Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Culturas organoides de camundongos se assemelham mais à organização de células in vivo do que as culturas celulares tradicionais. Na pesquisa sobre câncer, organoides modelam o tumor original melhor que as linhas celulares 2D e podem ser usados para testar potenciais terapias cancerígenas in vitro para desenvolver novos tratamentos medicamentosos. Para a extração em bloco do sistema urogenital do rato macho segure a almofada de gordura em ambos os lados da bexiga e puxe para cima para expor o testículo.

Disseca cuidadosamente cada testículo longe do resto da região urogenital. Levante suavemente a bexiga para que a região urogenital seja elevada, expondo a uretra por baixo. Enquanto segura a bexiga, oriente a tesoura contra a parte inferior da próstata dorsal para incisar a uretra.

Toda a região urogenital será liberada da cavidade abdominal. Após a remoção do sistema urogenital, os linfonodos pélvicos posicionados imediatamente atrás do sistema urogenital e em ambos os lados da coluna serão expostos. Para remover os linfonodos orientar fórceps retos sob o tecido linfático e puxar para cima.

Em seguida, segure o reto com os fórceps retos e corte, puxando para cima no reto para desvendar todo o cólon e intestino delgado para procurar lesões metastáticas nos linfonodos mesentéricos. Quando todo o ípio tiver sido removido continue a puxar o duodeno para expor o estômago. Corte o esôfago para remover completamente o estômago.

Se forem observadas lesões metastáticas nos linfonodos, disseca cuidadosamente esses nós longe do intestino para armazenamento em PBS. Quando o estômago foi removido, o baço pode ser colhido do lado dorsal do abdômen para armazenamento em 4% de paraformaldeído. Remova o fígado para armazenamento em PBS.

Remova os rins de ambos os lados da coluna, juntamente com quaisquer linfonodos renais contendo lesões metastáticas. Para expor a cavidade torácica corte cuidadosamente o diafragma ao longo da caixa torácica. A pressão negativa liberada dentro da cavidade torácica exporá o coração e os pulmões.

Puxe para cima no esterno para abrir ainda mais a cavidade torácica. Escaneie a face ventral da cavidade torácica ao longo da caixa torácica para lesões metastáticas nos linfonodos torácicos para dissecção, se presente. Enquanto ainda segura o esterno, corte a caixa torácica ventral para acessar o coração e os pulmões e puxe para cima no coração para cortar sob os pulmões.

Para remover totalmente o coração e os pulmões em bloco cortar todos os vasos sanguíneos anteriores na traqueia. Transfira cuidadosamente o coração sem danificar o tecido pulmonar ou lesões metastáticas pulmonares em um recipiente de PBS. Para dissecção do tumor de próstata coloque a região urogenital sob um microscópio de dissecção.

Use um par de fórceps retos e um par de fórceps curvos para virar a região urogenital em sua superfície dorsal. Localize a região da próstata proximal que pode ser identificada pela cor rosa-vermelha da uretra. Segure firmemente a uretra para permitir a manipulação do tecido urogenital com as fórceps curvas.

Localize a base das vesículas seminais para permitir sua remoção cuidadosa. Em seguida, use o lado curvo dos fórceps para remover os adiamentos vas e o máximo de tecido gorduroso e conjuntivo possível. Enquanto ainda segura firmemente a uretra e a região da próstata proximal, use um par de tesouras pontiagudas finas para remover a bexiga da uretra.

Segurando a região da próstata proximal e a uretra firmemente com os fórceps retos agarram a região da próstata anterior com o lado curvo dos fórceps para puxar firmemente o tecido para longe da bexiga e do resto da próstata. Coloque o tecido anterior da próstata na PBS e localize a região da próstata ventral. Remova a região da próstata ventral da mesma forma.

Se a região lateral pode ser distinguida da região dorsal remova a região lateral da próstata em ambos os lados. Em seguida, remova a região da próstata dorsal e coloque a região da próstata proximal em 4% de paraformaldeído. Após a picar, coloque os pedaços do tumor em um tubo de 15 mililitros de tampão de digestão para uma digestão de uma hora e meia a duas horas a 37 graus Celsius.

No final da digestão, sedimente o tecido digerido por centrifugação e descarte o sobrenante. Flick o tubo para soltar a pelota da célula. Resuspenque as células em um mililitro de trippsina pré-aquecida complementada com 10 micromolar Y-27632 FOD inibidor por cinco minutos a 37 graus Celsius.

No final da incubação, triturar o chorume tecidual cinco vezes com uma ponta padrão de pipeta P1000. Devolva o tubo ao banho de água para uma incubação e trituração adicionais de cinco minutos. Para a cúpula matricial, lave as células digeridas em nove mililitros de meio frio, depois colete as células por centrifugação.

Resuspend as células em um mililitro de meio fresco para contar. E depois de contar, colete as células por centrifugação mais uma vez. Diluir as células tumorais no volume apropriado da matriz.

Solte cuidadosamente 200 microliters de solução de células matricitárias em cada poço de uma placa de seis poços aquecidas de 55 graus Celsius. Deixe as cúpulas solidificarem à temperatura ambiente por dois minutos antes de colocar a placa de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 graus Celsius por 20 minutos. Quando as cúpulas tiverem solidificado, adicione dois mililitros de organoide de próstata suplementados com andrógeno R1881 e inibidor de ROCHA a cada poço.

Devolva a placa à incubadora de cultura celular. Imagens de dissecção fluorescente revelam proteína fluorescente verde, ou expressão GFP, por tumores de próstata sólidos, indicando que as células tumorais expressam Cre. O fígado e os pulmões do mesmo animal apresentam tumores metastáticos expressando GFP demonstrando que esses tumores se originaram do tumor primário da próstata.

O linfonodo pélvico deste camundongo expressa GFP e não Tomate, indicando que este tumor metastático ultrapassou o linfonodo e nenhum tecido normal permanece. No primeiro dia de cultura, pequenos organoides gerados a partir de um tumor de próstata sólido começam a se formar com células expressas de Tomate e GFP presentes na cultura organoide tumoral. No sétimo dia e além, quando os organoides tumorais da próstata se formaram totalmente, no entanto, os organoides expressam GFP, mas não tomate, sugerindo que os organoides se originaram de células tumorais que expressam Cre e não de células epiteliais normais.

No primeiro dia de cultura de pequenos organoides gerados a partir de tumor de próstata cheio de fluidos, as células expressas pelo Tomate e GFP estão presentes dentro da cultura organoide. Organoides de tumores de próstata preenchidos com fluidos expressam gfp ou tomate no sétimo dia e além, no entanto, indicando que os organoides formados a partir de células que não expressam Cre. Para se manter orientado na colheita do tecido da próstata, fique atento às posições da bexiga e uretra o tempo todo.

Após sua geração, os organoides podem ser usados em aplicações de imagem, análise de biologia molecular e telas de drogas.