Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Este protocolo descreve um método para reprogramar células sanguíneas e mononucleares para células-tronco neurais que podem ser usadas para tratar doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson. Oferece uma fonte celular autóloga para tratar doenças neurodegenerativas. Além disso, o prazo necessário para a conversão para células-tronco neurais induzidas e a diferenciação para os tipos de células desejadas é menor do que para células-tronco pluripotentes induzidas.

As células-tronco neurais induzidas possuem uma boa capacidade proliferativa e podem ser ampliadas antes da aplicação. Uma vez que os iNSCs podem ser especificados em diferentes células neurais específicas da região, como neurônios da medula espinhal ou neurônios motores, este método pode ser estendido para o tratamento de outras doenças neurológicas. Todo o procedimento leva muito tempo, com todas as etapas relacionadas e críticas, então a demonstração visual dá uma ideia de como as células se parecem e fornece algumas dicas para garantir uma geração bem sucedida das células desejadas.

Para começar, transfira sangue venoso periférico previamente isolado em um tubo cônico de 50 mililitros, e dilui-o com um volume igual de PBS estéril de Dulbecco. Em outro tubo cônico de 50 mililitros, prepare 15 mililitros de gradiente de densidade esterilizada. Incline o tubo em um ângulo de 45 graus, e lentamente e cuidadosamente coloque 30 mililitros de sangue periférico diluído no meio gradiente de densidade.

Centrifugar o tubo a 800 vezes g por 15 minutos em temperatura ambiente com o freio centrífuga definido na posição desligada. Aspire a camada amarela de plasma superior e descarte-a. Use uma pipeta de 10 mililitros para transferir a camada de filme fina branca e nublada contendo células mononucleares para um novo tubo cônico de 50 mililitros.

Adicione 30 mililitros de D-PBS ao tubo com MNCs, e centrífuga a 600 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o supernasce, adicione 45 mililitros de D-PBS e resuspenque as células. Depois de centrifugar o tubo a 400 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius, descarte o supernasce.

Resuspend as células com cinco mililitros de D-PBS, conte as células vivas com o método de exclusão azul trypan, reserve os MNCs necessários para expansão e congele as células restantes para uso futuro. No dia menos 14, mNCs sementes a uma densidade de dois a três milhões de células por mililitro por poço de placa de seis poços com 1,5 mililitros de 37 graus Celsius, meio MNC pré-aquecido. Incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por dois dias.

No dia menos 11, use uma pipeta esterilizada para coletar as células com o meio e transferir para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar a 250 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente, descartar o supernaspeuta e resuspensar as células em um mililitro de meio MNC pré-aquecido. Depois de contar as células viáveis com azul trypan, semente os MNCs a uma densidade de um milhão de células por mililitro em meio MNC pré-aquecido em uma placa de seis poços.

Incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por três dias, e repetir a coleta de células, centrifugação e revestimento em mnc médio em dias menos oito e menos quatro. O vírus Sendai neste procedimento é perigoso, e todos os procedimentos envolvendo o vírus Sendai devem ser realizados em um gabinete de segurança. E todas as pontas e tubos expostos ao vírus Sendai devem ser tratados com etanol ou alvejante antes do descarte.

No dia zero, colete as células em meio MNC e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros. Depois de centrifugar as células a 200 vezes g por cinco minutos, aspire o supernaspe e resuspenda as células com um mililitro de meio MNC pré-aquecido. Conte as células viáveis com azul trypan, e depois resuspenque-as com meio MNC pré-aquecido para uma concentração de 200.000 células por poço em placas de 24 poços.

Descongele os tubos removidos do armazenamento Celsius de menos 80 graus contendo o vírus Sendai em um banho de água Celsius de 37 graus por cinco a 10 segundos, e depois deixe-os descongelar à temperatura ambiente. Uma vez descongelado, coloque-os imediatamente no gelo. Adicione o vírus Sendai descongelado aos poços da placa de 24 poços com MNCs em uma multiplicidade de infecção de 10.

Para facilitar a fixação das células, centrifugar as placas a 1.000 vezes g por 30 minutos e depois colocar as placas na incubadora a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. No primeiro dia, transfira as células com o tubo médio para uma centrífuga de 15 mililitros. Para desprender ainda mais as células restantes, enxágue os poços com um mililitro de mnc médio por poço e adicione as células com médio ao tubo.

Depois de centrifugar a suspensão celular a 200 vezes g por cinco minutos, aspirar o supernascer, resuspensar as células com 500 microliters de meio MNC pré-aquecido fresco, e adicionar a um poço de uma placa de 24 poços. No segundo dia, use um mililitro por poço de 50 microgramas previamente diluídos por microliter poli-D-lysine em D-PBS para revestir placas de seis poços por pelo menos duas horas em temperatura ambiente. Aspire poli-D-lysine a partir das placas de seis poços, e seque no banco vertical limpo por cerca de 10 minutos.

Em seguida, adicione um mililitro por poço de um anteriormente diluído cinco microgramas por mililitro laminina às placas de seis poços, e incubar por quatro a seis horas a 37 graus Celsius para revestir. Lave as placas com D-PBS antes de usar. No terceiro dia, todos os MNCs transduzidos pelo vírus Sendai em meio de células-tronco neurais induzidas nas placas de seis poços revestidas de poli-D/laminina.

Nos dias cinco e sete, adicione suavemente um mililitro de 37 graus Celsius, meio iNSC pré-aquecido para cada poço das placas de seis poços. Do dia 9 ao dia 28, substitua o meio por meio iNSC pré-aquecido fresco diariamente. Monitore o surgimento de colônias iNSC, e em cerca de duas a três semanas escolha colônias com morfologia apropriada usando pipetas de vidro queimados e transfira cada colônia para um poço separado de uma placa de seis poços para expansão.

Para estabelecer modelos unilaterais de camundongos com lesão de 6-hiroxidopamina, raspe a cabeça de um camundongo anestoizado, adulto, masculino, scid-bege, e aplique pomada ocular de eritromicina. Coloque o mouse no aparelho estereotax e conserte o mouse com barras incisivos. Insira os copos de ouvido corretamente para posicionar a cabeça do mouse de forma segura e adequada.

Esterilize a cabeça com iodo povidone e álcool isopropílico, e depois use uma lâmina de bisturi para fazer uma incisão sagital de aproximadamente 1,5 centímetros na pele da cabeça, expondo o crânio. Ajuste a barra incisora e as barras de ouvido para reduzir a diferença de altura entre bregma e lambda para menos de 0,1 milímetros. Mova-se lentamente e abaixe a ponta da agulha de microsinga em direção ao bregma, e trate a bregma como o ponto zero.

Mova a ponta para uma posição com coordenadas de 0,5 milímetros anteriores e 2,1 milímetros laterais em relação ao bregma. Retraia a ponta, marque o ponto com uma caneta marcadora e, com uma broca eletrônica, faça um pequeno buraco no crânio. Extraia dois microlitros de cinco microgramas por solução mililitro 6-hyroxydopamina na microsiringe.

Volte a agulha para o ponto marcado e insira a agulha em dorsais/ventral 3,2 milímetros. Injete a solução de 6-hyroxidopamina a partir da seringa a uma taxa de um microliter por minuto, deixe a agulha de injeção no lugar por mais cinco minutos e, em seguida, retraia-a lentamente. Depois de fechar a incisão com suturas, aplique pomada ocular de eritromicina nos olhos novamente.

Remova o mouse do aparelho estereotaxista, coloque-o na gaiola de recuperação e permita o acesso à comida e água até que ele recupere a consciência. Depois que os PBMNCs foram infectados com SeV, sua morfologia estava mudando e as células sofreram uma morte drástica até o quinto dia. As colônias do INSC surgiram no dia 12.

Depois de colher e transferir clones iNSC para expansão para uma série de passagens, eles mostraram uma boa morfologia e puderam se auto-renovar no meio iNSC, seja em uma forma monocamada ou como esferas. Após 24 dias de diferenciação, os iNSCs foram identificados como neurônios dopaminérgicos como a maioria deles expressos de hidroxilase de tyrosina, caixa de garfo A2 e marcadores beta-tubulin classe III específicos para neurônios. Após o estabelecimento de modelos unilaterais de parkinson com lesão de Parkinson, foi realizada avaliação comportamental para estimar os sintomas da doença de Parkinson.

Os camundongos que receberam transplante celular apresentaram melhora significativa na função motora. A extensão da lesão induzida por 6-hiroxidopamina foi verificada por coloração imunofluorescente pós-morte para TH no estriado, feixe de cérebro medial e substantia nigra pars compacta. Os sinais TH-positivos foram muito recuperados no estriado onde as células foram implantadas e também levemente recuperadas no SN. Três meses após o transplante, entre as células sobreviventes, cerca de 13,84% eram neurônios dopaminérgicos th positivos.

Cerca de 91,72% das células TH-positive expressaram receptor nuclear órfão, cerca de 86,76% expressaram FOXA2, e cerca de 98,77% foram co-rotuladas com potássio retificador para dentro acoplado à proteína G. Ao colocar 30 mil de sangue periférico diluído no meio gradiente de densidade, por favor, faça-o lentamente e cuidadosamente, para não perturbar a interface gradiente. Deve-se tomar cuidado para evitar o descongelamento repetido e o congelamento do vírus Sendai para garantir uma alta atividade do vírus.

Ao reprogramar células mononucleares de sangue periféricos para células-tronco neurais induzidas, observe de perto a morfologia das células todos os dias. Além disso, 6-hidroxidopamina é sensível à luz e temperatura. Tenha cuidado para proteger a solução da luz e mantê-la no gelo antes de usar.

Após este procedimento, pode-se continuar a estudar os mecanismos da doença usando neurônios dopaminérgicos derivados da DP na cultura. Pode-se também continuar a investigar como as células transplantadas influenciam os circuitos neuronais danificados.