Name: Tempo real RT-PCR do Pan-lyssavirus para o diagnóstico da raiva (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Aprenda o método de RT-PCR em tempo real para diagnóstico rápido da raiva em amostras clínicas. Este ensaio sensível detecta todos os membros do gênero Lyssavirus, incluindo espécies altamente divergentes em espécimes clínicos.

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Os autores desejam agradecer a senhorita Emma Wise e Miss Megan Golding para obter ajuda para completar os experimentos. O desenvolvimento deste protocolo foi apoiado financeiramente pelo departamento do Reino Unido para o meio ambiente, alimentos e Assuntos rurais (DEFRA), Governo escocês e governo galês por subvenções [SV3500, e SE0431] e pelo projeto europeu de Virus Archive global (EVAg) que tem receberam financiamento do programa de investigação e inovação Horizon 2020 da União Europeia, a Convenção de subvenção n. o 653316.

Amostras de material de diagnóstico recebidos na APHA após infecção natural, ou obtidas por camundongos inoculantes utilizando protocolos avaliados pelo Comitê de ética e estatística da APHA o estatuto de Home Office do Reino Unido licença 70/7394.
1. quantificação do RNA usando um Espectrofotômetro de microvolume
<ol><li>Assegure-se de que os ajustes do espectrofotômetro estejam ajustados ao RNA.</li>
	<li>Use 1-2 μL de água de grau molecular para inicializar a máquina e definir uma linha de base.</li>
	<li>Use 1-2 μL de cada amostra de RNA de teste para avaliar a quantidade de RNA.</li>
	<li>Guarde as leituras e o documento.</li>
	<li>Ajuste o RNA para 1 μg/μL, se necessário. Nota: O RNA deve ser mantido no gelo (ou em um bloco fresco) em todas as vezes. Se o RNA é obtido usando uma coluna, ou o método grânulo-baseado o RNA é geralmente menos de 1 μg/μL. Nesta situação use o RNA puro.</li>
</ol>2. preparação da série de diluição de RNA para determinar a sensibilidade do ponto final
<ol><li>
Faça uma diluição em série de 10 vezes do RNA.
	<ol>
<li>Os tubos da etiqueta com a série da diluição (por exemplo, 10-1, 10-2, etc.) e os detalhes do RNA.</li>
		<li>Adicionar 45 μL de água de grau molecular a cada tubo.</li>
		<li>Adicionar 5 μL do RNA (previamente diluído a 1 μg/μL) e misturar bem.</li>
		<li>Elimine a ponta da pipeta no desinfetante apropriado e substitua-a por uma ponta fresca.</li>
		<li>Tome 5 μL do 10-1 e adicione ao tubo 10-2 e misture bem.</li>
		<li>Repetir de 2.1.3 a 2.1.5 com as restantes diluições. Nota: O RNA deve ser mantido no gelo (ou em um bloco fresco) em todas as vezes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação de reações de RT-PCR em tempo real
<ol><li>Usando uma planilha, planeje o layout da placa de acordo com o número de amostras de teste e amostras de controle, tanto para os ensaios de lyssavirus quanto de ß-actina. Nota: Se 4 amostras devem ser testadas em duplicado com um controle positivo e negativo, isso equivale a 10 reações para ambos os ensaios.</li>
	<li>Em uma "sala limpa" ou área separada do modelo de RNA, limpe as superfícies com um desinfetante apropriado antes de usar ou preparar uma estação de trabalho de PCR (se estiver usando). Para preparar a estação de trabalho, limpe a superfície do armário com um apropriado desinfectar e coloc os artigos exigidos na estação de trabalho e feche as portas. Ligue a luz UV durante 10 minutos</li>
	<li>Remover regentes e iniciadores do freezer e descongelar (reagentes listados na tabela 1 e primers na tabela 2). Nota: A mistura enzimática é armazenada em glicerol por isso não requer descongelar e deve ser mantido no gelo (ou em um bloco fresco) em todos os momentos. Todos os outros reagentes podem ser descongelados à temperatura ambiente.</li>
	<li>Uma vez descongelados, misture os reagentes e centrifugue brevemente para recolher o líquido. Nota: Não vórtice a mistura enzimática, basta centrifugar brevemente.</li>
	<li>Prepare misturas mestras separadas para o lyssavirus e o ß-Actin. Para cada reacção, adicionar 7,55 μL de água de grau molecular, 10 μL de 2x mistura de reacção verde universal SYBR, 0,6 μL de primer para a frente, 0,6 μL de primer reverso, 0,25 μL de mistura enzimática iTaq RT.
	<ol>
<li>Use uma planilha para calcular os volumes corretos para evitar erros no cálculo manual. Assegure-se de que o Master-Mix esteja preparado para compensar o erro de pipetagem. Portanto, se forem necessárias 10 reacções (ver nota em 3,1), prepare 12 reacções</li>
		<li>Prepare o mestre-misture no gelo (ou em um bloco fresco) e permaneça no gelo até que coloc na máquina do tempo real.</li>
	</ol></li>
	<li>Misture os Master-Mixes preparados, centrifugue brevemente e dispense 19 μL nos poços relevantes de tubos de strip ou uma placa de 96 poços compatível com a máquina em tempo real em uso. Nota: Minimize a produção de bolhas nos poços enquanto pipetagem.</li>
	<li>Em um quarto separado, ou em um armário UV preparado como descrito em 3,2, adicione com cuidado 1 μL do RNA ajustado previamente a 1 μg/μL (veja a etapa 1,5) abaixo da superfície do mestre-mistura apropriado bem e misture delicadamente. Descarte a ponta da pipeta em desinfetante diretamente após o uso (sob a superfície).
	<ol>
<li>Adicione os controles após as amostras de teste, com o controle positivo adicionado a seguir e o controle sem modelo (NTC – água de grau molecular) adicionado por último. A quantidade de RNA usada pode ser alterada dependendo do tipo de amostra, e a extração de RNA usada. A quantidade usada deve ser validada para garantir que a reação seja otimizada.</li>
	</ol></li>
	<li>Placa do selo usando as tampas ou o aferidor de tira que tomam o cuidado para assegurar-se de que todas as tampas estejam firmemente fechadas e rotuladas suficientemente para orientar as amostras. Rotule a borda dos tubos da placa/tira.</li>
	<li>Gire para baixo as amostras usando uma centrífuga para recolher todo o líquido na parte inferior dos poços.</li>
	<li>Placa de transferência à máquina do PCR do tempo real, abra a porta e coloc no suporte assegurando a posição/orientação corretas das amostras de acordo com a disposição da placa. Nota: Se as tiras do tubo forem usadas, assegure-se de que o suporte esteja no lugar.</li>
	<li>Abra o programa da máquina do PCR do tempo real e escolha a opção para o experimento em tempo real de SYBR com curva da dissociação. Programe a máquina de PCR em tempo real usando as condições de ciclagem térmica especificadas na tabela 3, incluindo os pontos de coleta de dados.</li>
	<li>Selecione SYBR como o corante fluorescente e selecione desconhecido como o tipo de amostra e insira um nome na caixa de nome de amostra correta. Nota: Diferenciar entre as repetições e também entre os poços de lyssavirus e ß-actina.</li>
	<li>Escolha um local de arquivo para salvar os dados experimentais, certifique-se de que a lâmpada será desligada no final da corrida e inicie a execução. Nota: Como o primeiro passo é um estágio RT, nenhum dado é coletado durante esse tempo, portanto, se a lâmpada exigir um período de aquecimento, isso pode ocorrer durante o estágio RT. A máquina e o software em tempo real exibirão as curvas de amplificação em tempo real, enquanto a curva de fusão será gerada no final do ciclo.</li>
</ol>4. análise de dados
<ol><li>
Depois que a execução tiver sido concluída, execute a análise de dados da seguinte maneira.
	<ol>
<li>Primeiro analise os resultados do gráfico de amplificação das amostras de teste ao lado das amostras de controle. As amostras positivas exibem rampas exponenciais, geralmente seguidas de platô e um valor de Ct . Amostras negativas exibem parcelas de amplificação planas sem valores de Ct (Figura 1a). O valor de Ct é calculado automaticamente pelo software, embora isso deva ser verificado e alterado manualmente, se necessário.</li>
		<li>Em segundo lugar, analisar os resultados da curva de dissociação das amostras de teste ao lado das amostras de controle. Uma amostra positiva terá uma temperatura de derretimento (Tm) 77 – 80 ° c, e sobrepõem-se com o controle positivo Figura 1b).</li>
		<li>Obtenha o resultado diagnóstico geral assegurando que os controles são válidos. Use a tabela 4 para interpretar os resultados em relação ao controle interno do ß-Actin. Se as amostras de controle positivo forem negativas e/ou as amostras negativas forem positivas, a corrida deve ser ignorada.</li>
		<li>Registre os valores de Ct e tm obtidos para o RNA de controle em um "cartão de controle" para permitir a análise de tendência e ajudar a identificar desvios na sensibilidade do ensaio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>OIE. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OIE+Terrestrial+Manual+2018%22">OIE Terrestrial Manual 2018</a>. , 8-14 (2018).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O ensaio de RT-PCR em tempo real do Pan-lyssavirus descrito é um ensaio de tubo fechado, de uma etapa, que detecta os lissavírus em todos os três grupos de filosgroups. O teste foi validado para o diagnóstico animal e humano da raiva, incluindo o tecido de cérebro post-mortem (idealmente brainstem), e as amostras ante-mortem tais como a biópsia da pele, a saliva serialmente coletada, ou o líquido espinal cerebral (CSF). Os primers utilizados neste ensaio foram primeiro concebidos e utilizados para um ensaio à base de sonda para diferenciar entre RABV, EBLV-1 e EBLV-23, que tem sido utilizado em muitos laboratórios de raiva OIE e executa consistentemente nos esquemas de proficiência eurl. Subseqüentemente a natureza do ' Pan-lyssavirus ' destes primers foi confirmada usando um ensaio em tempo real de 2 etapas15. O ensaio descrito aqui utilizou os primers para otimizar ainda mais a RT-PCR em um ensaio SYBR de uma etapa, permitindo um sistema de tubo fechado, rápido. Além disso, o treinamento em países endêmicos de raiva usando este ensaio confirmou a adequação para implementar em qualquer laboratório com EPI básicos e sistemas de qualidade para reduzir a contaminação cruzada e amostras de rastreamento, instalações para armazenar os reagentes e um tempo real máquina com detecção SYBR. O ensaio é extremamente robusto e tem correlação de 100% com a FAT, com sensibilidade melhorada para amostras decompostas3. Uma das principais vantagens de um ensaio de DNA intercalante à base de corante em comparação com um ensaio baseado em sonda é o custo relativo. Um benefício adicional é que o ensaio só utiliza dois primers, portanto, há menos risco de detecção falhou devido à divergência de seqüência, que tem sido uma fraqueza em ensaios previamente publicados com base em sonda. De fato, representantes de todas as espécies de lyssavirus (além de TWBLV e KBLV) são detectados usando este ensaio, e a análise sequencial de TWBLV e KBLV nos sítios primários não revela nenhuma divergência significativa sugerindo fortemente que eles também serão detectados usando Esse método. O intervalo de limite de detecção observado em todos os vírus analisados pode ser considerado devido a dois fatores principais. O primeiro é que o RNA foi isolado do material clínico do cérebro, conseqüentemente a quantidade de cópias do genoma em cada amostra não diluída não é diretamente comparável. O RNA foi "normalizado" ajustando o RNA total a 1 μg/μL; Entretanto, a proporção de RNA do genoma viral dentro dessa amostra variará. A segunda é a diversidade de sequências de lyssavirus, apesar dos sítios primários estarem localizados em regiões conservadas, permanecem posições de variação. Portanto, não é surpreendente que a maioria dos lissavírus com menor sensibilidade para o ensaio sejam vírus phylogroup II e III. A análise da curva de dissociação representa um parâmetro essencial, minimizando um resultado falso positivo que, de outra forma, poderia ocorrer devido à formação de dímeros de primer, ou amplificação de uma região não específica no genoma hospedeiro. Na realidade, esta é uma ocorrência rara e a análise da curva da dissociação é equivalente a funcionar um gel do agarose para visualizar os amplicons convencionais corretamente feitos medida do RT-PCR. O intervalo de valores aceitáveis de Tm foi fornecido (77-80 ° c), com base nos dados coletados em nosso laboratório. Recomenda-se vivamente que os laboratórios individuais agrupem os dados em casa para garantir que a gama seja transferível e altere em conformidade. A interpretação dos resultados das parcelas de amplificação e dissociação, juntamente com os controles positivo e negativo e os resultados da ß-actina, possibilita resultados diagnósticos robustos e reprodutíveis.
Fora do escopo deste protocolo está o método de extração de RNA usado para obter RNA de alta qualidade. Todos os RNA analisados neste protocolo foram preparados utilizando-se TRIzol; Entretanto, há muitos protocolos apropriados da extração do RNA das extrações baseadas em guanidium disponíveis, incluindo os jogos coluna e grânulo-baseados da extração. A manipulação de amostras positivas (ou suspeitas positivas) do lyssavirus deve estar dentro das facilidades licenciadas da biocontenção aprovadas dentro do país. No entanto, o RNA total extraído é não infeccioso, portanto manuseado em laboratórios de baixa contenção. Dependendo do método de extração utilizado, a necessidade de quantificar e diluir o RNA precisaria ser avaliada. Para extrações à base de fenóis, incluindo TRIzol, esta etapa é necessária e impede a inibição do ensaio de contaminar gDNA; no entanto, as extrações baseadas em coluna e talão (particularmente aquelas com estágio de depleção de DNA) não necessitam de diluição antes do teste.
Durante todo o protocolo, é essencial que o cuidado e a diligência sejam usados para impedir a contaminação cruzada e a adição exata da amostra aos poços corretos. Uma planilha com os cálculos de reagentes e layout da placa está disponível para download como um arquivo suplementar. Boas práticas de laboratório, incluindo superfícies de trabalho limpas, mudanças regulares de luvas, uso de pontas de barreira e diferentes salas/armários UV para separar cada estágio irá minimizar a chance de contaminação. Para garantir que o teste está realizando com parâmetros esperados, controles positivos e negativos devem ser incluídos e todas as amostras de teste são executadas em duplicado (ou triplicado).
A inclusão de controles é uma característica essencial de qualquer PCR, particularmente para diagnósticos. O RNA de controle positivo foi preparado a partir de cérebros de mouse infectados pelo CVS (padrão de vírus de desafio) em lotes e validado e calibrado para garantir a consistência entre os lotes. O RNA controle foi quantificado e diluído em 1 μg/μL. o RNA para o qual um resultado positivo foi obtido em uma diluição em série até pelo menos 10-4 (igual a 100 PG/μL) foi considerado apto para a finalidade. O RNA de controle positivo foi armazenado em-80 ° c em 10-1 alíquotas. Quando necessário, uma alíquota foi diluída 1:100 para fornecer um estoque de trabalho em 1 ng/μL e armazenada em-80 ° c em 5 μL de alíquotas de uso único. O RNA de controle positivo diluído foi utilizado para representar amostras positivas de baixo nível, e para garantir que qualquer redução na sensibilidade do ensaio foi detectada. Um "cartão de controle" foi mantido para cada controle para monitorar os valores de Ct e identificar tendências (tabela 5). A tabela 5 demonstrou boa comparabilidade inter-Run para a amostra de controle positivo CVS Ct e tm valores em vários dias e operadores, proporcionando garantia de que o ensaio é robusto e reprodutível. Os resultados que se desviam dessas medições devem ser investigados e amostras de teste repetidas se necessário. A água da classe molecular foi incluída em cada funcionamento como um NTC para confirmar que os reagentes estavam livres da contaminação com RNA do lyssavirus e confirmam uma amostra negativa. Além disso, para assegurar a eficácia da extração do RNA, o ß-Actin foi testado ao lado das amostras de teste em um tubo separado. O RNA de controle positivo do lyssavirus foi usado igualmente para o controle positivo do ß-Actin. Outros genes endógenos ou sistemas de controle interno heterólogo podem ser utilizados. O uso desses controles garantiu que todas as etapas foram analisadas nas mesmas condições que as amostras de teste. Ocasionalmente, se a amostra foi altamente degradada ou não contiver RNA hospedeiro suficiente (como saliva ou LCR), o gene endógeno PCR pode falhar. Neste caso, onde o resultado de RT-PCR em tempo real do lyssavirus foi positivo, a confirmação de uma extração de RNA independente-para descartar a contaminação durante a extração do RNA no teste original ou por um teste secundário (ou molecular, como a RT-PCR convencional) , ou FAT. O uso da tabela 4 durante a análise de uma amostra diagnóstica garantiu a interpretação correta.
Independentemente do ensaio molecular utilizado para confirmar a infecção da raiva, as investigações de seguimento utilizando o sequenciamento de Sanger para determinar as espécies de lyssavirus e as técnicas clássicas em virologia como a FAT ou o isolamento de vírus também devem ser empreendidas para permitir caracterização dos vírus e apoiar a notificação de casos positivos ao OIE e à OMS.

O diagnóstico de raiva por meio de metodologias moleculares foi aceito pelo OIE em 20181, reconhecendo as vantagens dessas técnicas na confirmação de casos de raiva, particularmente em situações em que as amostras são subideais, ou para o diagnóstico ante mortem, como não há nenhuma exigência para o vírus vivo ou amostras frescas. Os ensaios do PCR para lyssavirus exigem uma transcrição reversa (RT) antes que o PCR possa começar porque o genoma é RNA. Ensaios de RT-PCR que detectam a 3 ' região proximal do genoma são considerados os mais sensíveis, pois os gradientes transcricionais ocorrem durante a replicação do lissavirus. Os ensaios de RT-PCR comumente usados podem ser divididos amplamente em duas categorias, ponto final (ou em gel) e em tempo real. Ambas as abordagens são sensíveis e específicas; no entanto, o ensaio em tempo real tem alguns benefícios adicionais, como a obtenção de resultados em "tempo real" e sendo realizado em um sistema de tubos totalmente fechados, reduzindo assim o potencial de contaminação do operador. Existem duas abordagens principais para detectar os amplicões específicos de lyssavirus obtidos por meio de ensaios em tempo real. O primeiro utiliza sondas de hidrólise (tais como sondas TaqMan) que contêm um fluoróforo e um quencher. Quando a sonda liga-se à região-alvo durante a amplificação, a atividade da de do polymerase resulta na dissociação do fluoróforo e do quencher, permitindo que a fluorescência resultante seja medida. O segundo utiliza um DNA intercalating corante (fluorocromo como SYBR verde) que se liga ao DNA encalhado duplo durante a amplificação. Os fluorochromes acoplados emitem a fluorescência que é detectada em cada ciclo, permitindo a deteção e a quantificação em tempo real do produto. Devido à natureza não específica da ligação a qualquer dsDNA, uma análise de curva de dissociação é realizada para confirmar a especificidade da reação. Os RT-PCRs tempo real são rápidos devido aos tamanhos pequenos do amplicon, tipicamente menos de 200 BP do comprimento; no entanto, identificar regiões adequadas para projetar primers e sondas em regiões conservadas, pode revelar-se desafiador, portanto, remover a exigência de uma sonda é uma vantagem distinta.
Um número de RT-PCRs em tempo real foram projetados para detectar especificamente cepas individuais ou linhagens de rabv2 e também para detectar lyssavirus em todo o gênero3,4,5,6, 7,8,9. Todos os ensaios terão um limite de detecção dependente de como conservou a cartilha (e, se necessário, a sonda) seqüências são em todo o gênero. Com efeito, as estirpes emergentes ou novas de vírus podem tornar ineficazes os ensaios baseados em sonda altamente específicos. A escolha da deteção do tempo real (tintura contra a ponta de prova) dependerá da aplicação pretendida. Para um laboratório que conduz a fiscalização no material localmente originado do cérebro e que espera números elevados de amostras negativas, o uso da tintura intercalating mais barata é uma escolha sensata. A abordagem SYBR Green também seria ideal ao realizar a vigilância de varredura, onde a presença de lyssavirus novos ou divergentes permaneceria sem ser detectada por ensaios mais restritos baseados em sonda.
Todos os membros do gênero lyssavirus causam a raiva da doença, que é fatal uma vez que os sintomas aparecem. A grande maioria dos casos de raiva humana e animal é devido ao vírus da raiva (RABV), o reservatório dominante para o qual é o cão doméstico10. Os morcegos são importantes reservatórios hospedeiros para os lissavírus e todas as espécies de lyssavirus, mas duas caracterizadas, foram identificadas diretamente em morcegos — Ikoma lyssavirus (IKOV) e Mokola Virus (MOKV) — e destes dois, o IKOV tem sido especulado para ter um reservatório de hospedeiro morcego 11. além do que as 16 espécies reconhecidas do lyssavirus12, há dois lyssavirus que foram descritos recentemente: lyssavírus do bastão de Formosa (twblv)13 e lyssavirus do bastão de KOTALAHTI (KBLV)14. Os lissavírus podem ser geneticamente divididos em três fitógrupos, com a maioria dos lissavírus, incluindo o RABV, pertencente ao phylogroup I. Entretanto, os lyssavirus os mais divergentes pertencem ao phylogroup III e são improváveis ser detectados por RT-PCRs projetados alvejar as seqüências do vírus de RABV ou de phylogroup I.
O ensaio descrito aqui utiliza o par de primers em tempo real JW12-N165, descrito pela primeira vez em 20053. Os primers foram projetados para ser Pan-lyssavirus embora a aplicação original foi como um ensaio TaqMan com sondas para diferenciar espécies de lyssavirus. A confirmação subseqüente que o par da primeira demão era Pan-lyssavirus na especificidade foi conseguida utilizando um teste do tempo real de SYBR de 2 etapas em todas as espécies do lyssavirus disponíveis que incluem WCBV15. O par da primeira demão é descrito aqui em um ensaio em tempo real do RT-PCR de uma etapa que utiliza um fluorochrome de intercalação, validado usando representantes de todas as 16 espécies reconhecidas do lyssavirus. Este ensaio em tempo real de uma etapa é um ensaio rápido, sensível, de lissavirus-específico e demonstra que a robustez da primeira demão ajustou-se para identificar mesmo a espécie altamente divergente do lyssavirus.

<table><tbody><tr><td>Pontas de pipeta Art Barrier (vários tamanhos)</td><td>Thermofisher</td><td>várias</td><td></td></tr><tr><td>centrífugas</td><td>Beckman</td><td>Allegra 21R</td><td>Rotor capaz de conter placas de 96 poços necessárias. Etapa 3.8.</td></tr><tr><td>Centrífuga (mico)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipettes (para dispensar 0,5-1.000 &micro; L)</td> <td>Thermofisher</td><td>vários</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5150</td><td>Kits equivalentes podem ser usados se validados</td></tr><tr><td>MX3000P ou MX3005P sistema de PCR real-tme</td><td>Stratagene</td><td>N/A</td><td>As máquinas eqivalentes podem ser usadas se validadas</td></tr><tr><td>Base da placa de reação MicroAmp</td><td>Qualquer adequado</td><td></td><td>Usado para segurar a tira de tubos e as placas com segurança.</td></tr><tr><td>Tiras planas transparentes opticamente transparentes (8)</td><td>ABgene</td><td>AB-0866</td><td></td></tr><tr><td>Estrutura de ajuste perfeito (se estiver usando tiras de tubo)</td><td>Stratagene</td><td>N/A</td><td>Específico para a máquina</td></tr><tr><td>Primers: para detalhes do primer, consulte a Tabela 2.</td><td></td><td></td><td>Encomendado a 0,05 &micro; HPLC de escala mol purificada.</td></tr><tr><td>Thermo-Fast 96 plares bons, não contornados</td><td>ABgene</td><td>AB-600</td><td></td></tr><tr><td>Tiras Thermo-Fast (8) Thermo-tubes</td><td>ABgene</td><td>AB-0452</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de vórtice / Whirlimixer</td><td>Fisons Equipamento científico</td><td>SGP-202-010J</td><td></td></tr><tr><td>A menos que indicado, equipamentos alternativos podem ser usados</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tempo real rt-pcr do pan-lyssavirus para o diagnóstico da raiva

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Os ensaios moleculares são rápidos, sensíveis e específicos, e tornaram-se centrais para diagnosticar a raiva. Ensaios baseados em PCR têm sido utilizados há décadas para confirmar o diagnóstico de raiva, mas só recentemente foram aceitos pela OIE (Organização Mundial para a saúde animal) como método primário para detectar a infecção da raiva. Os ensaios de RT-PCR em tempo real fornecem dados em tempo real e são sistemas de tubos fechados, minimizando o risco de contaminação durante a instalação. Os ensaios de RT-PCR em tempo real intercalados com fluorocromo do DNA não necessitam de sondas caras, minimizando o custo por amostra, e quando os primers são projetados em regiões conservadas, os ensaios que são específicos em gêneros de vírus em vez de específicos a apenas um vírus espécies são possíveis. Aqui nós descrevemos um ensaio em tempo real do RT-PCR do Pan-lyssavirus SYBR que detecte lyssavirus através do género de lyssavírus , incluindo os vírus os mais DIVERGENTES ikov, WCBV e llebv. Em conjunto com a análise da curva de dissociação, este ensaio é sensível e específico, com a vantagem de detectar todas as espécies de lyssavirus. O ensaio foi adotado em muitos laboratórios diagnósticos com ambientes assegurados de qualidade, possibilitando diagnóstico robusto, rápido e sensível de casos de raiva animal e humana.

Este RT-PCR tempo real usando a tintura intercalando de dsDNA é apropriado diagnosticar infecções do lyssavirus. O método começa com o RNA extraído da raiva suspeita de amostras ante mortem ou post-mortem, detalhando a preparação da mistura mestra, adição de RNA, configuração da máquina em tempo real e interpretação correta dos resultados.

Tempo real RT-PCR do Pan-lyssavirus para o diagnóstico da raiva

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Este RT-PCR em tempo real é adequado para diagnosticar rapidamente a raiva em amostras pré-mortem e pós-morte. Os primers Pan-Lyssavirus foram otimizados para identificar todos os membros do gênero Lyssavirus. Este é um ensaio rápido, sensível e de tubos fechados que detecta vírus de todo o gênero Lyssavirus, incluindo espécies altamente divergentes de espécimes clínicos.A OIE recentemente aceitou ensaios moleculares para relatar infecção por raiva. Isso é particularmente importante para espécimes decompostos que nem sempre podem ser diagnosticados por métodos de detecção de vírus ou antígenos. Devido à sensibilidade deste ensaio, uma boa prática laboratorial, incluindo a separação dos diferentes estágios, é vital para minimizar o risco de contaminação.Demonstrando o procedimento será Daisy Jennings, uma diagnóstica do meu laboratório. Comece quantificando o RNA com um espectrômetro de micro volume. Certifique-se de que a máquina está configurada para RNA e use um a dois microliters de água de grau molecular para normalizar a máquina e estabelecer uma linha de base.Meça a concentração de RNA e ajuste-a a um micrograma por microlitera. Planeje o layout da sua placa PCR com uma planilha levando em conta as amostras de teste e controle. Prepare uma estação de trabalho PCR desinfetando superfícies e se usar um gabinete UV, ligue a luz UV 10 minutos antes de iniciar.Remova reagentes e primers do congelador para descongelar, mas mantenha a mistura de enzimas no gelo o tempo todo. Misture os reagentes e a centrífuga brevemente para coletar o líquido. Prepare as misturas mestres pcr para Lyssavirus e Beta-Actin de acordo com as instruções do manuscrito.Deixe as misturas mestres no gelo até estar pronto para usar. Misture e centrifufique as misturas mestre preparadas e distribua 19 microliters nos poços relevantes da placa compatível com a máquina PCR ou tira de tubo. Em uma sala separada ou um gabinete UV, adicione cuidadosamente um microliter do RNA preparado.Se usar um gabinete UV, ligue a luz UV 10 minutos antes de começar. Após as amostras de teste, adicione o controle positivo e o controle sem modelo. Ao adicionar o RNA às misturas mestres, certifique-se de que ele é adicionado ao bem correto.Use um plano de placa para ajudar nesta etapa. Sele a placa verificando se as tampas estão planas através da placa e gire-a para baixo para coletar todo o líquido na parte inferior dos poços. Certifique-se de que cada poço tenha o mesmo volume de líquido e nenhuma bolha seja visível.Em seguida, transfira as amostras para a máquina PCR. Abra o programa escolhendo sybr green com dissociação. Selecione os poços a serem analisados escolhendo desconhecidos como o tipo de amostra e SYBR como o corante fluorescente.Rotule os poços no layout da placa com as informações da amostra, incluindo se o ensaio é para Lyssavirus L ou Beta-Actin. Clique na configuração do perfil termo e modifique as condições de ciclismo térmico conforme especificado no manuscrito. Clique em iniciar e escolha um local para salvar o arquivo e marque a caixa para desligar a lâmpada no final da execução.Quando a opção de iniciar antes do aquecimento da lâmpada aparecer, clique em rodar agora, mas certifique-se de que a lâmpada tem menos de 15 minutos para aquecer. Quando a execução do PCR estiver concluída, proceda com a análise dos dados. Primeiro, analise os gráficos de amplificação do Lyssavirus.Amostras positivas apresentam rampas exponenciais, enquanto amostras negativas têm parcelas planas de amplificação sem valores de tomografia computadorizada. Em seguida, analise os resultados da curva de dissociação do Lyssavirus das amostras de teste ao lado das amostras de controle. Uma amostra positiva do Lyssavirus terá uma temperatura de fusão entre 77 e 80 graus Celsius e se sobreporá ao controle positivo.Em seguida, analise as parcelas de amplificação Beta-Actin e as curvas de dissociação comparando com os controles para interpretar o resultado geral. Veja o relatório de texto e use os detalhes para registrar os valores CT e TM obtidos para o RNA de controle em um cartão de controle para confirmar que a execução foi bem sucedida e que os resultados da amostra de teste podem ser relatados. Este protocolo é usado para demonstrar a sensibilidade do Pan-Lyssavirus RT-PCR em uma série de diluição de RNA de um vírus padrão de controle.A curva de amplificação indica que apenas 10 picogramas de Lyssavirus podem ser detectados e as curvas de dissociação verificam a temperatura de fusão do produto. A temperatura de fusão é usada para confirmar que a amplicon é específica do Lyssavirus. Os resultados aqui demonstram uma faixa de temperatura de fusão em todo o gênero Lyssavirus de 77,34 a 79,67 graus Celsius.Os valores de temperatura de fusão abaixo de 76,8 ou acima de 80,2 são considerados não específicos. A sensibilidade deste ensaio RT-PCR também é determinada pela detecção de RNA de três amostras cerebrais positivas do Lyssavirus. Apenas 0,1 picogramas por microliter de RNA alvo podem ser detectados para duas das três amostras.Notavelmente, representantes de todas as espécies reconhecidas do Lyssavirus são detectados usando este ensaio. Se analisar extratos de RNA de amostras clínicas como saliva ou CSF, os resultados da Beta-Actin podem ser negativos devido à falta de ácidos nucleicos hospedeiros. A adição de um controle exógeno pode resolver esse problema.Recomenda-se o sequenciamento de amostras positivas de Lyssavirus para fornecer informações adicionais sobre as origens geográficas e hospedeiras de uma infecção antirrábica. O manuseio de amostras positivas positivas ou suspeitas de Lyssavirus deve estar de acordo com as diretrizes locais de saúde e segurança. O RNA extraído não é infeccioso, portanto pode ser manuseado em laboratórios de baixa contenção.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um método quantitativo para detectar infecção viral usando PCR de transcrição reversa em tempo real. A etapa de transcrição reversa converte o RNA em cDNA, que é então amplificado por meio de ciclos de PCR. A presença de RNA viral na amostra é confirmada pela análise das curvas de amplificação e dissociação do DNA obtido a partir da PCR.

PCR de transcrição reversa quantitativa em tempo real para diagnóstico de infecções virais

Este protocolo introduz um procedimento de funcionamento padrão do laboratório para o teste diagnóstico de antígenos do lyssavirus nos bastões em Formosa.

Procedimento de funcionamento padrão para a vigilância do Lyssavirus da população do bastão em Formosa

Um Pan-lyssavirus Nested transcrição reversa da polimerase em cadeia foi desenvolvida para detectar especificamente todos os lissavírus conhecidos. A validação utilizando amostras cerebrais da raiva de diferentes espécies animais mostrou que este método tem sensibilidade e especificidade equivalentes ao teste padrão-ouro de anticorpos fluorescentes e pode ser utilizado para o diagnóstico rotineiro da raiva.

Avaliação de uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa universal aninhada para a detecção de lissavírus

Apresentamos um protocolo completo para o diagnóstico pós-morte da raiva animal em condições de campo usando um teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT), desde a amostragem da biópsia cerebral até a interpretação final. Também descrevemos outras aplicações usando o dispositivo para análise molecular e genotipagem viral.

Teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido pós-morte de campo para configurações limitadas de recursos com outras aplicações moleculares

Este protocolo apresenta uma abordagem baseada em qRT-PCR para determinar o número de cópia genética do vírus da raiva (N) dentro de várias estruturas anatômicas cerebrais bovinas usando transcrição in vitro.

Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho rápido e econômico para caracterizar genomas do vírus da raiva (RABV) usando a tecnologia de nanoporos. O fluxo de trabalho destina-se a apoiar a vigilância genômica informada em nível local, fornecendo informações sobre linhagens RABV circulantes e sua colocação dentro de filogenias regionais para orientar medidas de controle da raiva.

Sequenciamento do Genoma Completo para Caracterização Rápida do Vírus Rábico Utilizando Tecnologia de Nanoporos

Este protocolo demonstra o ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) pan-lyssavirus LN34 desde a coleta do tecido até a interpretação dos resultados, incluindo atualizações nas sequências e formulações de primers para melhorar o desempenho do ensaio para alguns lyssavirus e lagomorfos não anti-rábicos. Também demonstramos a configuração do ensaio para um formato multiplexado LN34 de poço único (LN34M).

Diagnóstico post-mortem de raiva em animais pelo ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real LN34 atualizado e multiplexado

Microglia residem macrófagos que fornecem a primeira linha de defesa e vigilância imune do sistema nervoso central. MicroRNAs são moléculas reguladoras, que desempenham um papel importante em muitos processos fisiológicos, incluindo a activação e diferenciação dos macrófagos. Neste artigo, descrevemos o método para a medição de microRNAs em microglia.

Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation

Nós descrevemos um método de imagem ao vivo de células que fornece insights sobre a dinâmica de proteínas durante o processo de ativação de células-T. Nós demonstramos a utilização combinada de a célula T-ensaio espalhamento, microscopia confocal e análise de imagens para se obter resultados quantitativos para seguir a formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Este protocolo descreve um ensaio qRT-PCR de alto rendimento para a análise de assinaturas de expressão de IFN tipo I e III. O ensaio discrimina diferenças de par de bases únicas entre os transcritos altamente semelhantes desses genes. Por meio da montagem em lote e pipetagem robótica, os ensaios são consistentes e reprodutíveis.

De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

Aprenda o método de RT-PCR em tempo real para diagnóstico rápido da raiva em amostras clínicas. Este ensaio sensível detecta todos os membros do gênero Lyssavirus, incluindo espécies altamente divergentes em espécimes clínicos.

Tempo real RT-PCR do Pan-lyssavirus para o diagnóstico da raiva

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