Name: Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprenda a gerar esferoides 3D derivados de pacientes para triagem de drogas antineoplásicas. Este método permite avaliar respostas específicas a medicamentos em câncer de ovário e estudar resistência à quimioterapia.

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Este trabalho é apoiado principalmente por DOD OCRP início de carreira investigador Award W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD Pilot Award W81XWH-16-1-0426 (GM), investigador DOD iniciou prêmio W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin centro de câncer de ovário e câncer de ovário de Michigan Aliança. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do câncer dos institutos nacionais de saúde o número de premiação P30CA046592. A CMN é apoiada pela Fundação Nacional de Ciências pós-graduação em pesquisa o subsídio n º 1256260. A MEB é apoiada pelo departamento de educação pós-graduação em assistência em áreas de necessidade nacional (GAANN) Fellowship.

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Os autores não têm nada a revelar.

O 384-poço pendurado plataforma de placa de queda para a formação de esferóide 3D é uma ferramenta facilmente implementada para qualquer biologia celular ou laboratórios de biologia do câncer. Esta plataforma fisiológica permite o estudo de linhas celulares, bem como, amostras de pacientes primários dentro de culturas 3D fisiologicamente relevantes, permitindo a triagem de drogas de alta taxa de transferência. A plataforma igualmente assegura-se de que as condições da cultura sejam altamente ajustáveis, permitindo o cont...

A mortalidade mundial relacionada ao câncer atingiu um pedágio de 9,8 milhões mortes em 20181, destacando a necessidade de desenvolvimento de terapêutica melhorada. Infelizmente, o custo do desenvolvimento de drogas cancerosas está aumentando, com o desenvolvimento de uma única droga custando aproximadamente 650 milhões USD2 indicando a necessidade de estratégias melhoradas para desenvolver novos medicamentos anticancerígenos. Células-tronco cancerosas (CSCs), que são caracterizadas por aumento da quimiorresistência3, a capacidade de autorenovar, e a capacidade de semente de novos tumores4 são pensados para ser responsável pelo recidiva tumoral4, metástase5, e quimiorresistência4,6, que todos contribuem à capacidade maligno do tumor e assim ao pedágio elevado da morte. No cancro ovariano, estas pilhas são encontradas enriquecidas no líquido maligno das ascite na cavidade peritoneaa, uma circunstância associada com os resultados clínicos pobres1. Em conseqüência das capacidades malignos de CSCs, houve um impulso para desenvolver o CSC novo que alvejam drogas para usar-se conjuntamente com quimioterapias tradicionais. Existem vários desafios que acompanham o desenvolvimento da CSC visando drogas, incluindo: 1) dificuldade em expandir e manter CSCs in vitro; 2) escassez de amostras de pacientes; 3) relevância fisiológica da plataforma de cultura; e 4) heterogeneidade na sensibilidade medicamentosa entre os pacientes. Este protocolo descreve a implementação de uma plataforma de cultura 3D de alta taxa de transferência que pode superar cada um desses desafios. Em particular, este sistema permite a triagem rápida de drogas usando pequenos números de CSCs ovarianos derivados do paciente, e é altamente capaz de técnicas de análise a jusante. Embora seja ideal para estudar câncer de ovário e CSCs, nossa plataforma também é valiosa no estudo de outros cânceres e tipos de células diferenciadas em ambientes 3D complexos.
Os modelos 3-dimensionais complexos (3D) são críticos em estudar o microambiente do tumor (TME), que é um Niche 3D compo de pilhas de cancro, de pilhas suportando do não-cancro, e de proteínas extracelular da matriz (ECM)4. Este ambiente 3D resulta em morfologia celular única, interações célula-célula e matriz celular, diferenciação celular, migração celular, densidade celular e gradientes de difusão em comparação com a cultura de células 2D tradicional in vitro4. Todos estes fatores culminam na resposta diferencial da droga dentro das culturas 3D, exibindo a resistência aumentada da droga e a relevância physiological7,8. Devido ao papel do TME 3D na diferenciação e na quimiorresistência do CSC, é vital para a tela para o CSC que alvejam drogas em microambientes fisiológicos. Melhorar a relevância fisiológica de plataformas de triagem de drogas CSC tem o potencial para melhorar a triagem de drogas específicas do paciente, desenvolvimento de medicamentos, formulação de estratégias de tratamento e, finalmente, resultados clínicos. É igualmente importante que a plataforma utilizada para a triagem de fármacos seja de alto débito e compatível com métodos de análise a jusante para minimizar o tempo de custo, tempo e tradução clínica de drogas promissoras9.
Atualmente, o complexo TME é melhor mantido para aplicações de triagem de fármacos através de modelos in vivo, como modelos de tumor singeneico murino, xenoenxertos derivados de linhagem celular e Xenoenxerto derivado do paciente (PDX) modelos12, pois fornecem Condições. No entanto, a natureza de baixa taxa de transferência desses modelos, bem como, o custo, o tempo e os conjuntos de habilidades técnicas que eles exigem limitam sua utilidade em aplicações de triagem de drogas rápidas e de alta taxa de transferência13. Como alternativas a estes modelos in vivo, muitos modelos in vitro 3D que utilizam hidrogéis8, cultura dentro de dispositivos microfluídico ou ' órgão-em-um-chip ' dispositivos10,14, e culturas não aderentes3,8 também foram desenvolvidas, devido à sua baixa barreira à entrada em termos de custo, tempo e skillset exigido.
As plataformas da cultura do Hydrogel são vantajosas no controle fino proporcionado sobre a composição da matriz, as propriedades mecânicas, e a estrutura da matriz15; no entanto, eles podem inibir a cultura de células de alta densidade14. Adicionalmente, a colheita de células de hidrogéis pode complicar a análise a jusante, devido a efeitos potencialmente nocivos dos métodos de colheita15. Os dispositivos microfluílicos, por outro lado, são dispositivos de microescala que permitem a detecção de saída dentro do mesmo dispositivo e para a cultura celular em escalas fisiologicamente relevantes com consumo mínimo de reagentes, tempo de reação diminuído, desperdício minimizado e difusão rápida14. Estas características tornam-nas plataformas promissoras para investigar a toxicidade, eficácia e farmacocinética da droga. No entanto, os desafios de uma cultura de células 3D eficiente, quantificável, reprodutível e fácil de usar, bem como sistemas de bombeamento volumosos e caros restringiram aplicações microfluímicas em pesquisas de alta produtividade10. As configurações de detecção eficientes e a implementação potencialmente difícil nos campos também dificultaram a adoção generalizada de sistemas microfluílicos10.
De forma contrária, os esferóides gerados em condições não aderentes em misturadores rotativos (nutators), placas de fixação Ultrabaixa e gotas suspensas não incluem componentes de matriz definidos pelo usuário. Essas metodologias são especialmente relevantes para o estudo do câncer de ovário, pois as condições não aderentes são representativas das condições em que os esferóides crescem dentro da cavidade peritoneal5. Dentro destes métodos não aderentes da cultura, o pulverizador e os esferoides de gota de suspensão foram mostrados para apresentar uma compactação, uma remodelação, e um quimiorresistência mais elevados comparados aos esferoides gerados em placas ultra-low do acessório, sugerindo o aumento fisiológico relevância16,17,18,19. Devido à capacidade aumentada para a seleção da elevado-produção dos tamanhos pequenos do poço e dos números de pilha exigidos mínimos, a geração do esferóide em placas de gota de suspensão é uma plataforma ideal para a seleção da droga. Aqui, apresentamos uma plataforma fisiológica 3D sintonável em placas suspensas 384-well penduradas, que é fácil de implementar e altamente receptável à análise a jusante, tornando-a ideal para a triagem de drogas de alto débito de câncer de ovário e CSCs ovariana.
Nossa plataforma fisiológica 3D fornece todas as vantagens da cultura 3D, incluindo contatos fisiológicos de células celulares, gradientes de difusão, densidades de células e proteínas de ECM produzidas naturalmente, que podem contribuir para respostas realistas de drogas16, 17,18,19. Adicionalmente, gerando estes esferoides com CSCS paciente-derivado, nós podemos determinar respostas específicas pacientes às drogas1 com muitas repetições técnicas simultaneamente, para superar a heterogeneidade que pode ser encontrada dentro do tumor paciente amostras20. Além disso, a cultura 3D demonstrou aumentar a manutenção das populações deCSC,16 e,portanto, é representativa de populações de CSC enriquecidas nas ascite7. Isto combinado com a análise a jusante fácil, incluindo a análise da citometria do fluxo da viabilidade e das proporções do CSC permite a avaliação óptima do CSC que Sega a eficácia da droga. Por fim, esta plataforma fisiológica é compatível com a imagem em múltiplos pontos temporais durante o experimento, avaliação da morte celular e proliferação, organização celular e morfologia com imunohistoquímica, sinalização solúvel com ELISA em condicionados meio, fenótipos da pilha com cytometry do fluxo, e expressão do gene que segue o PCR.

<table><tbody><tr><td>0,25% de tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>ILT25200056</td><td></td></tr><tr><td>pipeta sorológica de 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>10.000 cSt Si oil</td><td>Millipore Sigma</td><td>63148-62-9</td><td>Usado para revestir o molde da matriz esferóide para facilitar a remoção de géis de processamento de tecidos, como o Histogel, do molde.</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 100 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de 15 mL</td><td>Celltreat</td><td>FL4021</td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM para Soro Meio Livre</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>1x F12 para Soro Livre</td><td>Médio Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>ILT10010023</td><td></td></tr><tr><td>4',6- diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; Filtro Fisher</td><td>Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies Inc.</td><td>1449</td><td>Uma enzima de desprendimento celular suave composta de enzimas proteolíticas e colagenolíticas.</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td>Corante de resazurina usado para medir a viabilidade e proliferação de células com base em sua capacidade de reduzir a resazurina a resorufina, que é altamente fluorescente.</td></tr><tr><td>Kit de ensaio ALDEFLUOR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>1700</td><td>Kit para identificar células-tronco e progenitoras que expressam altos níveis de aldeído desidrogenase , um indicador de células-tronco cancerígenas. O kit é composto por reagente ALDEFLUOR, DEAB, ácido clorídrico, dimetilsulfóxido e tampão de ensaio ALDEFLUOR.</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Dietilaminobenzaldeído (DEAB)Tecnologia de</td> <td>células-tronco</td><td>1705</td><td>O dietilaminobenzaldeído (DEAB) é um inibidor das isoenzimas ALDH, usado para determinar a coloração ALDH não específica.</td></tr><tr><td>Andor iXon x3 CCD Camera</td><td>Oxford</td> <td>Instruments-Antibióticos</td><td></td></tr> <tr><td>e Antimicóticos</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>APC-isotipo IgG2b</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-092-217</td><td>Controle de isotipo para quantificar a coloração não específica de anticorpos IgG2b.</td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>básico Fator de Crescimento de Fibroblastos</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>78003.1</td><td></td></tr><tr><td>BD Lo-Dose U-100 Seringas de Insulina</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td>7091000</td><td></td></tr><tr><td>CD133-APC</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-113-184</td><td>Anticorpo fluorescente direcionado ao CD133, um marcador de células-tronco cancerígenas.</td></tr><tr><td>cellSens Dimension Software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cisplatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4394</td><td>Agente quimioterápico à base de platina que funciona como um agente alquilante que interrompe o DNA.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidérmico</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Sistema de Imagem de Células Core</td><td>Life Technologies</td><td>AME3300</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino - premium (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>Gel de processamento de tecidos que pode penetrar e segurar a amostra dentro do gel, evitando a descoloração ao redor da amostra após a coloração.</td></tr><tr><td>Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano</td><td>Lonza</td><td>PT-5006</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliais microvasculares humanas</td><td>Lonza</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de insulina-transferrina-selênio</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilidade vivo/morto</td><td>Kit Invitrogen</td><td>L3224</td><td>para a detecção baseada em fluorescência de células vivas (calceína-AM) e mortas (Etídio Homodímero-1).</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais MEM</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph 7.8 Software</td><td>Molecular</td> <td>Devices-Olympus</td><td></td></tr> <tr><td>IX81 Microscópio Confocal Invertido</td><td>Olympus-Olympus</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>IX83 Microscópio Invertido de Pesquisa</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Thomas Scientific</td><td>7315D35</td><td>Tiras de polímero termoplástico que servem para limitar a evaporação de gotículas em placas suspensas, permitindo a troca gasosa.</td></tr><tr><td>Placas de queda de poço Perfecta 3D 384</td><td>Biomatrix 3D Biomatrix</td><td>HDP1384-8</td><td>Disponível através da faloidina Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>A faloidina é um peptídeo para marcar fluorescentemente a F-actina em células fixas.</td></tr><tr><td>ProJet 3500 HD Max</td><td>3D</td> <td>Systems-Impressora</td> <td>3D</td></tr><tr><td>Estéril DI água</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>corante Azo usado para diferenciar entre células vivas e mortas com base em sua capacidade de passar pela membrana danificada de células mortas, mas não pela membrana intacta de células vivas.</td></tr><tr><td>VisiJet M3 Crystal</td><td>3D Systems</td> <td>-</td> <td>Um material polimérico biocompatível para impressão 3D.</td></tr><tr><td>Unidade de Scanner Confocal Yokogawa CSU-X1</td><td>Yokogawa</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

spheroids 3d derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Neste protocolo, nós esboçamos o procedimento para a geração de esferoides do tumor dentro das gotas de suspensão 384-well para permitir a seleção da elevado-produção de terapêutica anti-câncer em um microambiente fisiologicamente representativo. Nós esboçamos a formação de esferoides derivados pacientes da pilha de haste do cancro, assim como, a manipulação destes esferoides para a análise completa depois do tratamento da droga. Especificamente, nós descrevemos a coleção da morfologia do esferóide, da proliferação, da viabilidade, da toxicidade da droga, do phenotype da pilha e dos dados da localização da pilha. Este protocolo centra-se fortemente em técnicas de análise que são facilmente implementadas usando o 384-bem pendurado drop plataforma, tornando-o ideal para a triagem de drogas de alta taxa de transferência. Enquanto enfatizamos a importância deste modelo em estudos de câncer de ovário e pesquisa de células-tronco de câncer, a plataforma 384-well é capaz de pesquisa de outros tipos de câncer e modelos de doenças, estendendo a utilidade da plataforma para muitos campos. Ao melhorar a velocidade de triagem de drogas personalizado e a qualidade dos resultados de triagem através de facilmente implementado fisiologicamente representativas culturas 3D, esta plataforma está prevista para ajudar no desenvolvimento de novas terapêuticas e pacientes específicos estratégias de tratamento e, portanto, têm um impacto clínico de grande alcance.

Os esferóides formados com linhagens celulares ou CSCs derivadas de pacientes podem ser formados com uma variedade de pequenos números de células dentro de gotas suspensas (Figura 2a). Os spheroids formam confiantemente com tão poucos quanto 10 pilhas por o poço, que permite a conservação de amostras pacientes raras. Células dentro desses esferóides são cercados por outras células em 3 dimensões como eles estariam in vivo, permitindo que os contatos de células celulares fisiológicas e taxas ...

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Nosso protocolo fornece um método simples para a cultura celular 3D e é altamente favorável à análise a jusante. Isso facilita a avaliação de amostras heterogêneas de pacientes e suas respostas específicas de medicamentos. A vantagem desta técnica é que os esferoides podem ser formados a partir de pequenos números de células, permitindo tanto a preservação de amostras primárias escassas, quanto a triagem de alto rendimento para respostas de medicamentos específicos do paciente.O modelo de queda de enforcamento cria um ambiente fisiológico com difusão de medicamentos 3D e faz respostas correspondentes ao estágio tumoral. Isso permite o desenvolvimento de terapias-alvo e tratamentos específicos para o paciente. Este método é ideal para estudar câncer de ovário, heterogeneidade e desenvolvimento da resistência à quimioterapia.No entanto, também pode ser usado para estudar outros cânceres e populações de células resistentes a medicamentos. Ao emplaar esferoides, é importante pipetizar volumes precisos. Isso garante consistência entre os esferoides.Os esferoides e suas respectivas gotículas são inerentemente frágeis e facilmente perdidos sem o manuseio adequado, por isso mostraremos como emplacar, manter e analisar adequadamente uma placa de gota pendurada. Demonstrando este procedimento será Michael Bregenzer, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Comece preenchendo cada poço da placa de seis poços com quatro a cinco mililitros de água desionizada autoclave e sanduiche a placa de gota pendurada entre a tampa e o fundo da placa.Adicione 800 a 1000 microlitros de água ao redor da borda da placa de gota suspensa para fornecer um ambiente úmido e minimizar a evaporação. Em seguida, colete células cultivadas em 2D, destacando-as com trippsina e, em seguida, adicionando seis ou oito mililitros de FBS médios. Aspire as células com a pipeta sorológica de 10 mililitros, e deposite-as em um tubo cônico de 15 mililitros.Use um hemótmetro para contar as células. Prepare a suspensão celular de acordo com as instruções do manuscrito e misture suavemente com a pipeta para garantir a distribuição homogênea. Coloque a ponta da pipeta no poço em um ângulo de 45 graus e pipeta 20 microliters de suspensão em cada gota bem pendurada.Coloque a tampa da placa de seis poços de volta e use uma tira termoplástica elástica para selar as bordas. Incubar em uma incubadora padrão de dióxido de carbono umidificada e alimentar as gotas de enforcamento a cada dois ou três dias adicionando dois a três microliters de cultura celular média a cada poço contendo esferoides. Para quantificar a proliferação e a viabilidade das células, adicione dois microliters de solução filtrada baseada em resazurina aos poços designados para análise de proliferação e incubam de acordo com a direção do manuscrito.Após o período de incubação, abra o sanduíche de gota pendurada em um armário de biossegurança e leve a placa 384 com a tampa ainda no lugar para o leitor de pratos. Coloque-o no leitor de placas e leia a placa. Salve o experimento na janela pop-up e exporte os dados para uma planilha.Volte a placa de volta para a base de seis poços e coloque-a na incubadora. Uma vez que todos os pontos de tempo tenham sido lidos para o dia, reseeal a placa antes de incubar. Para preparar esferoides para análise de citometria de fluxo, use uma pipeta de 1000 microliteres para recolhê-los de cada poço e depositá-los em um tubo cônico de 15 mililitros para desagregação.Suspensão de células de aliquot em cinco tubos de micro centrífugas de modo que cada tubo contém pelo menos 50.000 células. Centrifugar os tubos a 400 vezes G durante cinco minutos em um microcentrifuuge, em seguida, aspirar as pelotas supernascer e suspender novamente em 100 microliters de tampão Aldefluor. Rotule os tubos de acordo com as instruções do manuscrito.Adicione 0,5 microliters de anticorpo isótipo APC ao tubo APC ISO e um microliter de anticorpo CD133 ao tubo ALDH CD133. Em seguida, adicione cinco microliters de reagente DEAB e 0,5 microliters de ALDH ao tubo DEAB e um microliter de ALDH ao tubo ALDH CD133. Vórtice todos os tubos por alguns segundos e incuba-los a 37 graus celsius por 45 minutos.Após a incubação, o vórtice todos os tubos novamente e centrifuá-los a 400 vezes G por cinco minutos. Rotule os tubos FACS de acordo com as instruções do manuscrito e encha um recipiente de espuma isolado com gelo. Aspire o supernascer dos tubos de microcentrifuuagem.Em seguida, suspenda novamente o controle não manchado em 400 microliters de tampão FACS e o resto das células em 400 microliters de tampão FACS DAPI. Coloque os tubos no gelo até que possam ser analisados em um citómetro de fluxo. Use o FlowJo para analisar os dados do citómetro de fluxo.Clique duas vezes no arquivo não identificado e defina o eixo Y para a altura de dispersão lateral ou SSCH e o eixo X para a altura de dispersão para a frente ou FSCH. Clique no botão T ao lado de cada eixo para ajustar a escala e maximizar a separação entre diferentes populações celulares. Em seguida, clique no botão Polygon Gating, desenhe o portão do polígono em torno da população celular e rotule as células da população.Clique duas vezes na população da célula no espaço de trabalho e, em seguida, altere o eixo FSC para a largura FSC e o eixo SSC para a altura FSC. Escolha o portão retângulo para desenhar apenas um retângulo em torno da população mais densa densa das células, abrangendo todo o eixo Y. Rotule este portão de células únicas.Em seguida, clique com o botão direito do mouse e copie estas células no portão de células únicas aninhadas e cole-as sob cada amostra no espaço de trabalho. Clique duas vezes no portal Células Únicas aninhados sob a amostra DAPI para visualizar a população de células únicas desse tubo amostral. Altere o canal do eixo FSC para o canal de área DAPI e altere o canal do eixo SSC para histograma.Clique no botão T ao lado do eixo DAPI e clique em Personalizar o Eixo para ajustar a escala e maximizar a separação entre os picos negativos DAPI e DAPI. Clique em Aplicar na janela pop-up e escolha o botão Range Gate. Espalhe-o sobre o pico negativo da DAPI e rotule este portão Live Cells.Copie o portão live cells e cole-o sob o portão de Células Únicas, sob os tubos APC ISO DEAB e ALDH CD133, para selecionar a mesma porção de células vivas em cada tubo. Em seguida, clique duas vezes na população de Células Vivas aninhadas sob o arquivo de amostra ISO APC e mude o eixo X para a área de ALDH e o eixo Y para a área APC. Aplique o Portão do Quadrante e ajuste a intersecção do portão, como a de aproximadamente 0,5% da população, no canto superior esquerdo da janela do lote.Em seguida, nomeie os quadrantes como desejado, depois copie e cole os portões do quadrante na população de células vivas aninhadas sob o arquivo DEAB e ajuste a linha vertical para que aproximadamente 0,15% da população celular esteja dentro do quadrante positivo da ALDH. Por fim, copie e cole os portões do quadrante para os arquivos ALDH CD133 população de Células Vivas e avaliação de proporções de células-tronco cancerígenas com base em proporções ALDH e CD133. Este protocolo pode ser usado para análise de alto rendimento de células-tronco cancerígenas derivadas do paciente.Apenas 10 células por poço podem formar esferoides confiáveis e à medida que as células se proliferam, os esferoides se expandem em tamanho. A capacidade de proliferação pode ser facilmente quantificada com um ensaio de floresnce baseado em resazurina. O efeito de drogas na morfologia esferoide pode ser visualizado com imagens de contraste de fase e quantificado comparando a florescência de resazurina em células não tratadas e tratadas.A morte celular pode ser validada através da adição de Calcein-AM e do homodimer de ethidium I aos esferoides, seguido por imagens em um microscópio confocal. Finalmente, os esferoides podem ser colhidos e dispersos em uma única suspensão de células para análise com citometria de fluxo, o que torna possível discernir a eficácia de diferentes tratamentos medicamentosos em populações celulares específicas. Para evitar a perda de gotículas, evaporação média e variação no tamanho do esferoide, é importante manusear as placas com cuidado, pipeta com precisão e selar completamente as placas de gota suspensa.Para avaliar mudanças na expressão genética e sinalização solúvel devido ao tratamento medicamentoso, o sequenciamento de RNA de células únicas e ensaios imunossorbentes ligados à enzima podem ser usados para facilitar o desenvolvimento de terapêuticas. Esta técnica permite que pesquisas em oncologia, medicina de precisão e desenvolvimento de medicamentos explorem a heterogeneidade intra e inter paciente, bem como a resistência à quimioterapia através de rastreamento de medicamentos de alto rendimento de pequenas biópsias. Ao executar este protocolo, certifique-se de usar todos os equipamentos de proteção individual padrão.Incluindo luvas, óculos de segurança, jalecos, calças e sapatos de perto.

physiologic-patient-derived-3d-spheroids-for-anti-neoplastic-drug

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um protocolo para impressão robótica de esferoides de células cancerígenas em um formato de placa de 96 poços de alto rendimento usando um sistema aquoso de duas fases é apresentado.

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Identificar novos alvos de medicamentos que fazem a transição de testes pré-clínicos para testes em humanos é uma prioridade científica. Para esse fim, descrevemos aqui uma abordagem genômica funcional para examinar o impacto da depleção de genes em esferóides de linhas de células cancerígenas, que modelam mais apropriadamente cânceres humanos in vivo.

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

Descrevemos a evolução de um modelo tridimensional, esferoide-baseado em vitro que permite-nos testar o padrão atual de regimes de terapia experimental para cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas na linha de celular, com o objetivo de avaliar a terapia susceptibilidade e resistência em células primárias de espécimes humanos no futuro.

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Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Este protocolo destina-se a avaliar a citotoxicidade de células T (células T carro) imunoterapia redirecionada contra células cancerosas estruturadas 3D (esferoides) em tempo real.

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Tomografia de coerência óptica (OCT), uma tecnologia de imagem tridimensional, foi usada para monitorar e caracterizar a cinética de crescimento de esferoides tumor multicelulares. Precisa quantificação volumétrica de esferoides tumor usando um voxel contando a abordagem e deteção de tecido livre de rótulo morto nos esferoides baseado no contraste intrínseco atenuação óptica, foram demonstradas.

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Um novo modelo esferoide tridimensional baseado na interação heteroplípica das células tumorais e fibroblastos estrômios é estabelecido. Aqui, apresentamos cocultura de células tumorais e fibroblastos estrômicos, imagens de lapso de tempo e microscopia confocal para visualizar a formação de esferoides. Este modelo tridimensional oferece uma plataforma pertinente para estudar interações tumor-stroma e testar a terapêutica do câncer.

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.

Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

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