Name: Avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a avaliar o tônus vascular em artérias mesentéricas de camundongos usando miografia de fio, com foco na modulação pelo tecido adiposo perivascular. Este método permite estudar a função vascular em doenças cardiovasculares.

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Este trabalho foi financeiramente apoio pelas subvenções do Conselho de subvenção de investigação de Hong Kong [17124718 e 17121714], Hong Kong Health and Medical Research Fund [13142651 e 13142641], fundo de investigação colaborativa de Hong Kong [C7055-14G], e o National Basic Programa de pesquisa da China [973 Program 2015CB553603].

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Os autores não têm nada a revelar.

Aparte das pilhas endothelial, os sinais derivados do PVAT jogam um papel importante na regulação da reactividade do Tom de músculo liso30. O pvat saudável libera o não e o Adiponectina anti-inflammatory para exercer um efeito anticontractile nas artérias, que é perdida circunstâncias patológicas tais como a obesidade e a síndrome metabólica31,32. Nos Estados de doença, o pvat contribui para o desenvolvimento da disfunção endotelial e outr...

As dilatações e constrições das artérias são alcançadas por relaxações e contrações, respectivamente, de suas células musculares lisas vasculares. As alterações na responsividade vascular das pequenas artérias contribuem para a regulação homeostática da pressão arterial por nervos autonômicos e hormônios presentes no sangue (por exemplo, catecolaminas, angiotensina II, serotonina, vasopressina). No nível local, as respostas vasculares das células musculares lisas são moduladas por sinais de ambas as células endoteliais da íntima e do tecido adiposo em torno das artérias (Figura 1).
O endotélio não é apenas uma barreira passiva, mas também serve como uma superfície para trocar sinais entre o sangue e as células musculares lisas vasculares subjacentes. Ao liberar várias substâncias vasoativas, o endotélio desempenha um papel crítico no controle local das respostas do tônus vascular1. Por exemplo, em resposta à acetilcolina, o óxido nítrico sintase endotelial (Enos) é ativado no endotélio para produzir óxido nítrico (no), o que induz o relaxamento do músculo liso vascular subjacente ativando a guanil ciclase solúvel (SGC) 2. outras substâncias vasoativas incluem os produtos de ciclooxigenases (por exemplo, prostaciclina e tromboxano a2), lipoxigenase (por exemplo, ácidos 12-hidroxieticosatetraenoico, 12-Hete) e monooxigenases do citocromo P450 (hetes e ácidos epoxyeicosatrienoic, Eets), espécies reativas do oxigênio (ROS), e peptídeos vasoativas (por exemplo, endothelin-1 e angiotensina II), e fatores hiperpolarizante derivados do endothelium (edhf)3. Um delicado equilíbrio entre vasodilatadores derivados do endotélio e vasoconstritores mantém o Tom vasomotores local4,5.
A disfunção endotelial caracteriza-se pelo comprometimento da vasodilatação endotélio-dependente6, uma marca registrada do envelhecimento vascular7. Com a idade, a capacidade do endotélio de promover vasodilatação é progressivamente reduzida, devido em grande parte à diminuição da biodisponibilidade do no, bem como à expressão e função anormais de eNOS no endotélio e no sGC nas células musculares lisas vasculares8 , 9 anos de , 10. a redução da BIODISPONIBILIDADE não potenciou a produção de vasoconstritores dependentes do endotélio11,12. Nas artérias envelhecidas, a disfunção endotelial provoca hiperplasia nos meios de comunicação, como refletido pelos aumentos acentuados da espessura da parede, número de núcleos medial, que lembram o espessamento arterial na hipertensão e aterosclerose observada em humanos pacientes13,14. Além disso, condições fisiopatológicas como obesidade, diabetes ou hipertensão aceleram o desenvolvimento da disfunção endotelial15,16.
O tecido adiposo perivascular (PVAT) libera numerosas adipocinas para regular a estrutura vascular e a função17. O efeito anticontrátil do pvat é mediado por fatores relaxantes, como a adiponectina, não, o peróxido de hidrogênio e o sulfeto de hidrogênio18,19,20. No entanto, dependendo da localização e da condição fisiopatológica, o PVAT também pode aprimorar as respostas contráctil em várias artérias21. As substâncias pró-contrátil produzidas pelo pvat incluem a angiotensina II, a leptina, a resistina e as Ros22,23.  Na maioria dos estudos sobre vasos sanguíneos isolados, o PVAT tem sido considerado como um simples suporte estrutural para a vasculatura e, assim, removido durante a preparação dos segmentos de anel de vasos sanguíneos. Uma vez que a disfunção adiposa representa um fator de risco independente para hipertensão e complicações cardiovasculares associadas24, o pvat em torno dos vasos sanguíneos deve ser considerado ao investigar a responsividade vascular de diferentes artérias.
Os sistemas de múltiplos fios miográficos têm sido amplamente utilizados para investigar as funções vasomotoras de uma variedade de vasos sanguíneos, incluindo as artérias aorta, mesentérica, renal, femoral, cerebral e coronária25,26. Os protocolos aqui descritos utilizarão a miografia de arame para avaliar a responsividade vascular em artérias mesentéricas isoladas de modelos de camundongo geneticamente modificados, com foco especial na modulação por PVAT.

<table><tbody><tr><td>Acetilcolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625</td><td><forte>Concentração de estoque</forte>: 10-1 M Concentração de trabalho</forte>: 10-10 a 10-5 M</td></tr><tr><td>L-NAME (N&omega;-nitro-L-arginina metil éster)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5751</td><td><forte>Concentração de estoque</forte>: 3 x 10-2 M <forte>Concentração de trabalho</forte>: 10-4 M</td></tr><tr><td>Fenilefrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6126</td><td><forte>Concentração de estoque</forte>: 10-2 M Concentração de trabalho</forte>: 10-10 a 10-5</td></tr><tr><td>M U46619 (9,11-dideoxi-9&alfa;,11&alfa; metanoepoxi prostaglandina F2&alfa;)</td><td>Enzo</td><td>BML-PG023-0001</td><td><forte>Concentração de estoque</forte>: 10-5 M <forte>Concentração de trabalho</forte>: 1-3 x 10-8 M Miógrafo</td></tr><tr><td>multifios</td><td>dinamarquês MyoTechnology (DMT)</td><td>620M</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 4/26</td><td>ADInstruments</td><td>ML848</td><td></td></tr><tr><td>Labchart7</td><td>ADInstruments</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Adipo-SIRT1 camundongos do tipo selvagem</td><td>Unidade de Animais de Laboratório, Universidade de Hong Kong</td><td>CULATR NO.: 4085-16</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri revestidas de silicone</td><td>MyoTechnology dinamarquês (DMT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fios de tungstênio</td><td>MyoTechnology dinamarquês (DMT)</td><td>300331</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas</td><td></td><td></td><td></td> cirúrgicas</tr></tbody></table>

avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

A responsividade do tônus vascular alterada aos estímulos fisiopatológicos contribui para o desenvolvimento de uma ampla gama de doenças cardiovasculares e metabólicas. A disfunção endotelial representa um grande culpado para a redução da vasodilatação e aumento da vasoconstrição das artérias. Tecidos adiposo (gordura) que cercam as artérias desempenham papéis importantes na regulação do relaxamento dependente do endotélio e/ou contração das células musculares lisas vasculares. As conversações cruzadas entre o endotélio e os tecidos adiposos perivasculares podem ser avaliadas ex vivo usando vasos sanguíneos montados por um sistema de miografia de arame. No entanto, devem ser estabelecidas definições ideais para as artérias derivadas de animais de diferentes espécies, idades, origens genéticas e/ou condições fisiopatológicas.

Exame das relações comprimento/tensão para obtenção do fator de normalização k
A quantidade de estiramento aplicada a um segmento do vaso influencia a extensão da interação da actina-miosina e, consequentemente, a força ativa máxima desenvolvida. Assim, para cada tipo de vaso sanguíneo, é necessário determinar a quantidade de estiramento necessária para a força ativa máxima para estudos de miografia ade...

O protocolo descreve o uso de miografia de arame para avaliar a tensão isométrica transmural de artérias mesentéricas isoladas de camundongos, com especial consideração da modulação por fatores liberados das células endoteliais e dos tecidos adiposos perivasculares.

Avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Protocolo muito rigoroso é necessário para que possamos comparar validamente os preparativos dos mesmos animais ou de diferentes animais ou artérias na presença ou ausência da gordura que os cerca ou na presença ou ausência do endotélio. A principal vantagem desta técnica experimental é que podemos comparar anéis da mesma artéria sob condição isométrica e, assim, validamente tirar conclusões sobre o impacto dos fatores experimentais que investigamos. Este protocolo fornece insights sobre a modulação da responsividade vascular por tecidos adiposos perivasculares de diferentes animais geneticamente modificados.Disfunções teciduais adiposas representam um fator de risco independente para a hipertensão arterial e suas complicações cardiovasculares associadas. Nosso miógrafo envolve múltiplas etapas complicadas que requerem extrema cautela em cada ponto para evitar danificar o vaso, especialmente durante a montagem, e para garantir que a nave responda adequadamente a vários estímulos. Inicie este procedimento com preparações e dissecção dos anéis arteriais mesenéricos descritos no protocolo de texto.Ligue o computador e abra o software de gravação de dados. Salve o experimento como um arquivo de dados de gráfico de laboratório com um novo nome para evitar substituir o arquivo de configuração original. Abra a janela de configurações de normalização e ajuste o fator K para um.Aceite os valores padrão para calibração de IPs, pressão de destino, tempo médio on-line e tempo de atraso. Clique bem para salvar as configurações. Selecione canais de interesse e insira o diâmetro do fio, os pontos finais do tecido e a leitura inicial do micrômetro na janela de normalização.Para iniciar o procedimento de normalização, aplique o primeiro estiramento passivo no vaso sanguíneo girando o parafuso do micrometro no sentido anti-horário. Depois de esperar três minutos para que a embarcação se estabilize, insira a nova leitura de micrômetro na janela de normalização. A tensão da parede é calculada automaticamente e mostrada como um ponto no gráfico.Após cada estiramento passivo, substitua o tampão de krebs de controle por um krebs de potássio alto iso-osmótico contendo 150 mililitros de potássio. Quando a contração atingir um platô em cerca de três minutos, registre a força ativa subtraindo a força passiva em cada trecho da força ativada do potássio. Calcule a tensão da parede, bem como os valores de circunferência interna.Remova a condição de potássio alto substituindo o tampão de potássio alto por um tampão de krebs fresco. Repita a lavagem por três vezes ao longo de cinco minutos. Repita as etapas de normalização induzindo trechos passivos seguidos de contração ativa em curvas alternativas até que a tensão ativa comece a diminuir.Lave bem o tampão de krebs de potássio alto e equilibre os preparos por mais 30 a 45 minutos. Redefinir as tensões basais a zero para que apenas as respostas ativas contratuais sejam registradas durante o experimento subsequente. Prepare e monte anéis arteriais emparelhados conforme descrito no protocolo de texto das seções adjacentes de cada artéria.Prepare um anel arterial com PVAT intacto e o outro com PVAT removido. Após a normalização, pré-contrate os segmentos arteriais com tampão de krebs de potássio alto adicionando 115 milialares de cloreto de potássio à câmara contendo krebs. Após a contração ao período do planalto, lave o potássio alto e substitua o tampão por um tampão de krebs aerado fresco.Repita a lavagem três vezes ao longo de cinco minutos. Repita a estimulação do cloreto de potássio e a lavagem três vezes e registre a resposta contracil máxima ao cloreto de potássio subtraindo a tensão da linha de base da tensão devido à estimulação do cloreto de potássio. Após a última contração e lavagem, reabasteca a câmara com tampão de krebs morno e aerado e deixe a artéria se recuperar por cerca de 30 minutos antes de realizar a próxima tarefa.A cada câmara, adicione quantidades cumulativas de fenilefrina para induzir os aumentos dependentes da concentração e a tensão isométrica das preparações quiescentes. Depois de adicionar a última dose de agonista, lave a droga completamente e reabasteça a câmara com tampão de krebs fresco. Plote as respostas dependentes da concentração como percentuais crescentes das contrações máximas induzidas pelo cloreto de potássio.Para avaliar a contribuição do óxido nítrico, incubar as preparações com o inibidor de sinthase de óxido nítrico L-NAME por 30 minutos antes da adição de fenilefrina. Para realizar uma segunda curva de resposta de concentração sequencialmente, lave a câmara completamente e repetidamente para remover todos os agonistas anteriores até que não sejam observadas mais alterações de tom. A normalização da relação comprimento-tensão foi realizada para artérias mesentéricas isoladas de modelos de camundongos alimentados com chow padrão ou uma dieta rica em gordura.Uma relação passivo de comprimento-tensão foi estabelecida pelo alongamento incremental dos segmentos da artéria até que uma circunferência interna correspondente a 100 milímetros de pressão transmural de mercúrio, ou IC100, foi obtida. Após cada trecho, 115 cloreto de potássio milimila foram aplicados para estimular contrações. As curvas de tensão de comprimento ativo foram traçadas a partir dos dados de força ativa no eixo Y e dos valores calculados de IC a partir dos dados do micrometro no eixo X.Um valor ic situado dentro do planalto máximo é IC1. O fator de normalização, K, foi calculado como a razão de IC1 e IC100, que poderia então ser aplicada a amostras do mesmo tipo de vaso no experimento subsequente. Aqui são mostradas gravações de saída das respostas vasoconstritores à fenilefrina em artérias mesentéricas com ou sem PVAT circundante.Concentrações cumulativas de fenilefrina foram aplicadas para estimular as contrações de artérias mesentéricas coletadas de um camundongo de 16 semanas. As respostas contratuais foram registradas e calculadas como uma porcentagem de 150 milimônios cloreto de potássio induzido contração máxima. A área sob as curvas de contração foi traçada para comparação.Note que pvat de adipose um camundongo provocou um efeito anticontile na resposta à fenilefrina. Ao obter contrações induzidas pelo KCL, as respostas devem ser estáveis e estáveis. Se a resposta ainda estiver aumentando após três administrações incrementais de KCL, a estimulação kcl pode ser necessária.Para alcançar as condições ideais das tensões, o passo de normalização é muito importante, pois determina a força para abrir os vasos sanguíneos. Se não for feito corretamente, afetará todo o experimento. Este protocolo pode ser aplicado a outras configurações, além de contração ou relaxamento induzido por fenilefrina.Por exemplo, na presença ou ausência de tecido adiposo perivascular, nervos autônomos ou endotélio. Com este protocolo, os pesquisadores podem examinar pequenos vasos sanguíneos de modelos animais doentes em diferentes condições fisiopatológicas, como obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método automatizado para medições Miografia vigor em artérias mesentéricas isoladas é descrito. Ele emprega um Mulvany-Halpern Auto Myograph fio duplo 510A para determinar as respostas à fenilefrina e cálcio extracelular. O método permite a determinação consistente de respostas isométrica aos agonistas em pequenos vasos de diâmetros de 60 - 300 mm, de forma independente.

A contração da artéria mesentérica e Estudos Relaxamento Usando Miografia Fio Automated

Miografia pressão é utilizado para avaliar a vasoactividade das pequenas artérias que se desenvolvem constrição prolongada quando pressurizado. Este manuscrito proporciona um protocolo detalhado para avaliar em segmentos isolados de pequenas artérias mesentéricas de ratos, vasoactividade e o efeito da pressão intraluminal no diâmetro vascular.

Avaliando Miogênica Resposta e vasoactividade em artérias mesentéricas de resistência Usando Miografia Pressão

O intestino delgado é freqüentemente expostos a toxinas que podem influenciar o fluxo sanguíneo e impactar negativamente a absorção de nutrientes. Usando uma artéria mesentérica e multimyograph e veia isolados, os compostos de interesse ou toxinas podem ser rastreados para a vasoactividade.

Isolando e com cortes de bovinos artéria e veia mesentérica como Bioassay teste para vasoactividade no intestino delgado

O presente artigo descreve as considerações metodológicas para várias avaliações não invasivas da função e morfologia vascular que são comumente usadas em pesquisas médicas para avaliar diferentes estágios da aterosclerose.

Uma abordagem metodológica para avaliações não-invasivas de função vascular e Morfologia

Vasodilatação induzida por insulina regula a perfusão muscular e aumenta o microvascular superfície (recrutamento microvascular) disponível para troca de soluto entre sangue e tecido do interstício. Combinado de microscopia intravital e ultra-sonografia contraste aprimorado é apresentado para avaliar simultaneamente a ação da insulina em vasos maiores e a microcirculação in vivo.

Combinado de microscopia Intravital e ultra-sonografia contraste aprimorado do membro posterior Mouse para estudar a vasodilatação induzida por insulina e perfusão muscular

Sistemas de tele-microscopia são usados para examinar as propriedades funcionais das arteríolas isoladas de tecido adiposo em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos. Esta técnica pode ser usada para examinar fenótipos microvasculares em domínios diferentes de tecido adiposo em seres humanos obesos.

Avaliação da função Microvascular de tecido adiposo humano usando tele-microscopia

Este manuscrito descreve em vitro protocolos de vídeo microscopia para avaliar a função vascular nas artérias de resistência cerebral de rato. O manuscrito também descreve técnicas para avaliar a densidade de microvessel com perfusão de lectina e tecido fluorescente etiquetada usando Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

Formação da embarcação de sangue novo e inervação simpática desempenham um papel crucial na remodelação do tecido adiposo. No entanto, subsistem questões técnicas em Visualizar e medir quantitativamente o tecido adiposo. Aqui nós apresentamos um protocolo para rotular com êxito e comparar quantitativamente as densidades de vasos sanguíneos e fibras nervosas em diferentes tecidos adiposos.

Co a coloração dos vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo

Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.

Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos

Este artigo apresenta um protocolo passo a passo para o isolamento e avaliação funcional de ramos arteriais renais humanos, facilitando estudos pré-clínicos para o desenvolvimento farmacêutico.

Microdissecção Multinível e Perfil Funcional-Estrutural de Ramos Arteriais Renais Humanos

Aprenda a avaliar o tônus vascular em artérias mesentéricas de camundongos usando miografia de fio, com foco na modulação pelo tecido adiposo perivascular. Este método permite estudar a função vascular em doenças cardiovasculares.

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Avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares

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