Gravação ótica do único-fóton do largo-campo em fatias do cérebro usando a tintura tensão-sensível
20 de junho de 2019
Nós introduzimos um método de gravação óptica reprodutível e estável para fatias do cérebro usando a tintura tensão-sensível. O artigo descreve a coloração de corante sensível à tensão e a gravação de sinais ópticos usando preparações convencionais de corte hipocampal.
O método de gravação óptica com corante sensível à tensão é considerado uma tecnologia ideal para visualizar como o cérebro funciona. Este método nos permitiu registrar uma dinâmica neuropsíquica de forma estável e confiável ao longo de 12 horas, nos dado uma visão sobre a atividade psíquica. Estamos tentando expandir a aplicação para detectar alterações de circuito causadas por produtos químicos em todo o estágio de desenvolvimento, como a valiosa aplicação de ácido às mães.
A técnica já está bem estabelecida. Por favor, tente reproduzir estudos seguindo o método aqui apresentado. Para iniciar este procedimento, mergulhe a cabeça decapitada em ACSF gelado em uma bandeja cirúrgica de aço inoxidável.
Extrair o cérebro dentro de um minuto e colocá-lo em um béquer contendo ACSF refrigerado por cinco minutos. Em seguida, divida a seção cerebral na linha média com um bisturi e coloque ambos os hemisférios em um bloco de 4% de ágar. Em seguida, coloque o bloco cerebral com ambos os hemisférios em um bloco de 4% de ágar.
Limpe o excesso de ACSF do bloco com um papel filtro. Posteriormente, aplique supercola na plataforma vibratome. Coloque o bloco de ágar sobre ele e limpe o adesivo excessivo com um papel filtro.
Aplique suavemente uma pequena quantidade de ACSF gelado do topo do bloco de ágar cerebral para ajudar a solidificar o excesso de supercola e evitar que a cola cubra o cérebro e perturpe o fatiamento. Depois, fixe a plataforma na bandeja vibratome e despeje o ACSF modificado. Ajuste o vibratome a uma velocidade lenta e tenha a frequência da lâmina em sua configuração máxima.
Então comece a cortar. Coloque as fatias no canto da câmara de fatia em sequência para que a ordem das fatias possa ser facilmente distinguida. Normalmente, três a cinco fatias podem ser obtidas de um hemisfério.
Em seguida, corte a porção do tronco cerebral usando uma agulha calibre 30. Usando uma pequena escova de tinta com ponta, coloque a fatia no filtro de membrana segurado com um anel de plexiglass. Coloque o anel em uma câmara de recuperação úmida e fixe a tampa para manter a pressão interna alta.
Ao colocar a fatia no filtro de membrana, ajuste a direção e a posição da fatia dentro do anel para garantir que ela esteja bem centrada e tenha uma direção consistente. Deixe o espécime a 28 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, em temperatura ambiente por pelo menos 10 a 30 minutos para recuperação. Para colorir as fatias, aplique suavemente 100 microliters da solução de coloração em cada fatia e incubar a 20 minutos para temperatura ambiente.
Em seguida, prepare 50 a 100 mililitros de ACSF em um recipiente. Coloque o anel com o espécime nele para enxaguar a solução de coloração. Em seguida, transfira as fatias enxaguadas para outra câmara de incubação.
Espere mais de uma hora para a recuperação antes do experimento. Para iniciar este procedimento, ligue o amplificador, o computador e o sistema de câmera e abra o software. Despeje ACSF em um tubo de 50 mililitros e borbulhe-o com carbogen.
Use uma bomba peristáltica para circular o ACSF e ajustar a vazão para aproximadamente um mililitro por minuto. Em seguida, ajuste a altura da pipeta de sucção para que o nível líquido dentro da câmara de experimento seja sempre constante. Coloque o eletrodo de chão na câmara.
Posteriormente, encha o eletrodo de vidro com uma pequena quantidade de ACSF e coloque-o no suporte de eletrodos. Coloque o suporte na haste do manipulador. Usando um amplificador, certifique-se de que a resistência ao eletrodo é aproximadamente um megaohm.
Na sessão de gravação, transfira uma fatia da câmara úmida para uma câmara experimental. Pressione a borda do anel firmemente no o-anel de silicone. Tenha cuidado para não quebrar a membrana ou a parte inferior da câmara de experimento.
Sob o microscópio coloque a ponta do eletrodo estimulante e o potencial de campo de gravação do eletrodo na fatia. Verifique a resposta evocada fornecendo um estímulo. Confirme que o campo de visão cobre o circuito neural certo no sistema de gravação óptica.
Em seguida, ajuste a intensidade da luz de excitação para aproximadamente 70 a 80% da capacidade máxima da câmera. Usando a fonte de luz fluorescente, ajuste o foco com o sistema de aquisição. Em seguida, inicie a gravação e analise os dados em um software de aquisição de imagens após a aquisição.
Esta figura mostra o sinal óptico representativo sobre a estimulação elétrica do collaterol Schaffer na área CA1 de uma fatia hipocampal de rato. Estas imagens consecutivas mostram o sinal óptico antes de qualquer filtro espacial e temporal ser aplicado enquanto essas imagens mostram os mesmos dados depois de aplicar um filtro cúbico de cinco por cinco por cinco duas vezes. Devido à alta taxa de quadros e alta resolução espacial, a aplicação do filtro não alterou o sinal, mas filtrava o ruído que também pode ser observado no curso de tempo registrado em pixels em um único ensaio.
Aqui está a comparação das respostas típicas na área CA1 das fatias hipocampais entre rato e rato. A pequena resposta hiperpolarizadora é observada no lado distal do CA1 após 24 milissegundos na fatia hipocampal do rato, mas uma resposta hiperpolarizadora mais maciça ultrapassou a resposta despolarizante na fatia hipocampal de rato. Uma vez que as fatias estão manchadas, elas devem durar mais de 12 horas e você pode realizar outras gravações eletrofisiológicas nelas.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método estável de gravação óptica utilizando corante sensível à voltagem em fatias cerebrais, com foco na sinalização de neurônios do hipocampo. A técnica oferece uma visualização confiável da dinâmica neurofisiológica por períodos prolongados, facilitando investigações sobre alterações nos circuitos decorrentes da aplicação de substâncias químicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Imagem Óptica
Contexto
- O corante sensível à voltagem é essencial para visualizar as atividades cerebrais.
- Os preparos convencionais de fatias hipocampais servem como modelo biológico.
- O estudo explora as dinâmicas neuropsíquicas e alterações nos circuitos.
- Os métodos anteriores apresentavam falta de confiabilidade durante períodos prolongados de gravação.
Objetivo do Estudo
- Apresentar um método reprodutível para gravação óptica em fatias cerebrais.
- Fornecer insights sobre os efeitos de substâncias químicas na dinâmica dos circuitos cerebrais.
- Permitir a observação de longo prazo da atividade neuronal e das respostas.
Métodos Utilizados
- A plataforma utilizada é fatias cerebrais ex vivo preparadas a partir do hipocampo de camundongo.
- O modelo chave inclui fatias hipocampais, facilitando estudos sobre atividade elétrica.
- Não são mencionados fluxos de trabalho de multiômica; o foco está em técnicas ópticas e eletrofisiológicas.
- O preparo envolve etapas meticulosas, como resfriamento, coloração e incubação das fatias.
- As sessões de gravação são realizadas em uma câmara experimental com requisitos precisos de montagem.
Resultados Principais
- O método óptico permite a coleta confiável de dados ao longo de um período de 12 horas.
- A comparação das respostas entre fatias hipocampais de camundongo e de rato mostra perfis neurofisiológicos distintos.
- As alterações eletrofisiológicas, como respostas hiperpolarizantes, são confirmadas por gravações ópticas.
- A técnica aprimora nossa compreensão da dinâmica dos circuitos neuronais sob diversas condições.
Conclusões
- Este método oferece um avanço significativo para o estudo de circuitos cerebrais e fenômenos neuropsíquicos.
- Permite aos pesquisadores observar alterações em tempo real na sinalização neuronal.
- Compreender esses mecanismos pode fornecer insights sobre a plasticidade e possíveis aplicações terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem ampla com corantes sensíveis à voltagem de um único fóton permite uma avaliação funcional estável e de longo prazo de circuitos neurais em fatias cerebrais, abordando um desafio fundamental na validação de alvos em neurociência. O método possibilita a redução de riscos mecanicistas ao fornecer leituras ópticas quantitativas e de alta resolução da atividade neuronal ao longo de períodos prolongados, o que é essencial para avaliar os efeitos de compostos sobre a dinâmica dos circuitos na descoberta pré-clínica.
Aplicações Estratégicas na P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização em tempo real da dinâmica de sinalização neuronal em circuitos hipocampais.
- Valor Operacional: Fornece gravações estáveis e reprodutíveis por mais de 12 horas, permitindo a avaliação longitudinal do engajamento de alvos e da modulação de vias.
- Valor Preditivo: Facilita a detecção de alterações nos circuitos induzidas por aplicações químicas, auxiliando na identificação precoce dos efeitos de compostos neuroativos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Alcança uma taxa de quadros de 10 kHz e resolução de 100x100 pixels, permitindo análises temporais e espaciais de alta produtividade das respostas neurais.
- Qualidade do sinal: A filtragem pós-gravação melhora a relação sinal-ruído, permitindo a detecção confiável de alterações sublimiares nos circuitos, essenciais para a sensibilidade do ensaio.
- Reprodutibilidade: Protocolos estáveis de manipulação e coloração de fatias minimizam artefatos mecânicos, garantindo dados consistentes entre réplicas e sessões experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Apoia a avaliação de alterações nos circuitos em redes hipocampais, uma região implicada em transtornos cognitivos e neuropsiquiátricos.
- Continuidade Translacional: Permite gravações ópticas e eletrofisiológicas paralelas, fortalecendo a validação de resultados funcionais entre diferentes modalidades de medição.
- Avanço Ajustado ao Risco: Perfis de resposta distintos entre fatias de camundongo e rato informam a tradução entre espécies e ajudam a reduzir os riscos na seleção de candidatos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer leituras funcionais de circuitos que conectam a validação de alvos e a identificação de compostos líderes, especialmente para compostos neuroativos que exigem avaliação fenotípica em nível de circuito.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre dinâmicas neuropsíquicas e a elucidação de vias por meio da visualização direta de sinais ópticos evocados em circuitos neurais definidos.
- Triagem: Fornece saídas ópticas quantitativas e de alta resolução adequadas para análise automatizada e comparação de alterações induzidas por compostos na atividade neural.
- Análises: Permite a aplicação de filtros espaciais e temporais para extrair o sinal do ruído, facilitando a quantificação objetiva das respostas do circuito e a avaliação da variabilidade.
- Pesquisa Translacional: Conecta observações de circuitos na fase de descoberta à validação pré-clínica, permitindo gravações repetidas ao longo de períodos prolongados para avaliar a estabilidade e reprodutibilidade dos efeitos dos compostos.
- Reutilização Corporativa: A preparação padronizada de fatias e a plataforma de imagem permitem reutilização em múltiplos projetos e séries de compostos, reduzindo a variabilidade metodológica nas etapas de triagem em neurociência.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece insights mecanicistas sobre a função de circuitos neuronais, reduzindo a ambiguidade na validação de alvos e apoiando a confiança preditiva em triagens neurofarmacológicas.
- Valor Operacional: Mantém as condições fisiológicas e previne o movimento do corte, garantindo a aquisição estável de dados livres de artefatos para triagem confiável de compostos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao permitir a detecção precoce de efeitos adversos ou fora do alvo nos circuitos, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados do desenvolvimento de fármacos para o SNC.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos com base em perfis funcionais de circuitos, aumentando a eficiência do capital em etapas pré-clínicas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia, imagem óptica e manipulação de tecidos para garantir a viabilidade adequada dos cortes e eficiência da coloração.
- Depende de sistemas de câmeras de alta velocidade, fontes de luz fluorescente e configurações de perfusão capazes de manter condições fisiológicas durante gravações prolongadas.
- Necessita padronização da orientação dos cortes, duração da coloração e protocolos de recuperação entre equipes, a fim de minimizar a variabilidade na linha de base do sinal óptico e na resposta.
- A adaptação a outras regiões cerebrais ou modelos de doenças pode exigir validação da eficiência da coloração e da expressão do sinal específica ao circuito.
- Limitações práticas incluem a necessidade de cuidadosa otimização da intensidade da luz de excitação para prevenir fototoxicidade, mantendo amplitude de sinal suficiente para detecção.
