor único deste modelo reside no surgimento da inativação transcricional em determinados estágios da espermatogênese, tipicamente quando a inativação do cromossomo meiótico (MSCI) ocorre1,2 e quando os espermatozídeos redondos sofrem compactação nuclear drástica durante a spermiogênese3. Estes eventos transcricional inconsecutivos necessitam a regulação borne-transcricional do gene, em que as proteínas RNA-obrigatórias (rbps) jogam um papel crucial, dando forma ao transcriptoma e mantendo a fertilidade masculina.
Para identificar os alvos de RNA de bona fide de uma RBP individual in vivo, o método da imunoprecipitação de reticulação (clip) foi desenvolvido4,5, com base no mas além da imunoprecipitação de RNA regular (RIP)6,7 , pela incorporação de etapas chaves que incluem a reticulação ultravioleta (UV), a lavagem estrita e a transferência do gel para melhorar a especificidade do sinal. A aplicação avançada do grampo combinada com o seqüenciamento da elevado-taxa de transferência provocou o grande interesse na interação da proteína-RNA do perfil em níveis do genoma-largo8. Além do que estudos genéticos na função de RBP, tais métodos bioquímicos que identificam a interação direta da proteína endógena e do RNA foram indispensáveis para elucidar exatamente os papéis regulatórios do RNA de RBPs. Por exemplo, MOV10L1 é um helicase do RNA do testis-específico exigido para a fertilidade masculina e a biogênese Piwi-interagindo do RNA (piRNA)9. Seu MOV10 do parálogo é sabido como um helicase ubiquitously expressado e multifunctional do RNA com papéis em aspectos múltiplos da biologia do RNA10,11,12,13,14 , 15 anos de , 16 anos de , 17 anos de , 18. empregando o clip-Seq convencional, nós encontramos que MOV10L1 liga e regula precursores preliminares de Pirna para iniciar o processamento adiantado de Pirna19,20, e esse MOV10 liga UTRs de mRNA 3 ' e assim como o RNA RNAs espécies em células germinativas testiculares (dados não mostrados).
No entanto, CLIP é originalmente um procedimento laborioso, radioativo seguido de sequenciamento de preparação da biblioteca com uma notável perda de Tags CLIP. No clipe convencional, uma biblioteca de cDNA é preparada usando adaptadores ligados em ambas as extremidades do RNA. Após a digestão da proteína, os polypeptídeos curtos reticulados permanecem unidos aos fragmentos do RNA. Esta marca de reticulação bloqueia parcialmente a progressão da transcriptase reversa (RTase) durante a síntese do cDNA, resultando em cDNAs truncados que representam cerca de 80% da biblioteca do cDNA21,22. Assim, apenas os fragmentos de cDNA resultantes de RTase ignorando o site de reticulação (read-through) são seqüenciados. Recentemente, as várias aproximações do grampo, tais como PAR-grampo, iCLIP, eCLIP e uvCLAP, foram empregadas para identificar os locais da ligação cruzada de RBPs em pilhas vivas. O par-grampo envolve a aplicação da radiação UV de 365 nanômetro e dos análogos photoactivatable do nucleotide e é conseqüentemente exclusivo às pilhas vivas in-culturing, e a incorporação de análogos do nucleosídeo em transcritos recentemente sintetizados é propenso a produzir a polarização onde o RNA interage fisicamente com a proteína23,24. No iCLIP, apenas um único adaptador é ligado à extremidade 3 ' de fragmentos de RNA reticulado. Após a transcrição reversa (RT), ambos os cDNAs truncados e lidos são obtidos por circularização intramolecularmente e relinearização seguida pela amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR)25,26. Entretanto, a eficiência da circularização intramolecular é relativamente baixa. Embora os protocolos mais velhos do grampo precisem de etiquetar do RNA reticulado com um radioisótopo, reticulação ultravioleta e purificação da afinidade (uvCLAP), com um processo de purificação em tandem estrita da afinidade, não confia na radioactividade27. Não obstante, uvCLAP é limitado às pilhas cultivadas que devem ser transfected com o vetor da expressão que carreg a etiqueta de 3x FLAG-HBH para a purificação em tandem da afinidade.
Em eCLIP, os adaptadores foram ligados primeiramente na extremidade 3 ' do RNA seguido pelo RT, e em seguida na extremidade 3 ' dos cDNAs em uma modalidade intermolecular. Assim, o eCLIP é capaz de capturar todos os cDNA28truncados e lidos. Além disso, não é restrito à rotulagem radioativa, nem ao uso de linhas celulares com base em seu princípio, mantendo a resolução de nucleotídeo único.
Aqui, nós fornecemos uma descrição passo a passo de um protocolo eCLIP adaptado para testagem do mouse. Momentaneamente, este protocolo de eCLIP começa com reticulação UV de tubules testicular, seguidos pela digestão parcial de RNase e pela imunoprecipitação usando um anticorpo proteína-específico. Em seguida, o RNA proteína-ligado é dephosphorylated, e o adaptador é ligado a sua extremidade 3 '. Após a electroforese do gel da proteína e a transferência da gel-à-membrana, o RNA é isolado cortando a área da membrana de uma escala esperada do tamanho. Após RT, o adaptador do ADN é ligado à extremidade 3 ' do cDNA seguido pela amplificação do PCR. O rastreamento de subclones antes do sequenciamento de alta taxa de transferência é tomado como um controle de qualidade de biblioteca. Este protocolo é eficiente na identificação das principais espécies de RNA proteico-dependente de RBPs, exemplificada pelos dois testamentos expressando RNA helicases MOV10L1 e MOV10.

<table><tbody><tr><td><forte>Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-camundongo MOV10&nbsp; anticorpo</td><td>Proteintech, China</td><td>10370-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo MOV10L1</td><td>Zheng et al.20109</td><td>polyclonal anti-soro UP2175</td><td>fornecido pelo laboratório P. Jeremy Wang, Universidade da Pensilvânia</td></tr><tr><td>HRP Goat Anti-Rabbit IgG&nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Beyotime, China</td><td>A7016</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier digital</td><td>BRANSON, EUA</td><td>BBV12081048A</td><td>450 Watts; 50/60 Hz</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini Módulo Blot</td><td>Invitrogen,USA</td><td>B1000</td><td></td></tr><tr><td>Mini Gel Tank</td><td>Invitrogen,USA</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora vibratória</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td>Conforto do Thermomixer&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Moedor de Tecidos, Dounce</td><td>PYREX, USA</td><td>1234F35</td><td>apenas&nbsp; o pilão "solto" é usado neste protocolo</td></tr><tr><td>TProfessional standard 96 Gradient</td><td>Biometra, Alemanha</td><td>número de série: 2604323</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver&nbsp;</td><td>Cristal, EUA</td><td>número de série: 3406051</td><td></td></tr><tr><td>Reticulador de luz UV</td><td>UVP, EUA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Prato de Cultura tratado com TC</td><td>Corning, EUA</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos</td><td>Corning, EUA</td><td>430791</td> Tubos de microtubos de <td>15 mL</td></tr><tr><td></td><td>AXYGEN, EUA</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><forte>Reagentes&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido fenol/clorofórmio/álcool isoamílico&nbsp;</td><td>Solarbio, China</td><td>P1011</td><td>25:24:01</td></tr><tr><td>AffinityScript Enzima</td><td>Agilent, EUA</td><td>600107</td><td></td></tr><tr><td>Antioxidante</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alfa; bactérias competentes</td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>18265017</td><td>essas células econômicas rendem >1 x 106 transformantes/&micro; g DNA de controle por 50 &micro; L.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>10416014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A&nbsp;</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>ECL reagente</td><td>Vazyme, China</td><td>E411-04</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>coquetel de inibidores de protease livre de EDTA</td><td>Roche, EUA</td><td>04693132001</td><td>adicionar fresco</td></tr><tr><td>Exo-SAP-IT</td><td>Affymetrix, EUA</td><td>78201</td><td>Reagente de limpeza de produto PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzima FastAP</td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>EF0652</td><td></td></tr><tr><td>LDS Sample Buffer</td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose&nbsp;</td><td>lonza, Suíça</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Extração de gel MiniElute</td><td>QIAGEN, Alemanha</td><td>28604</td><td>armazenamento de coluna a 4 ?; tampão QG=tampão de dissolução de gel; tampão PE= tampão de lavagem (para a etapa 14)</td></tr><tr><td>MyONE Grânulos de silano</td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>37002D</td><td>extração de ácidos nucléicos grânulos magnéticos</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, EUA</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Protein Gels</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>NP0336BOX</td><td>4%&ndash; 12%,1,5 mm, 15 poços</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Kit de Tampão&nbsp;</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>NP0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, EUA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Gel de Fase Bloqueada (PLG) tubo pesado&nbsp; &nbsp;</td><td>TIANGEN, China</td><td>WM5-2302831</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems, EUA</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB, Nova Inglaterra&nbsp;</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 PCR master mix&nbsp;</td><td>NEB, Nova Inglaterra&nbsp;</td><td>Tampão M0492L</td><td></td></tr><tr><td>RLT</td><td>QIAGEN, Alemanha</td><td>79216</td><td>Tampão de lise de purificação de RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>RNA Limpo & Concentrador-5 colunas&nbsp;</td><td>ZYMO RESEARCH, EUA</td><td>Colunas de purificação e concentração de RNA</td><td>R1016</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase</td><td>Promega, EUA</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNase</td><td>Promega, EUA</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Agente Redutor de Amostra</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Solução SDS</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>15553027</td><td>10%</td></tr> <tr><td>de desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>30970</td><td>proteger de </td></tr><tr><td>enzima PNK</td> leve <td>T4 NEB, Nova Inglaterra&nbsp;</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligase 1 alto conc</td><td>NEB, Nova Inglaterra&nbsp;</td><td>M0437M</td><td></td></tr><tr><td>TA/Blunt-Zero Cloning Mix</td><td>Vazyme, China</td><td>C601-01</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI Buffer</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Filmes de raios-X</td><td>Caresteam, Canadá</td><td>6535876</td><td></td></tr></tbody></table>

método avançado da imunoprecipitação da reticulação (eclip) para a identificação eficiente do rna proteína-ligado no testis do rato

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

A espermatogênese define um processo altamente ordenado de diferenciação de células germinativas masculinas em mamíferos. No testis, a transcrição e a tradução são desacopladas, sublinhando a importância da regulação pós-transcripcional da expressão gênica orquestrada por RBPs. Para elucidar papéis mecanísticos de um RBP, a metodologia da imunoprecipitação da reticulação (grampo) pode ser usada para capturar seus alvos diretos endógenos do RNA e para definir os locais reais da interação. O grampo realçado (eCLIP) é um método recentemente desenvolvido que ofereça diversas vantagens sobre os grampos convencionais. No entanto, o uso do eCLIP foi até agora limitado a linhas de célula, chamando para aplicativos expandidos. Aqui, nós empregamos eCLIP para estudar MOV10 e MOV10L1, dois helicases conhecidos do RNA-emperramento, no testis do rato. Como esperado, nós encontramos que MOV10 se liga predominantly a 3 ' as regiões Untranslated (UTRs) de mRNA e MOV10L1 ligam seletivamente às transcrições do precursor do RNA Piwi-interagindo (piRNA). Nosso método eCLIP permite a determinação rápida de espécies de RNA principais vinculadas por vários RBPs através de sequenciamento em pequena escala de subclones e, portanto, disponibilidade de bibliotecas qualificadas, como um mandado para prosseguir com sequenciamento profundo. Este estudo estabelece uma base aplicável para eclip no testis mamíferos.

O procedimento eclip e os resultados são ilustrados na figura 1, figura 2, figura 3, Figura 4. Camundongos foram eutanasiados com dióxido de carbono e uma pequena incisão foi feita no abdome inferior por meio de tesoura cirúrgica (Figura 2a,...

Aqui, nós apresentamos um protocolo de eCLIP para determinar alvos principais do RNA de candidatos do RBP no testis.

Método avançado da imunoprecipitação da reticulação (eCLIP) para a identificação eficiente do RNA proteína-ligado no testis do rato

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

Proteínas de ligação de RNA são essenciais para a fisiologia celular. É importante ressaltar que o RBP é altamente expresso ao longo da espermatogênese e tem sido bem documentado como reguladores pós-transcrição essenciais durante todas as fases das células germinativas. A identificação de alvos vinculantes é fundamental para elucidar os papéis mecanicistas do RBP.Este protocolo representa uma aplicação adaptada do método eCLIP para capturar alvos rna diretos endógenos e estabelece uma base aplicável para eCLIP em testíase de mamíferos. A principal vantagem deste método é que ele não é radioativo, menos demorado, e fornece uma relação sinal-ruído mais forte, porque a entrada compatível com o tamanho servirá como um fundo apropriado para alvos autênticos. Por último, achamos que o sequenciamento em pequena escala de subclonas é útil para seguir o sequenciamento profundo.Demonstrando o procedimento será Xu Qiushi, meu colega. Para iniciar este procedimento, colher cerca de 100 miligramas de testículos de camundongos de idade apropriada para cada experimento de imunoprecipitação. Coloque os tecidos em PBS gelado.Usando um par de pinças finas, remova suavemente a tunica albuginea. Adicione três mililitros de PBS gelado a um moedor de tecido, e use um pilão de vidro solto para triturar o tecido por força mecânica leve. Em seguida, transfira a suspensão do tecido para um prato de cultura celular, e adicione PBS gelado até seis mililitros.Agite a placa rapidamente para que o líquido cubra o fundo do prato uniformemente. Cruze a suspensão no gelo três vezes com 400 milímetros por centímetro ao quadrado a 254 nanômetros. Certifique-se de misturar a suspensão entre cada irradiação.Em seguida, recolhe a suspensão em um tubo cônico de 15 mililitros, e centrífuga a 1.200 vezes g e a quatro graus por cinco minutos. Remova o supernatante e resuspense a pelota em um mililitro de PBS. Depois disso, transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Centrifugar a 1.000 vezes g e a quatro graus Celsius por dois minutos, e descartar o supernaspe. Primeiro, adicione 125 microliters de proteína A contas magnéticas por amostra a um tubo de centrífuga fresco. Coloque o tubo sobre o ímã para separar as contas da solução.Após 10 segundos, remova o supernasciente e lave as contas duas vezes com um mililitro de tampão de lise gelada. Resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de lise fria com 10 microgramas de anticorpo eCLIP. Gire os tubos em temperatura ambiente por 45 minutos.Em seguida, lave as contas duas vezes com um mililitro de tampão de lise gelada. Para começar, resuspenque as pelotas de tecido em um mililitro de tampão de lise fria contendo 22 microliters de coquetel inibidor de proteína livre de 50x EDTA e 11 microliters de inibidor de RNase. Continue ingindo as amostras no gelo por 15 minutos.Sonicate cada amostra conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione quatro microliters de DNase a cada tubo e misture bem. Incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos enquanto treme a 1.200 rpm.Depois disso, adicione 10 microliters de RNase diluído e misture bem. Incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos enquanto treme a 1.200 rpm. Em seguida, centrífuga a 15.000 vezes g e a quatro graus Celsius por 20 minutos para limpar o lysate.Colete cuidadosamente o supernasário e guarde amostras de entrada para amostras de RWB e RRI. Primeiro, adicione um mililitro do lysate às contas preparadas, e gire as amostras a quatro graus Celsius durante duas horas ou durante a noite. Depois disso, colete as contas com um suporte magnético, e descarte o supernatante.Lave as contas duas vezes com 900 microliters de tampão de sal alto e depois lave as contas duas vezes com 900 microliters de tampão de lavagem. Em seguida, lave as contas uma vez com 500 microliters de 1x tampão de desfosforilação. Primeiro, descarte o supernaspe e use pontas finas de pipeta para remover qualquer líquido residual.Adicione 25 microliters de mistura mestre de ligadura de três primes a cada amostra e cuidadosamente pipeta para misturar. Adicione 2,5 microliters do adaptador RNA X1A e 2,5 microliters do adaptador RNA X1B a cada amostra. Misture cuidadosamente por pipetar ou piscar.Incubar a 25 graus Celsius por 75 minutos, certificando-se de mexer o tubo para misturar a cada 10 minutos. Lave as contas uma vez com 500 microliters de tampão de lavagem a frio. Em seguida, lave as contas uma vez com 500 microliters de tampão frio de sal alto e, em seguida, com 500 microliters de tampão de lavagem a frio.Repita as duas lavagens mais uma vez. Separe magneticamente as contas e use pontas finas de pipeta para remover qualquer líquido residual. Resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de lavagem a frio, e mova 20 microliters para novos tubos como amostras de RWB.Adicione 7,5 microliters de tampão de amostra 4x LDS e três microliters de 10x agente redutor de amostras às amostras restantes. Incubar a 70 graus Celsius por 10 minutos enquanto treme a 1.200 rpm. Depois disso, esfrie as amostras no gelo por um minuto, e centrífuga a 1.000 vezes g e a quatro graus Celsius por um minuto.Para gel RWB, coloque tubos em um ímã e eluvar proteínas separadas das contas. Carregue 15 microliters de amostra em cada poço. Em seguida, adicione 500 microliters de antioxidante a 500 mililitros de 1x SDS em execução tampão.Execute o gel a 200 volts, 1x SDS executando buffer por 50 minutos ou até que a frente de corante esteja na parte inferior. Transfira os complexos de proteína-RNA do gel para uma membrana nitrocelulose a 10 volts por 70 minutos em 1x de tampão de transferência com 10% de metanol. Bloqueie a membrana RWB em 5% de leite em TBST à temperatura ambiente por uma hora.Enxágüe a membrana em TBST e incubar com anticorpo primário em TBST durante a noite a quatro graus Celsius. Depois disso, lave duas vezes com TBST, com cada lavagem com duração de cinco minutos. Incubar com anticorpo secundário em TBST à temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, lave a membrana três vezes com TBST. Em seguida, misture volumes iguais de buffer ECL A e buffer B.Adicione essa mistura à membrana e incubar por um minuto. Cubra a membrana com plástico e exponha-a a uma película de raio-x à temperatura ambiente por dois a três minutos antes de desenvolver o filme.Neste estudo, o eCLIP MOV10 em testículos de camundongos adultos com RNase I tratando o lisato interligado, a proteína alvo, que é de aproximadamente 114 kilodaltons, é enriquecida com sucesso. Os resultados qPCR do CDNA diluídos de 1 a 10 de várias amostras revelam que amostras não cruzadas mostram diminuição da recuperação do RNA. Observa-se que os valores ct do grupo não-transligado são geralmente cinco vezes mais do que o grupo UV-crosslinked.Os resultados representativos para amplificação pcr e seleção de tamanho através da eletroforese de gel agarose são mostrados aqui. O produto primer-dimer aparece em cerca de 140 pares de base. A visão do Navegador de Genoma do UCSC de duas sequências de subclone representativas mostra que as tags eCLIP vinculadas a MOV10 estão localizadas dentro do UTR de três primes do gene Fto.A taxa aproximada de metas UTR de três primes é consistente com a maioria dos alvos MOV10 em células HEK293 e em testículos. Em contraste, as tags eCLIP com destino a MOV10L1 estão localizadas dentro de um cluster piRNA, indicando que mOV10L1 tem como alvo os precursores do piRNA. A taxa aproximada das metas precursoras do piRNA representa 42% que refletem uma tendência de estudos anteriores.MOV10L1 eCLIP com digestão RNase I de 40 unidades por mililitro produz relativamente mais sequências com menos de 20 pares de base. Este protocolo descrito aqui representa um emprego do método eCLIP na reprodução, uma área em que o conhecimento de interação RNA-RBP é bastante insuficiente.

enhanced-crosslinking-immunoprecipitation-eclip-method-for-efficient

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O arranjo espacial de RNA-proteínas que se ligam em uma transcrição é um determinante-chave de regulação pós-transcricional. Por isso, desenvolvemos individuais de nucleotídeo crosslinking UV resolução e imunoprecipitação (iCLIP) que permite o mapeamento do genoma precisa dos sítios de ligação de uma proteína RNA-binding.

iCLIP - Transcriptoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-RNA com a Resolução Nucleotide Individual

Um passo a passo para protocolo de isolamento e identificação de RNA complexos associados através de RIP-Chip.

Método para o isolamento e identificação de mRNAs, microRNAs e componentes proteicos de complexos de ribonucleoproteínas de extratos celulares utilizando RIP-Chip

Este vídeo demonstra o método de imunoprecipitação de reticulação aprimorada (eCLIP) para identificar proteínas de ligação a RNA em testículos de camundongos. O eCLIP permite a identificação precisa de locais de ligação onde as proteínas de ligação a RNA (RBPs) interagem com seus RNAs alvo.

Um método aprimorado de imunoprecipitação de reticulação para identificação eficiente de RNA ligado a proteínas em testículos de camundongos

Este manuscrito descreve uma abordagem para isolar RNPs cognatos selecionados formados em células eucarióticas por meio de um enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos específicos. Demonstramos a aplicabilidade dessa abordagem isolando um RNP cognato ligado à região retroviral 5' não traduzida que é composta por DHX9/RNA helicase A.

Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Um procedimento de isolamento de RNA em tandem (viagem) para recuperação de complexos mRNA-proteínas endogenamente formado é descrito. Especificamente, complexos de RNA-proteína são quitosana na vivo, polyadenylated RNAs são isolados de extratos com grânulos de oligo (descolamento) e particulares mRNAs são capturados com modificados oligonucleotides antisentidos do RNA. Proteínas vinculadas a mRNAs são detectadas pela análise de immunoblot.

Um procedimento de isolamento de RNA em Tandem do Oligonucleotide-baseado para recuperar complexos mRNA-proteínas eucariotas

Aqui, nós apresentamos um protocolo para enriquecer locais de ligação do RNA endógeno ou "pegadas" de complexos do RNA: proteína (RNP) das pilhas de mamífero. Essa abordagem envolve duas imunoprecipitações de subunidades de RNP e, portanto, é apelidado de imunoprecipitação de RNA em tandem (RIPiT).

Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

Aqui apresentamos um protocolo clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq com purificação de tandem FLAG-biotin para determinar os alvos do RNA de proteínas de ligação de RNA (RBPs) em células de mamíferos.

Transcriome-Wide Perfil de Interações Protein-RNA por Cross-Linking e Imunoprecipitação Mediada pela Flag-Biotin Tandem Purification

Aqui, descrevemos a imunoprecipitação de ribossomos e o RNA associado de populações selecionadas de células de germes de camundongos machos adultos usando o sistema RiboTag. A reprodução estratégica e a imunoprecipitação cuidadosa resultam em resultados limpos e reprodutíveis que informam sobre o traduzo meme das células germinativas e fornecem uma visão dos mecanismos dos fenótipos mutantes.

Imunoprecipitação ribotag nas células germinativas do rato macho

Aqui, apresentamos um método in vitro otimizado para descobrir, quantificar e validar interatores proteicos de sequências específicas de RNA, usando extrato proteico total de células humanas, esferas de estreptavidina revestidas com RNA biotinilado e análise por espectrometria de massas.

Uma Análise Pull-Down Quantitativa Otimizada de Proteínas Ligadoras de RNA Usando RNA Biotinilado Curto

Um método ChIRP baseado em UV para identificar interações diretas entre lncRNA e proteína.

Um método de ChIRP Baseado em UV para a Identificação Verificável de Proteínas que Interagem Diretamente com LncRNA: De Células Cultivadas a Testículos de Camundongos

Aprenda o método eCLIP para identificar alvos de RNA de proteínas de ligação em testículo de rato. Esta técnica não radioativa oferece maior especificidade e eficiência na análise de regulação pós-transcricional durante a espermatogênese.

Método avançado da imunoprecipitação da reticulação (eCLIP) para a identificação eficiente do RNA proteína-ligado no testis do rato (Vídeo) | JoVE Journal

Método avançado da imunoprecipitação da reticulação (eCLIP) para a identificação eficiente do RNA proteína-ligado no testis do rato

Explorar mais vídeos