Name: Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Aprenda a preparar secções retinianas congeladas de rato para imunohistoquímica, incluindo dissecação ocular, fixação e corte em criostato. Este protocolo preserva estruturas celulares essenciais para análise neurocientífica detalhada.

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Este trabalho foi apoiado por fundos da NIH (RO1-GMO97327) e da Fundação de pesquisa universitária (UPenn). Agradecemos especialmente Svetlana Savina por sua ajuda no desenvolvimento do protocolo de imuno-histoquímica, Gordon Ruthel (Universidade da Pensilvânia) e do Penn vet Imaging Core para assistência com microscopia e Leslie King, Ph.D. para leitura crítica deste manuscrito .

Todos os métodos aqui descritos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do guia nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório fornecidos pelo Instituto de recursos animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade da Pensilvânia.
Todas as ferramentas e equipamentos para os métodos são mostrados na Figura 1 e listados na tabela de materiais.
1. Enucleation do olho do rato, dissecção do copo do olho, e incorporação
<ol><li>Eutanizar camundongos com dióxido de carbono (CO2) seguido de decapitação (camundongos pós-natal P0-P11) ou luxação cervical (camundongos adultos > P11). Para os ratos P0-P14, os olhos são cobertos pela pele. Certifique-se de remover a pele antes das etapas subsequentes.</li>
	<li>Marque a parte temporal do olho (Figura 2a), queimando levemente a córnea usando um cauterizador de cauda. Evite queimar um furo na córnea tocando a córnea muito levemente e para não mais do que uma fração de segundo com o cauterizador.</li>
	<li>Imediatamente enuclear olhos do rato usando curvo Dumont #5/45 fórceps. Incubar durante 15 min em um tubo de 1,5 ml de criotubo com 1 ml de paraformaldeído de 4% (PFA) em Saline fosfato-tamponado (PBS) no gelo.</li>
	<li>Após 15 min em 4% PFA, transfira o olho fixo usando o fórceps curvado Dumont #5/45 a um prato modificado da dissecção de 35 milímetros (veja a tabela dos materiais e a Figura 1C) enchido com o PBS e o lugar o microscópio de dissecação.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão na marca de queimadura, perpendicular a e logo acima do limbus (borda da córnea) usando a micro faca.</li>
	<li>Insira a tesoura curvada na incisão e realize um corte circunferencial da córnea seguindo o limbo (Figura 2b).</li>
	<li>Retire a córnea e extraia a lente com um fino #5 fórceps de Dumont, (Figura 2b) e levante-o delicadamente afastado da parcela do posterior do olho. O corpo vítreo, o gel desobstruído que enche o espaço entre a lente e o retina, virá para fora com a lente (Figura 2b) e o retina será visível como uma superfície branca que cobre o interior do copo do olho do posterior. Certifique-se de que não há danos visíveis na retina, como furos ou lágrimas (Figura 2C).</li>
	<li>Lave os copos de olho duas vezes em 1 mL de PBS por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Cryoprotect os copos do olho equilibrando os em uma solução de sacarose de 15% em PBS durante a noite em 4 ° c até que o copo do olho sumidouros</li>
	<li>Transfira os copos do olho à sacarose de 30% em PBS para 2-3 h até que o copo do olho sumidouros.</li>
	<li>Incorporar os copos de olho em OCT em 10 x 10 mm crimológicos (Figura 3a). Usando um microscópio de dissecação, Oriente o olho no cryomold ao longo de seu eixo dorsal-ventral (Figura 2D, Figura 3a) girando o olho até que a marca da queimadura esteja na parte superior, o nervo ótico está na esquerda e a parte cortada do molde enfrenta a direita ( Figura 2D). Tome cuidado para evitar bolhas perto do tecido. Nota: para manipular o copo do olho, use uma ponta de prova Titanium feita de um fio Titanium Unido a uma ponta da pipeta.</li>
	<li>Para fixar-congelar o tecido retiniano, mergulhe o cryomold por pelo menos 5 minutos em um copo do metal que contem o isopentano e coloc a taça no nitrogênio líquido ou no banho seco do etanol do gelo/100% (até 1/3 da altura da Taça do metal). Nota: o cryomold deve ser imergido em isopentano para maior que a metade de sua altura, mas não tem que ser completamente submerso.</li>
	<li>Retire o bloco congelado e enrole-o em folha de alumínio.</li>
	<li>Conservar a-80 ° c.</li>
	<li>Marque o bloco congelado usando uma caneta ou Sharpie para registrar a orientação do bloco (Figura 3B).</li>
</ol>2. Seccionamento usando um criostat
<ol><li>Após ajustar a temperatura do criostato (entre-20 e-25 ° c), permita que os moldes que contêm os copos incorporados do olho equilibrem à temperatura do criostato para 1 h.</li>
	<li>Instale o bloco com orientação dorso-ventral (Figura 3C) e corte 10 μm de espessura de seções seriais. Coloc com cuidado as seções retinal em corrediças anotadas e numeradas do microscópio.</li>
	<li>Armazene slides em caixas de slides a-20 ° c ou-80 ° c até os procedimentos do IHC.</li>
</ol>3. Imunocoloração por fluorescência utilizando a cremalheira deslizante
Nota: o sistema da cremalheira de corrediça (por exemplo, Sequenza) prende as corrediças do microscópio de vidro com uma placa de tampa, criando um ~ 100 μL de abertura capilar entre a corrediça e a placa.
<ol><li>Descongelar as crio-secções à temperatura ambiente (RT) durante 2 h a 4 h para lhes permitir secar e fixar nas lâminas do microscópio. Nota: também é possível secá-los a 30-37 ° c durante 30 min a 1 h.</li>
	<li>Coloc corrediças na cremalheira de corrediça e lave as seções retinal duas vezes em 100-200 μL de PBS por 2 minutos.</li>
	<li>Permeabilize as secções retinianas incubando-as em 0,25% Triton-X/0, 5% NaN3em PBS durante 5 min em RT.</li>
	<li>Adicione 100 μL de solução de bloqueio aos slides.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de anticorpo primário diluído na solução de bloqueio para as lâminas.</li>
	<li>Incubar secções retinianas durante a noite a 4 ° c. Nota: durante este tempo, cubra o rack deslizante para evitar a dessecação das secções.</li>
	<li>Lave as secções retinianas 3 vezes, cada uma por 15 min, utilizando 200 μL de PBS. Nota: a adição de 0, 1-0, 2% Triton-X100 a PBS (PBS-T) permite uma lavagem mais rigorosa, mas pode interromper algumas membranas e estruturas celulares.</li>
	<li>Incubar seções retinianas em anticorpos secundários com rótulo fluorescente por 1 h em RT. A partir de agora Proteja-se da luz.</li>
	<li>Lave as secções retinianas 3 vezes, cada uma por 15 min.</li>
	<li>Incubar as secções retinianas em RT durante 5 min com um marcador nuclear como Hoechst 33342 ou solução DAPI.</li>
	<li>Lave as secções retinianas 1 vez durante 15 min.</li>
	<li>Coloque uma lamínula em cima de uma toalha de papel no banco de laboratório.</li>
	<li>Adicione 2 gotas de suportes de montagem antidesvanecimento ao centro da lamínula.</li>
	<li>Gire a corrediça sobre para ter a Cryo-seção retinal virada para baixo.</li>
	<li>Monte com cuidado a lamínula lentamente, em um ângulo de ~ 45 °, derrube o slide na mídia de montagem. Nota: evitando formando bolhas como você abaixar o slide no lugar.</li>
	<li>Aplique pressão mesmo, usando um livro pesado ou catálogo (veja abaixo), para a combinação de deslizamento de cobertura para eliminar o excesso de suportes de montagem. Nota: para garantir a consistência na preparação da amostra, sempre use o mesmo objeto, (ou seja, o mesmo livro ou catálogo) para aplicar até mesmo a pressão na lamínula durante a montagem do slide.</li>
	<li>Mantenha o plano e deixe endurecer durante a noite no RT no escuro. Armazene os slides horizontalmente a 4 ° c indefinidamente.</li>
	<li>Imagem via microscopia de fluorescência de campo largo ou confocal (Figura 4).</li>
</ol>

<ol><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelled+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li>
<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li>
<li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113(1945).</li>
<li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li>
<li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li>
<li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina%3A+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li>
<li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+%28Muller%29+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).</li>
<li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
</ol>

Sem divulgações.

A dissecção do retina do rato é um processo delicado devido ao tamanho e à forma pequenos de olhos do rato e à fragilidade do tecido retinal. Mesmo que a realização de dissecção de alta qualidade é uma questão de prática, tendo um protocolo detalhado, fornecendo métodos eficientes e dicas é uma necessidade para obter seções retinianas e IHC. Além do que os protocolos descritos aqui, há diversas pontas que permitem as seções retinal de alta qualidade consistentes que são apropriadas para o IHC reprodutível.
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Immunohistochemistry (IHC) é uma técnica poderosa para localizar proteínas e estruturas celulares específicas nos tecidos in situ1,2,3. Os métodos inadequados da fixação e o seccionamento secundário-optimal de tecidos complexos podem interromper a estrutura do tecido, gerar a mancha elevada do fundo ou diminuir interações do anticorpo-epítopo, tendo por resultado artefatos de coloração e conseqüente interpretação errónea de Dados IHC4. Como a retina de vertebrados é um órgão neural complexo e altamente organizado composto por estratos de fotorreceptores interligados, interneurônios e células ganglionares, é muito frágil e pode ser facilmente interrompido durante a dissecção e o corte. Um protocolo detalhado, padronizado, e validado da dissecção do olho do rato e a orientação à imunomarcação ajudarão significativamente a reduzir artefatos de IHC, desse modo, aumentando a confiabilidade dos resultados e permitindo dados comparativos mais precisos Análise.
Há muitos protocolos para a preparação do tecido para o IHC, entretanto, não todos são apropriados para o tecido retinal. Os fixadores fortes como o formalina de 10% ou a solução de Bouin preservam a estrutura retinal durante a dissecção e o corte5. Infelizmente, os fixadores fortes conduzem frequentemente à fluorescência aumentada do fundo e ao mascaramento do epítopo devido à modificação química dos resumos6. Por outro lado, os fixadores mais leves, como o paraformaldeído a 4% (PFA) podem aliviar alguns desses artefatos, mas necessitam de dissecção meticulosa e seccionamento para preservar a estrutura retiniana ideal. PFA penetra ràpida o tecido, mas as proteínas Cross-links muito lentamente, reduzindo o risco de mascarar do epítopo. Desde que a incubação do PFA do tempo curto é uma fixação relativamente suave, os tecidos exigem frequentemente o congelamento rápido preservar antígenos. É importante evitar a formação de cristais de gelo durante o congelamento tecidual, pois eles distorcem e danificam a integridade das células e dos tecidos7.
Aqui nós descrevemos protocolos detalhados e estandardizados para a dissecção, a fixação, e a Cryo-proteção de copos do posterior da ocular do rato que produzem dados consistentes e de confiança de IHC.

<table><tbody><tr><td>Copo de Aço Inoxidável 6qt. (185 x 218mm)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-48</td><td>Para nitrogênio líquido (Figura 1E)</td></tr><tr><td>Folha de alumínio&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cauterizador</td><td>Bovie</td><td>#AA01</td><td>Para marcar a orientação do olho (Figura 1A)</td></tr> <tr><td>Pinça curva, pinça Dumont # 5/45, dobra de 45 graus&nbsp;</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>#72703-D</td><td>Para enucleação e manutenção do olho do mouse (Figura 1A)</td></tr><tr><td>Tesoura curva, Tesoura de Mola Vannas - Borda de Corte de 2,5mm&nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp;</td><td>#15002-08</td><td>Para cortar circunferencialmente a córnea (Figura 1B)</td></tr><tr><td>Prato</td><td></td><td></td> de dissecação de 35mm revestido com cera dental <td>Para dissecção da ocular (Figura 1C)</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação&nbsp;</td><td>Leica, Houston, EUA&nbsp;</td><td>Facas Micro de Estereomicroscópio de Alto Desempenho MZ12.5</td> - Cabo de Plástico&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp;</td><td>#10315-12</td><td>Para fazer uma pequena incisão na marca de queimadura (Figura 1A)</td></tr><tr><td>Cera dental rosa&nbsp;</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica&nbsp;</td><td>#72660</td><td>Para prato de dissecação de revestimento</td></tr><tr><td>Slide Rack e Coverplate</td><td>Ted Pella</td><td>#36107</td><td>Para IHC retiniano (Figura 1G)</td></tr><tr><td>Copo de Aço Inoxidável (89 x 114mm)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-40</td><td>Para banho de isopentano (Figura 1E)</td></tr><tr><td>Caixa</td><td></td><td></td> de isopor <td>Para refrigerador isolado</td></tr><tr><td>Pinça fina Dumont #5&nbsp; &nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp;</td><td>#11254-20</td><td>Para remover a córnea e extrair a lente (Figura 1B)</td></tr><tr><td>Criomolde Tissue-Tek&nbsp; (10 mm x 10 mm x 5 mm)</td><td>Ciências da Necroscopia Eletrônica</td><td>#62534-10</td><td>Molde para incorporação OCT</td></tr><tr><td>Buffers e Reagentes</td><td>Company</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Solução de bloqueio</td><td></td><td></td><td>2% Soro de Cavalo Normal, 1.5% Gelatina de Pele de Peixe Frio (a 40-50% em H2O, #G7765 de gato), 5% de albumina de soro bovino (cat #AK1391-0100) em tampão de permeabilização.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Gelvatol (mídia de montagem anti-desbotamento)</td><td></td><td></td><td>Sob a capela de exaustão, dissolva 0,337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) em 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&nbsp; Ajuste para pH 8-8,5 com HCl 12N (~ 5 gotas).&nbsp; Armazene em frasco de gota âmbar a 4&deg; C&nbsp; (8).&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 1000x Stock</td><td>Thermo Scientific</td><td>#62249</td><td>1 mg/ml em PBS (1000x). Alíquota e loja no escuro, a 4&deg; C por até 1 ano ou a -20 graus; C para armazenamento de longo prazo. Prepare fresco&nbsp; a 1 ug/mL (1x)&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopentano, 99%&nbsp;</td><td>GFS Chemicals</td><td>#2961</td><td></td></tr><tr>Paraformaldeído de<td>Nitrogênio Líquido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(PFA) em Ciências</td> de <td>Microscopia Eletrônica PBS&nbsp;</td><td>#15710</td><td>Preparado fresco 4% PFA de 16% de estoque de PFA. Armazene os 16% restantes de PFA a 4&deg; C no escuro.&nbsp;</td></tr><tr>Solução <td></td><td></td> de <td>permeabilização</td><td>PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0,05% NaN3. Prepare fresco.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Bioworld&nbsp;</td><td>#41620015-20</td><td>0,02 g/L KCl, 0,02 g/L KH2PO4, 0,8 g/L NaCl, 0,216 g/L Na2HPO4 , pH 7,4.&nbsp; Preparado a partir de 10x estoque&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluções de sacarose</td><td>Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>#S-5-500</td><td>Dissolva a quantidade apropriada de sacarose em&nbsp; 37&nbsp; C PBS (leva ~ 15 min para dissolver). Pode ser armazenado por alguns dias a 4 graus Celsius.</td></tr><tr><td>Composto OCT Tissue-Tek&nbsp;</td><td>Sakura</td><td>&nbsp;#4583</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td>Company<</td><td>strong>Número de Catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>anti-calbindina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8666</td><td>Para rotular células horinzotais&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-GAD65</td><td>Chemicon</td><td>AB5082</td><td>Para rotular células amácrinas GABAérgicas</td></tr><tr><td>anti-GS</td><td>BD Transdução</td><td>610517</td><td>Para rotular M&uuml; células</td></tr><tr><td>de</td><td>Millipore</td><td>MAB5316</td><td>Para marcar bastonetes</td></tr></tbody></table>

preparação de cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

A preparação de seções de alta qualidade do olho do rato para immunohistochemistry (IHC) é crítica para avaliar a estrutura e a função retinal e para determinar os mecanismos que subjacentes doenças retinal. Manter a integridade estrutural durante toda a preparação do tecido é vital para obter dados reprodutíveis de IHC retinal mas pode ser desafiante devido à fragilidade e à complexidade da Citoarquitetura retinal. Os fixadores fortes como o formalina de 10% ou a solução de Bouin preservam otimamente a estrutura retinal, impedem frequentemente a análise de IHC realçando a fluorescência do fundo e/ou as interações dediminuição do anticorpo-epítopo, um processo sabido como o mascaramento do epítopo. Os fixatives mais leves, por outro lado, como o paraformaldeído a 4%, reduzem a fluorescência de fundo e o epitope-mascaramento, técnicas de dissecção meticulosa devem ser utilizadas para preservar a estrutura retiniana. Neste artigo, nós apresentamos um método detalhado para preparar copos do posterior da ocular do rato para o IHC que é suficiente preservar a maioria de interações do anticorpo-epítopo sem perda de integridade estrutural retinal. Nós incluímos IHC representativo com os anticorpos aos vários marcadores retinal do tipo da pilha para ilustrar a preservação e a orientação do tecido circunstâncias óptimas e suboptimal. Nosso objetivo é aperfeiçoar estudos de IHC do retina fornecendo um protocolo completo da dissecção do copo do posterior da ocular ao IHC.

Para ilustrar como estes protocolos, asseguram a preservação retinal óptima para IHC, nós sondado seções retinal dos ratos de P28 WT (C57Bl/6N) com os anticorpos ao rodopsina (um marcador do fotorreceptor)8, descarboxilase ácido glutâmico 65 (Gad65, uma pilha amacrina marcador)9, glutamina sintetase (GS, marcador de célula Müller)10, e calbindin (marcador de célula horizontal)11 (<strong class=...

Este relatório descreve métodos detalhados para preparar seções congeladas do retina do rato para immunohistochemistry (IHC). Os métodos descritos incluem dissecção do copo posterior ocular, fixação paraformaldeído, incorporação em meios de temperatura de corte ideal (OCT) e orientação tecidual, corte e imunocoloração.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

A dissecção da retina do rato é um processo realmente delicado devido ao tamanho e forma dos olhos e à fragilidade da seção de retina. Imperativo para a prática, ter um protocolo detalhado que forneça método e dicas eficientes é a chave para dissecção e seção de retina de alta qualidade. Fornecemos dicas e conselhos para ajudar o pesquisador a evitar armadilhas comuns e obter algumas seções de retina de alta qualidade adequadas para a imunohistoquímica.Marque a parte temporal do olho de um rato eutanizado usando um cauterizador de cauda tocando a córnea muito levemente e por não mais do que uma fração de segundo para queimar ligeiramente a córnea e evitar fazer um buraco. Logo depois, usou fórceps Dumont 545 curvas para enuclear os olhos do rato. Coloque os olhos em um criobote de 1,5 mililitro com um mililitro de 4%PFA e PBS e incubar por 15 minutos no gelo.Em seguida, transfira os olhos fixos usando os fórceps Dumont 545 curvos para um prato de dissecção modificado de 35 milímetros cheio de PBS e coloque sob microscópio dissecado. Use um microknife para fazer uma pequena incisão na marca de queimadura perpendicular para e logo acima da borda do limbus da córnea. Insira tesouras curvas na incisão e realize um corte circunferencial da córnea após o limbus.Em seguida, usando finas fórceps Dumont 5, remova a córnea, extraia a lente e levante-a delicadamente para longe da porção posterior do olho. O corpo vítreo sairá com a lente e a retina será visível como uma superfície branca cobrindo o interior do copo ocular posterior. Lave os copos de olho isolados duas vezes em um mililitro de PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.Para proteger crio-proteger os copos oculares, equilibre-os em 15% de sacarose e PBS durante a noite a quatro graus Celsius até afundarem. Em seguida, transfira os copos oculares para 30% de sacarose e PBS por duas a três horas até afundarem. Coloque os copos oculares em OUTUBRO em 10 por 10 milímetros crio-moldes para incorporar.Sob um microscópio dissecando, oriente o olho no crio-mold ao longo de seu eixo ventral dorsal girando o olho até que a marca de queimadura esteja em cima. O nervo óptico é um da esquerda e a parte cortada do molde fica de frente para a direita. Para quebrar o tecido da retina, mergulhe o crio-mold por pelo menos cinco minutos em um béquer de metal contendo isopéne e, em seguida, coloque o béquer em nitrogênio líquido até um terço da altura do béquer.Remova o bloco congelado, enrole-o em papel alumínio e armazene a menos 80 graus Celsius. Use uma caneta ou Sharpie para marcar o bloco congelado para registrar sua orientação. Depois de ajustar a temperatura criostat entre menos 20 e menos 25 graus Celsius, coloque os moldes contendo os copos oculares incorporados dentro e permita que eles se equilibrem à temperatura criostat por uma hora.Instale o bloco no criostat com a orientação ventral dorsal e comece a cortar seções de série de 10 micrômetros de espessura. Coloque cuidadosamente as seções de retina em slides de microscópio anotados e numerados e, em seguida, armazene em caixas de slides a menos 20 graus Celsius ou menos 80 graus Celsius até estar pronto para a imunossaturação. Imunohistoquímica com anticorpos para rhodopsina, um marcador fotorreceptor, descarboxilase de ácido glutamico 65, e marcador de células amacrinas, sintetizador de glutamina e marcador celular Muller, e calbinino, um marcador celular horizontal foi realizado em seções de retina.Os resultados indicam que este protocolo produz seções de retina de alta qualidade e bem preservadas, ao contrário de seções de retina de baixa qualidade obtidas a partir de um protocolo diferente. Os segmentos internos e externos ricos em rodopsina permanecem verticais e intactos com pouca ou nenhuma separação do epitélio pigmentado da retina. Os interneurônios, como as células amacrinas positivas Gad65, permanecem devidamente estratificados dentro da camada nuclear interna e da camada plexiforme interna.Além disso, as células Muller permanecem bem preservadas com soma devidamente alinhadas em processos citoplasmicos que se estendem desde a camada de células de gânglio até a camada nuclear externa. Além disso, células horizontais bem definidas são detectáveis na camada nuclear interna e na borda da camada plexiforme externa. É importante marcar a região do topper dos olhos e manter a orientação durante a incorporação.Prepare sempre paraformaldeído sob o capô com o equipamento de proteção individual adequado.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de ratos, remoção e corte do cérebro, bem como coloração por imunoperoxidase, a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame em microscopia eletrônica de transmissão.

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese...

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Vamos demonstrar três técnicas de preparação de tecidos diferentes para visualização de imuno-histoquímica de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.

Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

O objetivo deste relato é descrever o protocolo para a deteção de imuno-histoquímica robusto de marcadores epigenéticas, 5-metilcitosina (5mC) e 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) no desenvolvimento e postmitotic mouse retina.

Deteção de immunohistochemical da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina no desenvolvimento e Mouse Postmitotic Retina

Aqui apresentamos um protocolo para adaptar o método CLARITY dos tecidos cerebrais para retinas de montagem inteira para melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens de alta resolução de neurônios retinais e suas estruturas subcelulares.

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

Modelos murinos podem ser ferramentas úteis para investigar a biologia do epitélio pigmentado da retina (EPR). Foi estabelecido que camundongos podem desenvolver uma série de patologias do EPR. Aqui, descrevemos um protocolo de fenotipagem para elucidar e quantificar patologias do EPR em camundongos usando microscopia de luz, elétron de transmissão e confocal.

Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade

Este protocolo descreve as etapas detalhadas da microscopia imunoeletrônica pré-incorporada, com foco na exploração de circuitos sinápticos e localização de proteínas na retina.

Investigando circuitos retinianos e localização molecular por microscopia imunoeletrônica pré-incorporada

Os pericitos na vasculatura retiniana foram examinados por coloração imunofluorescente com receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β após injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate. A retina marcada foi posteriormente tratada com o método de limpeza de tecido e toda montada para visualizar as vistas tridimensionais dos pericitos ao redor da vasculatura retiniana sob um microscópio confocal.

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração 

Um protocolo para preparar criossecções de retina de camundongos e realizar imunocoloração em fotorreceptores é descrito. Este artigo permite que os pesquisadores produzam consistentemente seções congeladas de retina de camundongos com morfologia bem preservada e resultados de imunocoloração de alta qualidade.

Crioseccionamento e imunocoloração da retina de camundongos

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aprenda a preparar secções retinianas congeladas de rato para imunohistoquímica, incluindo dissecação ocular, fixação e corte em criostato. Este protocolo preserva estruturas celulares essenciais para análise neurocientífica detalhada.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

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