Name: Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Aprenda a reprogramar células mononucleares do sangue periférico em células-tronco neurais induzidas usando vírus Sendai. Este método gera neurônios dopaminérgicos autólogos para tratamento da doença de Parkinson em modelos animais.

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O trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções: célula-tronco e tradução do projeto chave nacional (2016YFA0101403), Fundação Nacional de ciências naturais da China (81661130160, 81422014, 81561138004), Fundação Municipal de ciência natural de Pequim (5142005), Fundação dos talentos de Beijing (2017000021223TD03), projeto da sustentação de professores de nível elevado em universidades municipais de Beijing no período do 13º plano do cinco-ano (CIT & TCD20180333), concessão de talento de nível elevado do sistema médico de Beijing (2015-3-063), Beijing Fundo da Comissão Municipal de saúde (PXM 2018_026283_000002), Pequim 100, mil e 10000 fundo de talentos (2018A03), administração municipal de Pequim de hospitais de medicina clínica desenvolvimento de apoio especial de financiamento (ZYLX201706), e os Royal Society-Newton bolsa avançada (NA150482).

<ol><li>Williams-Gray, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+cognitive+syndromes+of+Parkinson%27s+disease%3A+5+year+follow-up+of+the+CamPaIGN+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort.</a> Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).</li>
<li>Dexter, D. T., Jenner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+disease%3A+from+pathology+to+molecular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms.</a> Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).</li>
<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Therapy+for+Parkinson%27s+Disease%3A+New+Hope+from+Reprogramming+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies.</a> Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Doi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+dopaminergic+progenitors+by+cell+sorting+for+successful+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li>
<li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li>
<li>Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Progress in the reprogramming of somatic cells.</a> Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+into+induced+neural+stem+cell+by+using+episomal+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors.</a> Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+precursors+differentiated+from+human+blood-derived+induced+neural+stem+cells+improve+symptoms+of+a+mouse+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model.</a> Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).</li>
<li>Bazley, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Human+Primordial+Germ+Cells+into+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Efficient+Generation+of+Genetically+Engineered+Germ+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells.</a> Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).</li>
<li>Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+urine+iPS+cell+lines+from+patients+with+Attention+Deficit+Hyperactivity+Disorder+%28ADHD%29+using+a+non-integrative+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).</li>
<li>Cho, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+primary+somatic+cells+by+OCT4+and+chemical+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).</li>
<li>Ono, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+neurogenic+potential+in+floor+plate+cells+along+an+anteroposterior+location%3A+midbrain+dopaminergic+neurons+originate+from+mesencephalic+floor+plate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells.</a> Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).</li>
<li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+functional+floor+plate+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).</li>
<li>Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rodent+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochirurgica+Supplements%22%5BJournal%5D)">Transgenic rodent models of Parkinson's disease.</a> Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).</li>
<li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+directly+from+mouse+fibroblasts+and+fibroblast-derived+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors.</a> Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).</li>
<li>Prasad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+induced+pluripotent+stem+cell%2C+direct+conversion+by+trans-differentiation%2C+direct+reprogramming+and+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation.</a> Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui nós apresentamos um protocolo que cobria estágios diferentes da terapia da pilha de iNSC-DA para modelos do paládio. Os aspectos críticos deste protocolo incluem: (1) isolação e expansão de pbmncs e reprogramação de pbmncs em inscs pela infecção de Sev, (2) diferenciação de inscs aos neurônios de da, (3) estabelecimento de modelos unilaterais do rato do PD 6-OHDA-lesioned e comportamento avaliação e (4) transplante celular de precursores DA DA e avaliação comportamental.
Neste protocolo, ...

A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa comum, causada pela degeneração dos neurônios dopaminérgicos (da) no substância negra nigra pars compacta (SNPC) no mesencéfalo ventral (VM), com uma prevalência de mais de 1% na população acima de 60 anos de idade 1. º , 2. ao longo da década passada, a terapia celular, destinada a substituir as células degenerativas ou danificadas, ou Nutrir o microambiente em torno dos neurônios degenerativos, mostrou potencial no tratamento de PD3. Enquanto isso, a tecnologia de reprogramação fez progressos significativos4, que fornece uma fonte celular promissora para a terapia de reposição. As pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) e as pilhas de haste embrionário (ESCS) foram provadas ser capazes de diferenciar-se em pilhas neural de da, que poderiam sobreviver, maturate, e melhorar as funções de motor quando enxertadas em ratos e em modelos não-humanos do PD do primata5 ,6,7,8. os iPSCs representam um marco nas tecnologias de reprogramação celular e têm um grande potencial de transplante celular; Entretanto, há ainda uma preocupação sobre o risco de formação tumoral a partir das células incompletamente diferenciadas. Uma fonte celular alternativa para o transplante de células é células-tronco adultas comprometidas por linhagem obtidas por meio de reprogramação direta, como células-tronco neurais induzidas (iNSCs), que podem ser derivadas dos intermediários instáveis, ignorando a pluripotência etapa9,10,11.
Tanto o iPSCs quanto o inscs podem ser reprogramados a partir de fontes celulares autólogas, como fibroblastos, células mononucleares do sangue periférico (pbmncs) e vários outros tipos de células12,13,14, reduzindo assim a imunogenicidade das células transplantadas em grande grau. Além disso, comparado com iPSCs, os iNSCs são inerentes com risco reduzido da formação do tumor e da plasticidade linhagem-comprometida, somente capaz de diferenciar-se em neurônios e em glia11. Nos estudos iniciais, os iPSCs humano ou camundongo e os inscs foram gerados a partir de fibroblastos obtidos a partir de biópsias cutâneas, o que é um procedimento invasivo14,15. Com este respeito, os PBMNCs são uma fonte de célula de partida atraente por causa do processo de amostragem menos invasivo, e a facilidade de obter um grande número de células dentro de um curto período de tempo de expansão16. Os estudos de reprogramação inicial empregaram sistemas integrativos de entrega, como vetores lentivirais ou anti-retrovirais, que são eficientes e fáceis de implementar em muitos tipos de células17; no entanto, esses sistemas de parto podem causar mutações e reativação de transgenes residuais, que apresentam problemas de segurança para fins terapêuticos clínicos12. O vírus de Sendai (SeV) é um vírus de RNA não integrativo com um genoma de sentido negativo, único que não se integra no genoma do hospedeiro, mas apenas Replica no citoplasma de células infectadas, oferecendo um veículo eficiente e seguro para reprogramar18 ,19. Os vetores de SeV recombinantes estão disponíveis que contêm fatores de reprogramação, incluindo OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-Myc humanos em seus quadros de leitura abertos. Além disso, os vetores virais SeV podem ser melhorados através da introdução de mutações sensíveis à temperatura, para que possam ser rapidamente removidas quando a temperatura da cultura é aumentada para 39 ° c20. Neste artigo, descrevemos um protocolo para reprogramar PBMNCs para iNSCs usando o sistema SeV.
Muitos estudos relataram a derivação dos neurônios da ESCS humana ou iPSCs usando vários métodos6,8,21. No entanto, há uma escassez de protocolos descrevendo a diferenciação de neurônios da da iNSCs em detalhes. Neste protocolo, descreveremos a geração eficiente de neurônios da do iNSCs usando um método de dois estágios. Os precursores neuronais DA DA podem ser transplantados para o estriado de modelos de mouse PD para avaliações de segurança e eficácia. Este artigo apresentará um protocolo detalhado que cubra vários estágios da geração de pilhas de haste neural induzidas pelo vírus de Sendai, diferenciação de inscs em neurônios da da, estabelecimento de modelos do PD do rato, à transplantação de precursores do da no estriado dos modelos de PD. Usando este protocolo, pode-se gerar iNSCs de pacientes e doadores saudáveis e derivar neurônios DA DA que são seguros, padronáveis, escalonáveis e homogêneos para fins de transplante celular, ou para modelar PD em um prato e investigação dos mecanismos início e desenvolvimento da doença subjacente.

<table><tbody><tr><td>Tubo cônico de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>1-Tioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Tóxico para inalação e contato com a pele</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Corning</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 ml&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>6-OHDA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4381</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>Reagente de dissociação celular</td></tr><tr><td>Apomorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4393</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A92902</td><td>Tóxico com contato com a pele&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>Fator neurotrófico derivado do cérebro</td></tr><tr><td>Tubos de coleta de sangue contendo heparina sódica</td><td>BD</td><td>367871</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>yisheng</td><td>36106es60</td><td>Soro bovino fetal</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>Dibutiriladenosina monofosfato cíclico</td></tr><tr><td>CellBanker 2</td><td>ZENOAQ</td><td>100ml</td><td>Usado como meio de congelamento para PBMNCs</td></tr><tr><td>Concentrado lipídico quimicamente definido</td><td>Invitrogen</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Gene Operation</td><td>04-0004</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>25 * 25-2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Peprotech</td><td>100-64-50UG</td><td>Eritropoietina Humana</td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>P=1.077, gradiente de densidade médio</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Fator neurotrófico derivado da glia</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td>100 &vezes; Solução conservada em estoque da glutamina</td></tr><tr><td>Ham's-F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175079</td><td>Solução de sal</td></tr><tr><td>equilibrada Fator inibidor da leucemia humana</td><td>Millpore</td><td>LIF1010</td><td></td></tr><tr><td>SCF recombinante humano</td><td>Peprotech</td><td>300-07-100UG</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100UG</td><td>Insulina-como o crescimento humano fator&nbsp;</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10UG</td><td>Interleucina humana 3</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>215056-023</td><td>Iscove's modified Dulbecco's medium</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>12585014</tr><tr><td>ITS-X</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>Suplemento de insulina-transferrina-selênio-X</td></tr><tr><td>Substituição do soro</td><td>knockout Gibco</td><td>10828028</td><td>Soro livre meio basal</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11243217001</tr><tr><td>Microsseringa</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>Aminoácido não essencial</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>Meio básico</td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>Poli-D-lisina</td></tr><tr><td>SAG1</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-426-M01</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Operação Gênica</td><td>04-0010-10mg</td><td>Armazenar da luz a -20?</td></tr><tr><td>Vírus Sendai</td><td>Life Technologies</td><td>MAN0009378</td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td>baiaoshengke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;?</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td>Fator de crescimento transformador &nbsp; &beta;?</td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>R& D Systems</td><td>2914-HT-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>baiaoshengke</td><td></td><td>Surfactante não iônico</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1126</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

A doença de Parkinson (DP) é causada pela degeneração dos neurônios dopaminérgicos (da) no substância negra nigra pars compacta (SNPC) no mesencon ventral (VM). A terapia da recolocação da pilha prende a grande promessa para o tratamento do paládio. recentemente, as pilhas de haste neural induzidas (iNSCs) emergiram como um candidato potencial para a terapia da recolocação da pilha devido ao risco reduzido da formação do tumor e da plasticidade para dar o aumento neurônios específicos da região e glia. os iNSCs podem ser reprogramados a partir de fontes celulares somáticas autólogas, como fibroblastos, células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) e vários outros tipos de células. Comparado com outros tipos de células somáticas, PBMNCs são um tipo de célula iniciante atraente por causa da facilidade de acesso e expansão na cultura. O vírus de Sendai (SeV), um vírus não integrativo do RNA, codificando fatores de reprogramação que incluem o OCT3/4humano, SOX2, KLF4 e c-Myc, tem um genoma negativo-sentido, único-encalhado, não-segmentado que não integre em genoma do hospedeiro, mas apenas Replica no citoplasma de células infectadas, oferecendo um veículo eficiente e seguro para a reprogramação. Neste estudo, nós descrevemos um protocolo em que o iNSCs é obtido reprogramando PBMNCs, e diferenciado em neurônios especializados DA VM DA por um método Two-stage. Então os precursores são transplantados em modelos unilateralmente 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned do rato do paládio para avaliar a segurança e a eficácia para o tratamento do paládio. Este método fornece uma plataforma para investigar as funções e os efeitos terapêuticos de células neurais DA DA do paciente-específicas in vitro e in vivo.

Aqui, nós relatamos um protocolo que cubra estágios diferentes da terapia da pilha de iNSC-DA para tratar modelos do paládio. Primeiramente, os PBMNCs foram isolados e expandidos, e reprogramados em iNSCs pela infecção de SeV. Uma representação esquemática dos procedimentos com expansão de PBMNC e indução de iNSC é mostrada na Figura 1. No dia-14, os PBMNCs foram isolados usando um meio de gradiente de densidade (tabela de materiais). Antes da centrifugação, o sangue diluído...

O protocolo apresenta a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico para induzir células-tronco neurais por infecção pelo vírus de Sendai, diferenciação de iNSCs em neurônios dopaminérgicos, transplante de precursores da DA na unilateralmente lesionada Modelos do rato da doença de Parkinson, e avaliação da segurança e da eficácia de precursores DA DA do iNSC-derivados para o tratamento do paládio.

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Este protocolo descreve um método para reprogramar células sanguíneas e mononucleares para células-tronco neurais que podem ser usadas para tratar doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson. Oferece uma fonte celular autóloga para tratar doenças neurodegenerativas. Além disso, o prazo necessário para a conversão para células-tronco neurais induzidas e a diferenciação para os tipos de células desejadas é menor do que para células-tronco pluripotentes induzidas.As células-tronco neurais induzidas possuem uma boa capacidade proliferativa e podem ser ampliadas antes da aplicação. Uma vez que os iNSCs podem ser especificados em diferentes células neurais específicas da região, como neurônios da medula espinhal ou neurônios motores, este método pode ser estendido para o tratamento de outras doenças neurológicas. Todo o procedimento leva muito tempo, com todas as etapas relacionadas e críticas, então a demonstração visual dá uma ideia de como as células se parecem e fornece algumas dicas para garantir uma geração bem sucedida das células desejadas.Para começar, transfira sangue venoso periférico previamente isolado em um tubo cônico de 50 mililitros, e dilui-o com um volume igual de PBS estéril de Dulbecco. Em outro tubo cônico de 50 mililitros, prepare 15 mililitros de gradiente de densidade esterilizada. Incline o tubo em um ângulo de 45 graus, e lentamente e cuidadosamente coloque 30 mililitros de sangue periférico diluído no meio gradiente de densidade.Centrifugar o tubo a 800 vezes g por 15 minutos em temperatura ambiente com o freio centrífuga definido na posição desligada. Aspire a camada amarela de plasma superior e descarte-a. Use uma pipeta de 10 mililitros para transferir a camada de filme fina branca e nublada contendo células mononucleares para um novo tubo cônico de 50 mililitros.Adicione 30 mililitros de D-PBS ao tubo com MNCs, e centrífuga a 600 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o supernasce, adicione 45 mililitros de D-PBS e resuspenque as células. Depois de centrifugar o tubo a 400 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius, descarte o supernasce.Resuspend as células com cinco mililitros de D-PBS, conte as células vivas com o método de exclusão azul trypan, reserve os MNCs necessários para expansão e congele as células restantes para uso futuro. No dia menos 14, mNCs sementes a uma densidade de dois a três milhões de células por mililitro por poço de placa de seis poços com 1,5 mililitros de 37 graus Celsius, meio MNC pré-aquecido. Incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por dois dias.No dia menos 11, use uma pipeta esterilizada para coletar as células com o meio e transferir para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar a 250 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente, descartar o supernaspeuta e resuspensar as células em um mililitro de meio MNC pré-aquecido. Depois de contar as células viáveis com azul trypan, semente os MNCs a uma densidade de um milhão de células por mililitro em meio MNC pré-aquecido em uma placa de seis poços.Incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por três dias, e repetir a coleta de células, centrifugação e revestimento em mnc médio em dias menos oito e menos quatro. O vírus Sendai neste procedimento é perigoso, e todos os procedimentos envolvendo o vírus Sendai devem ser realizados em um gabinete de segurança. E todas as pontas e tubos expostos ao vírus Sendai devem ser tratados com etanol ou alvejante antes do descarte.No dia zero, colete as células em meio MNC e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros. Depois de centrifugar as células a 200 vezes g por cinco minutos, aspire o supernaspe e resuspenda as células com um mililitro de meio MNC pré-aquecido. Conte as células viáveis com azul trypan, e depois resuspenque-as com meio MNC pré-aquecido para uma concentração de 200.000 células por poço em placas de 24 poços.Descongele os tubos removidos do armazenamento Celsius de menos 80 graus contendo o vírus Sendai em um banho de água Celsius de 37 graus por cinco a 10 segundos, e depois deixe-os descongelar à temperatura ambiente. Uma vez descongelado, coloque-os imediatamente no gelo. Adicione o vírus Sendai descongelado aos poços da placa de 24 poços com MNCs em uma multiplicidade de infecção de 10.Para facilitar a fixação das células, centrifugar as placas a 1.000 vezes g por 30 minutos e depois colocar as placas na incubadora a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. No primeiro dia, transfira as células com o tubo médio para uma centrífuga de 15 mililitros. Para desprender ainda mais as células restantes, enxágue os poços com um mililitro de mnc médio por poço e adicione as células com médio ao tubo.Depois de centrifugar a suspensão celular a 200 vezes g por cinco minutos, aspirar o supernascer, resuspensar as células com 500 microliters de meio MNC pré-aquecido fresco, e adicionar a um poço de uma placa de 24 poços. No segundo dia, use um mililitro por poço de 50 microgramas previamente diluídos por microliter poli-D-lysine em D-PBS para revestir placas de seis poços por pelo menos duas horas em temperatura ambiente. Aspire poli-D-lysine a partir das placas de seis poços, e seque no banco vertical limpo por cerca de 10 minutos.Em seguida, adicione um mililitro por poço de um anteriormente diluído cinco microgramas por mililitro laminina às placas de seis poços, e incubar por quatro a seis horas a 37 graus Celsius para revestir. Lave as placas com D-PBS antes de usar. No terceiro dia, todos os MNCs transduzidos pelo vírus Sendai em meio de células-tronco neurais induzidas nas placas de seis poços revestidas de poli-D/laminina.Nos dias cinco e sete, adicione suavemente um mililitro de 37 graus Celsius, meio iNSC pré-aquecido para cada poço das placas de seis poços. Do dia 9 ao dia 28, substitua o meio por meio iNSC pré-aquecido fresco diariamente. Monitore o surgimento de colônias iNSC, e em cerca de duas a três semanas escolha colônias com morfologia apropriada usando pipetas de vidro queimados e transfira cada colônia para um poço separado de uma placa de seis poços para expansão.Para estabelecer modelos unilaterais de camundongos com lesão de 6-hiroxidopamina, raspe a cabeça de um camundongo anestoizado, adulto, masculino, scid-bege, e aplique pomada ocular de eritromicina. Coloque o mouse no aparelho estereotax e conserte o mouse com barras incisivos. Insira os copos de ouvido corretamente para posicionar a cabeça do mouse de forma segura e adequada.Esterilize a cabeça com iodo povidone e álcool isopropílico, e depois use uma lâmina de bisturi para fazer uma incisão sagital de aproximadamente 1,5 centímetros na pele da cabeça, expondo o crânio. Ajuste a barra incisora e as barras de ouvido para reduzir a diferença de altura entre bregma e lambda para menos de 0,1 milímetros. Mova-se lentamente e abaixe a ponta da agulha de microsinga em direção ao bregma, e trate a bregma como o ponto zero.Mova a ponta para uma posição com coordenadas de 0,5 milímetros anteriores e 2,1 milímetros laterais em relação ao bregma. Retraia a ponta, marque o ponto com uma caneta marcadora e, com uma broca eletrônica, faça um pequeno buraco no crânio. Extraia dois microlitros de cinco microgramas por solução mililitro 6-hyroxydopamina na microsiringe.Volte a agulha para o ponto marcado e insira a agulha em dorsais/ventral 3,2 milímetros. Injete a solução de 6-hyroxidopamina a partir da seringa a uma taxa de um microliter por minuto, deixe a agulha de injeção no lugar por mais cinco minutos e, em seguida, retraia-a lentamente. Depois de fechar a incisão com suturas, aplique pomada ocular de eritromicina nos olhos novamente.Remova o mouse do aparelho estereotaxista, coloque-o na gaiola de recuperação e permita o acesso à comida e água até que ele recupere a consciência. Depois que os PBMNCs foram infectados com SeV, sua morfologia estava mudando e as células sofreram uma morte drástica até o quinto dia. As colônias do INSC surgiram no dia 12.Depois de colher e transferir clones iNSC para expansão para uma série de passagens, eles mostraram uma boa morfologia e puderam se auto-renovar no meio iNSC, seja em uma forma monocamada ou como esferas. Após 24 dias de diferenciação, os iNSCs foram identificados como neurônios dopaminérgicos como a maioria deles expressos de hidroxilase de tyrosina, caixa de garfo A2 e marcadores beta-tubulin classe III específicos para neurônios. Após o estabelecimento de modelos unilaterais de parkinson com lesão de Parkinson, foi realizada avaliação comportamental para estimar os sintomas da doença de Parkinson.Os camundongos que receberam transplante celular apresentaram melhora significativa na função motora. A extensão da lesão induzida por 6-hiroxidopamina foi verificada por coloração imunofluorescente pós-morte para TH no estriado, feixe de cérebro medial e substantia nigra pars compacta. Os sinais TH-positivos foram muito recuperados no estriado onde as células foram implantadas e também levemente recuperadas no SN. Três meses após o transplante, entre as células sobreviventes, cerca de 13,84% eram neurônios dopaminérgicos th positivos.Cerca de 91,72% das células TH-positive expressaram receptor nuclear órfão, cerca de 86,76% expressaram FOXA2, e cerca de 98,77% foram co-rotuladas com potássio retificador para dentro acoplado à proteína G. Ao colocar 30 mil de sangue periférico diluído no meio gradiente de densidade, por favor, faça-o lentamente e cuidadosamente, para não perturbar a interface gradiente. Deve-se tomar cuidado para evitar o descongelamento repetido e o congelamento do vírus Sendai para garantir uma alta atividade do vírus.Ao reprogramar células mononucleares de sangue periféricos para células-tronco neurais induzidas, observe de perto a morfologia das células todos os dias. Além disso, 6-hidroxidopamina é sensível à luz e temperatura. Tenha cuidado para proteger a solução da luz e mantê-la no gelo antes de usar.Após este procedimento, pode-se continuar a estudar os mecanismos da doença usando neurônios dopaminérgicos derivados da DP na cultura. Pode-se também continuar a investigar como as células transplantadas influenciam os circuitos neuronais danificados.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Este vídeo demonstra a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) em células-tronco neurais induzidas (iNSCs) usando o vírus Sendai. O vírus Sendai é um vírus não integrador que oferece um veículo eficiente e seguro para a reprogramação de células.

Geração de células-tronco neurais induzidas (iNSCs) a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs): um procedimento baseado em vírus de Sendai para reprogramar PBMNCs em iNSCs

Este vídeo demonstra a reprogramação direta de células progenitoras hematopoiéticas geneticamente modificadas em células-tronco neuronais. Os fatores de transcrição expressos pelas células progenitoras hematopoiéticas desencadeiam uma cascata de eventos moleculares que facilitam sua transformação. Outros meios específicos são usados para selecionar e cultivar células-tronco neuronais induzidas.

Reprogramação direta de células progenitoras hematopoiéticas em células-tronco neurais

Este vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em neurônios dopaminérgicos, para fornecer um modelo para estudar a doença de Parkinson. As hESCs são cultivadas em um meio de indução neural em uma placa de micropoços para formar neuroesferas 3D. Estes são então cultivados em um meio de indução neural para promover a diferenciação em neurônios progenitores dopaminérgicos. A maturação final dos neurônios ocorre em uma inserção de cultura sob condições de...

Geração de Organoides Neuronais Dopaminérgicos a partir de Células-Tronco Embrionárias Humanas

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

As células do estroma da marrow (MSCs) com potencial neural existem dentro da medula óssea. Nosso protocolo enriquece essa população de células por meio de pré-condicionamento hipóxico e, posteriormente, as direciona para se tornar células maduras de Schwann.

Pré-condicionamento hipóxico de células progenitoras derivadas da medula como fonte para a geração de células maduras de Schwann

Apresentamos um método geneticamente livre de modificações (livre de GM) para obter células com um fenótipo neuronal de células sanguíneas periféricas reprogramadas. A ativação de uma via de sinalização ligada à nova proteína ligada ao GPI humano revela um método eficiente livre de GM para a obtenção de células-tronco pluripotentes humanas.

Geração livre de células neuronais derivadas do sangue

Aqui, descrevemos um protocolo de engenharia de células-tronco quimicamente reprogramadas para obter modulação neuronal precisa, diferenciando essas células em células precursoras dopaminérgicas, transplantando-as em modelos de camundongos da doença de Parkinson e avaliando resultados comportamentais e eletrofisiológicos para confirmar a integração bem-sucedida e a eficácia funcional das células transplantadas.

Regulação quimiogenética em células-tronco precursoras derivadas de células-tronco reprogramadas no tratamento de doenças neurodegenerativas

Aprenda a reprogramar células mononucleares do sangue periférico em células-tronco neurais induzidas usando vírus Sendai. Este método gera neurônios dopaminérgicos autólogos para tratamento da doença de Parkinson em modelos animais.

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

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