Name: Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a avaliar viabilidade celular e morte em culturas esferoides 3D de células cancerosas. Este método otimizado melhora a avaliação da eficácia de drogas anticâncer e facilita a tradução para condições in vivo.

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Agradecemos a Katrine Franklin Mark e Annette Bartels pela excelente assistência técnica e pela Asbjørn Nøhr-Nielsen para realizar os experimentos na figura 1D. Este trabalho foi financiado pela Fundação Einar willumsen, pela Fundação Novo Nordisk e pela Fondation Juchum (tudo para SFP).

1. geração de spheroids
<ol><li>Preparando suspensões de células para formação de esferóides Nota: as linhas celulares diferentes têm propriedades de adesão muito diferentes e o protocolo de formação de esferóide mais adequado deve ser estabelecido em cada caso. Nós encontramos que as pilhas de MCF-7 e de bxpc-3 são apropriadas para a formação esferóide espontânea, quando MDA-MB-231, skbr-3, Panc-1 e miapaca exigirem a adição de membrana reconstituída do porão para dar forma com sucesso a spheroids. Somente as pilhas de MDA-MB-231 e de BxPC-3 foram empregadas para o protocolo de gota de suspensão, porém outras linhas de pilha são certamente aplicáveis.<ol>
<li>Cresça as células como monocamada até 70-80% de confluência.</li>
		<li>As células de lavagem com tampão fosfato salina (1X PBS, 5 mL para um 25 cm2 ou 10 ml para um 75 cm2 balão), adicionar a célula dissociação enzimática (0,5 ml para um 25 cm2 ou 1 ml para um 75 cm2 balão) e incubar as células para 2-5 min a 37 ° c em 5% CO2 e 95% umidade.</li>
		<li>Verific o destacamento da pilha um microscópio e neutralizar a enzima da dissociação da pilha adicionando o meio de crescimento (soro de 6-10% dependendo da linha de pilha) a um volume total de 5 ml em uns 25 cm2 ou 10 ml para um balão de 75 cm2 .</li>
		<li>Use uma câmara de Bürker para contar pilhas e para contar 8 quadrados na câmara por a preparação da pilha para obter uma reprodutibilidade elevada do tamanho dos spheroids. Nota: Três protocolos cada um descrevendo um método diferente para a formação do esferóide são apresentados abaixo. O protocolo 1,2 e o 1,3 podem ser usados para todos os protocolos analíticos subseqüentes apresentados, visto que o protocolo 1,4 é serido melhor para preparações da incorporação e do lisado. Dependendo da linha celular, a formação de esferóides leva 2-4 dias, independentemente do método utilizado.</li>
	</ol></li>
	<li>Formação esferóide espontânea
	<ol>
<li>Execute etapas 1.1.1-1.1.4.</li>
		<li>Diluir a suspensão celular em um tubo de 15 mL para obter 0,5-2 x 104 células/ml (a densidade celular ideal precisa ser determinada para cada linha celular) (Figura 1a (II)).</li>
		<li>Encha o anel externo de poços com 1X PBS ou meio de crescimento para reduzir a evaporação dos poços restantes. Transfira a suspensão da célula para um reservatório estéril e, utilizando uma pipeta multicanal, dispense 200 μL/poço em placas de fundo redondo de encaixe Ultrabaixa 96-well (Figura 1a (III)).</li>
		<li>Incubar a placa em uma incubadora em 37 ° c com 5% CO2, 95% umidade.</li>
		<li>Cada 2-3 dias adquirem imagens microscópicas claras dos esferóides. Nota: As imagens neste papel são tomadas na ampliação 11.5 x, que é apropriada para a maioria de esferoides preparados usando estes protocolos.</li>
		<li>A cada 2-3 dias (após a aquisição de imagens) substitua 100 μL de meio (remova 100 μL do meio gasto e substitua por 100 μL de meio fresco. Nota: Para evitar a remoção de esferóides ao substituir o meio, é aconselhável inclinar a placa um pouco enquanto lentamente removendo o meio e inspecionar o meio aspirado nas pontas para esferóides visíveis antes de descartá-lo.</li>
	</ol></li>
	<li>Formação esferóide membrana-negociada reconstituída do porão. Nota: foi utilizado o vírus da lactose desidrogenase elevante (LDEV)-livre redução do fator de crescimento reconstituído de membrana basal (rBM). rBM é temperatura-sensível e deve sempre ser mantido no gelo, porque coagirá se alcanga 15 ° c. Descongelar o rBM no gelo durante a noite a 4 ° c ou 2-4 h à temperatura ambiente (RT) antes do chapeamento.<ol>
<li>Thaw rBM no gelo (ver tabela de materiais).</li>
		<li>Mantenha as placas e reservatórios (se embalados individualmente) no gelo antes de usar.</li>
		<li>Execute etapas 1.1.1-1.1.4.</li>
		<li>Encha o anel externo de poços com 1X PBS ou meio de crescimento para reduzir a evaporação dos poços restantes. Diluir a suspensão celular em um tubo de 15 mL para obter 0,5-2 x 104 células/ml (a densidade celular ideal precisa ser determinada para cada linha celular) (Figura 1a (II)).</li>
		<li>Coloque o tubo de 15 mL contendo a suspensão celular diluída no gelo (por exemplo, na taça de vidro) (Figura 1a (IIA)).</li>
		<li>Transfira as placas refrigeradas e os reservatórios para o capô. Enxágüe recipientes plásticos, encha-os com o gelo e transfira-os na capa para permitir que as placas e os reservatórios sejam coloc no gelo durante o procedimento inteiro.</li>
		<li>Resuspend rBM suavemente para garantir um gel homogêneo.</li>
		<li>Adicionar 1-2% rBM (a concentração óptima precisa de ser determinada para cada linha celular) às suspensões refrigeradas da pilha (Figura 1a (IIB)).</li>
		<li>Inverta o tubo de 15 mL para assegurar a mistura adequada de rBM e suspensão celular antes de dispensar a suspensão na chapa.</li>
		<li>Transfira a suspensão de células contendo rBM para um reservatório estéril e dispense 200 μL/poço em placas refrigeradas de baixo valor 96-well com uma pipeta multicanal (Figura 1a (III)). Nota: Se trabalhar com várias suspensões celulares (por exemplo, mais de uma linha celular), é essencial dispensar cada suspensão celular imediatamente após a adição de rBM para evitar o gelamento prematuro.</li>
		<li>Centrifugue a placa por 15 min em 750 x g usando ' soft decente '/no travagem (se possível, centrifugar a 4 ° c para manter o fluido RBM mais longo, mas não um requisito para a formação de esferóide bem sucedido), para garantir que as células estão agrupadas quando o RBM endurece, facilitando a formação de um único esferóide.</li>
		<li>Incubar a placa em uma incubadora (37 ° c, 5% CO2, 95% umidade).</li>
		<li>Cada 2-3 dias adquirem imagens microscópicas claras para avaliação do crescimento esferóide.</li>
		<li>A cada 2-3 dias substitua 100 μL de meio (remova 100 μL e substitua por 100 μL de meio fresco).</li>
	</ol></li>
	<li>Spheroids pendurados da gota.
	<ol>
<li>Execute a etapa 1.1.1-1.1.4.</li>
		<li>Diluir as células para obter uma diluição adequada. Uma diluição prática é 50.000 células/mL.</li>
		<li>Retire a tampa de um prato de cultura de 10 cm2 células e colocá-lo para que ele enfrenta para cima. Adicionar 6 mL de 1X PBS ao prato (Figura 1B (i)).</li>
		<li>Despeje a suspensão celular em um reservatório estéril e coloque cuidadosamente até 30 gotas de 40 μL de suspensão celular na tampa do prato de cultura celular usando uma pipeta multicanal (Figura 1B (II)), resultando em uma concentração de 2.000 células/gota. Evite colocar as gotas muito perto da borda da tampa como estas gotas são mais propensos a perder a tensão superficial ao inverter a tampa na etapa seguinte.</li>
		<li>Inverta a tampa em um movimento rápido mas controlado e coloque-o em cima do prato de cultura celular contendo 1X PBS (Figura 1B (III)).</li>
		<li>Coloque o prato em uma incubadora a 37 ° c com 5% de CO2 e 95% de umidade sem perturbar as gotas e deixá-los crescer por 4-6 dias.</li>
		<li>Se a ser utilizado para a proteína lisados ou incorporação, esferoides piscina, removendo a tampa e incliná-lo, a fim de lavar as gotas com 1 ml de meio aquecido. Transfira o meio resultante contendo esferóides para um tubo de 1,5 mL e permita que eles se instalem na parte inferior do tubo. Proceder como descrito em 4,4 e 6.2.2 para proteínas lisados e incorporação, respectivamente.</li>
	</ol></li>
</ol>2. tratamento medicamentoso de spheroids
Nota: O tratamento a longo prazo da droga pode ser aplicado aos esferoides a fim telar para efeitos de uma droga do interesse. Antes de iniciar o tratamento medicamentoso, é aconselhável realizar um experimento de resposta da dose do (s) fármaco (es), a fim de encontrar uma dose adequada para o tratamento experimental. As doses devem basear-se na determinada IC50/ki da droga e variam de cerca de 0,2 x-10x deste valor.
<ol><li>Configurar 6-12 esferoides por condição desejada conforme descrito em 1,2 ou 1,3 e colocar na incubadora (37 ° c, 5% CO2, 95% umidade) por 2 dias.</li>
	<li>No dia 2, leve imagens microscópicas claras dos esferóides.</li>
	<li>Prepare as primeiras doses de tratamento (depois de adquirir imagens). Nota: A primeira concentração de tratamento deve ser duas vezes a concentração final desejada, pois a solução será diluída 1:2 em adição ao poço contendo 100 μL de meio. Intervalos sugeridos de tratamento medicamentoso (dependerá da meia-vida da droga): dia 2, 4 e 7.</li>
	<li>Usando uma pipeta multicanal, remova suavemente 100 μL de meio e substitua-o por 100 μL de meio contendo medicamentos.</li>
	<li>Coloc a placa 96-well para trás na incubadora em 37 ° c com 5% CO2 e 95% umidade e repita 2,3 e 2,4 nos dias escolhidos do tratamento mas agora sem dobrar a dose para obter a dose final correta.</li>
	<li>No último dia da programação do protocolo/tratamento, pode-se realizar um ou vários dos seguintes ensaios.</li>
</ol>3. ensaio de viabilidade celular para spheroids
<ol><li>Configurar 4-6 esferoides por condição desejada conforme descrito em 1,2 ou 1,3 e colocar na incubadora a 37 ° c com 5% de CO2 e 95% de umidade. Nota: Neste caso, o ensaio de viabilidade celular foi realizado no dia 7 ou 9, após ter monitorado o crescimento esferóide a cada 2-3 dias por microscopia de luz, como descrito acima (ponto 1.2.5 e 1.3.13).</li>
	<li>Descongele o reagente do ensaio de viabilidade (ver tabela de materiais) e deixe-o equilibrar a RT antes da utilização.</li>
	<li>Misture suavemente invertendo para obter uma solução homogênea.</li>
	<li>Antes de realizar o ensaio, retire 50% do meio de cultura dos esferóides (100 μL).</li>
	<li>Adicionar reagente de viabilidade celular a cada poço em uma proporção de 1:3 para a quantidade de meio presente no poço (Figura 2a (i)) para uma placa de 96 poços, adicione 50 μl de reagente a 100 μl de meio.</li>
	<li>Misture o conteúdo vigorosamente durante 5 min para induzir a lise celular (Figura 2a (II)).</li>
	<li>Incubar durante 25 min na RT para estabilizar o sinal luminescente (Figura 2a (III)).</li>
	<li>Registe o sinal luminescente (Figura 2a (IV)).</li>
</ol>4. preparando lysates da proteína para o western blotting das culturas do spheroid 3D
Nota: Ao coletar os esferoides, é aconselhável usar uma pipeta P200 e cortar a extremidade da ponta para permitir uma abertura mais grande e daqui uma captação mais fácil dos esferoides sem perturbar sua estrutura.
<ol><li>Para cada condição, pool de um mínimo de 12, idealmente 18-24 esferoides (dependendo do tamanho esferóide) em um tubo de 1,5 ml (Evite 2 tubos de ml, como os próximos passos se tornará mais difícil devido à sua inferior pointy menor). Nota: Se a quantidade de meio exceder 1,5 mL antes de ter recolhido todos os esferóides, permita que os esferóides recolhidos se instalem na parte inferior (acontece muito rapidamente, centrifugação não é necessário) e descartar metade do volume do tubo antes de continuar a recolher o spheroids restantes.</li>
	<li>Coloque os tubos no gelo e deixe que os esferóides se instalem na parte inferior do tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Mova-se do laboratório de células estéreis para o laboratório regular.</li>
	<li>Lave esferoides duas vezes em 1 ml de gelo-frio 1X PBS. Deixe esferoides resolver antes de remover 1X PBS entre cada etapa de lavagem.</li>
	<li>Aspirar o máximo de 1X PBS possível sem perturbar ou remover os esferóides.</li>
	<li>Adicionar 5 μL de tampão de Lise aquecida (LB) com inibidores da fosfatase e protease, por esferóide (por exemplo, 10 esferoides = 50 μL LB).</li>
	<li>Repita os intervalos de vórtice seguidos de girar para baixo até que os esferóides sejam dissolvidos. Realize um ciclo de vortexing por 30 s seguido por centrifugação (uma rotação rápida usando uma centrífuga de mesa é suficiente) para 10 s por aproximadamente 5-10 min, dependendo do tamanho e da compacidade dos esferóides. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Mantenha os lisados a-20 ° c até prosseguir com sonication, homogeneização e determinação da proteína como em um protocolo padrão do lisado da proteína 2D, seguido pelo western blotting usando protocolos padrão.</li>
</ol>5. iodeto de propiídio (PI) coloração de esferóides
<ol><li>Configurar 3-6 esferoides por condição desejada conforme descrito em 1,2 ou 1,3 e coloque na incubadora a 37 ° c com 5% de CO2 e 95% de umidade.</li>
	<li>Em um laboratório estéril da cultura da pilha, aqueça 1X PBS a 37 ° c.</li>
	<li>Faça uma solução de PI de 4 μM diluindo a solução de estoque em 1X PBS: dilua um estoque aquoso de 1 mg/mL de PI 1:350 em 1X PBS. Nota: Esta concentração será ainda mais reduzida após a adição da solução aos poços que dão uma concentração final de 2 μM. 100 μL desta solução é necessária para cada poço contendo um esferóide. Atenção: O iodeto do propidium (PI) deve ser segurado em uma capa das emanações e em luvas desgastando. PI é sensível à luz. Proteja da luz ao manusear.</li>
	<li>Remova 100 μL do meio de cada poço na placa 96-well sem remover os esferóides.</li>
	<li>Lave o meio restante adicionando 100 μL de 1X PBS aquecido a todos os poços seguidos removendo 100 μL do líquido nos poços. Repita este passo de lavagem 3 vezes.</li>
	<li>Adicione 100 μL da solução de PI a cada poço, cubra a placa na folha de alumínio e coloque-a em uma incubadora a 37 ° c com 5% de CO2 e 95% de umidade para 10-15 min.</li>
	<li>Repita as 3 etapas de lavagem descritas em 4,5 para lavar para fora a solução do PI, a fim diminuir o sinal do fundo quando imagem latente.</li>
	<li>Use um microscópio de epifluorescência para a imagem dos esferóides. Para avaliar a viabilidade das células no núcleo esferóide tomar z-Stacks para obter imagens com diferentes profundidades do esferóide. Nota: Um tamanho de passo em torno de 18-35 μm entre cada fatia dependendo do tamanho do esferóide é aconselhável, dando aproximadamente 11-18 pilhas por esferóide. Z-Stacks podem ser processados em ImageJ usando a função de projeção z, que pode combinar todas as pilhas z em uma imagem final, dando uma visão geral da coloração em todo o esferóide (para mais orientações sobre o uso de ImageJ para esta finalidade, ver (https://ImageJ.net/Z-Functions).</li>
</ol>6. incorporação de spheroids 3D
<ol><li>
Prepare o gel do agarose em que os esferoides são incorporados (somente a primeira vez necessária que executa o protocolo).
	<ol>
<li>Misture 1 g de bactoagar em 50 mL de ddH2O.</li>
		<li>Aqueça lentamente no forno de microondas até que o bactoagar se dissolveu e um gel homogêneo se formou. Não deixe ferver o gel.</li>
		<li>Mantenha o bactoagar aquecido num banho de água a 60 ° c.</li>
		<li>Manter a 4 ° c entre experimentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incorporação de esferóides.
	<ol>
<li>No dia 1, para cada condição, pool de um mínimo de 12 esferóides em um tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Lave uma vez com 1 mL de gelo-frio 1X PBS.</li>
		<li>Para fixar os esferóides, adicione 1 mL de paraformaldeído a 4%. Nota: A manipulação do paraformaldeído deve ser executada em uma capa das emanações.</li>
		<li>Deixe-os incubar por 24 h em RT.</li>
		<li>No dia 2, aqueça o gel de agarose com cuidado, colocando-o em um copo cheio de água em um forno de microondas. Assegure-se de que o gel não ferva! Mantenha aquecido em uma placa de aquecimento de bancada, a 60 ° c até o uso.</li>
		<li>Lave esferoides duas vezes com 1 ml de gelo-frio 1X PBS.</li>
		<li>Aspirar a maior parte do 1X PBS (deixando aproximadamente 100 μL neste momento é prático para lidar com os esferóides).</li>
		<li>Prepare uma pipeta de 20 μL cortando a ponta da pipeta em uma inclinação para obter uma ponta mais pontuda com um furo maior (veja a ilustração). Nota: A parte seguinte tem que ser feito rapidamente para assegurar a transferência ideal do esferóide e para evitar a solidificação da gota do gel. Se nenhum bloco de aquecimento está disponível, recomenda-se primeiramente travar os esferoides e então fazer a gota do agarose (isto é, comutar a ordem dos pontos 6.2.9 e 6.2.10).</li>
		<li>Faça uma gota do gel do agarose em uma corrediça do microscópio. Coloc a corrediça em um bloco morno do aquecimento para impedir que o agarose solidificying.</li>
		<li>Usando a ponta modificada da pipeta (Veja 6.2.8), trave tantos como esferoides como possível em um volume de 15-20 μl.</li>
		<li>Injete com cuidado o 15-20 μL spheroid-contendo 1X PBS no centro da gota do gel do agarose sem tocar na corrediça do microscópio. Nota: Este é um ponto um pouco difícil. Os esferoides serão perdidos se a ponta da pipeta tocar na corrediça do microscópio ao injetar os esferoides na gota do gel. É aconselhável praticar todo o processo de fazer a gota do agarose e injetando os esferoides injetando um líquido colorido na gota. Isto permitirá a visualização de uma penetração potencial através da gota, porque o líquido colorido estará escapando para fora na corrediça.</li>
		<li>Deixe a gota do gel do agarose endurecer incubando por 5-10 minutos em RT ou em 4 ° c. Uma vez que a gota do gel solidificado um tanto (mas é ainda rather macia), empurre com cuidado a gota do gel da corrediça do microscópio em uma gaveta plástica do tecido com um bisturi.</li>
		<li>Cubra as fitas plásticas do tecido em 70% de etanol. Nota: Neste ponto os esferoides podem ser usados diretamente ou armazenados por meses.</li>
		<li>Incorpore o esferóide agarose-encaixado na parafina, seção em corrediças grossas da camada de 2-3 μm e mancha com hematoxilina e eosina ou sujeito à mancha immuno-histológica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Michel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+modeling+of+the+proliferation+gradient+in+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids.</a> Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).</li>
<li>Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+tumor+culture+systems+for+functional+drug+testing+and+therapy+response+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction.</a> Future Science OA. 3 (2), (2017).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses.

O uso de esferoides da pilha do cancro 3D provou uma ferramenta valiosa e versátil não somente para a seleção anticâncer da droga, mas igualmente para ganhar a introspecção mecanicista na regulação da morte e da viabilidade da pilha de cancro as circunstâncias que imitam aquelas no tumor microambiente. Isto é particularmente crucial porque a acessibilidade, a captação celular, e os efeitos intracelular de drogas quimioterapêuticas são impactados profundamente pelas condições físico-químicas no tumor, incluindo o pH, a te...

O uso de modelos de esferóide multicelular na biologia do câncer é de várias décadas1,2, mas ganhou um impulso substancial nos últimos anos. Em grande parte, isso reflete o aumento da consciência de quão fortemente o fenótipo das células cancerosas é dependente do seu microambiente e condições de crescimento específicas. O microambiente em tumores sólidos é fundamentalmente diferente do que nos tecidos normais correspondentes. Isso inclui condições físico-químicas como pH, tensão de oxigênio, bem como pressão intersticial, gradientes de concentração de fatores solúveis, como nutrientes, resíduos e compostos de sinalização secretados (fatores de crescimento, citocinas). Além disso, inclui a organização da matriz extracelular (ECM), interações célula-célula e sinalização intercelular, e outros aspectos da arquitetura tridimensional (3D) particular do tumor3,4, 5,6. As condições microambientais específicas em que as células cancerosas existem, afetam profundamente seu perfil de expressão gênica e propriedades funcionais, e é claro que, em comparação com a das células cultivadas em 2D, o fenótipo de esferóides 3D muito mais estreitamente imita o dos tumores in vivo7,8,9,10,11. os modelos 2D, mesmo se empregam a hipóxia, o pH ácido, e as concentrações elevadas do lactato para imitar aspectos conhecidos do microambiente do tumor, ainda não conseguem capturar os gradientes de parâmetros physico-químicos que levantam-se dentro dos tumores, assim como seu tumor 3D Arquitetura. Por outro lado, os modelos animais são dispendiosos, lentos e eticamente problemáticos, e geralmente, também têm deficiências na sua capacidade de recapitular as condições do tumor humano. Consequentemente, os esferóides 3D têm sido aplicados como um modelo de complexidade intermediária em estudos de uma ampla gama de propriedades da maioria dos cânceres sólidos9,11,12,13, 14,15,16,17.
Um uso amplamente empregado de esferóides 3D está em ensaios de triagem da eficácia da terapia anticâncer9,18,19,20. As respostas ao tratamento são particularmente sensíveis ao microambiente tumoral, refletindo tanto o impacto da tortuosidade, a difusão restrita, a alta pressão intersticial, quanto o pH ambiental ácido na entrega de fármacos, e o impacto da hipóxia e outros aspectos do microambiente na resposta de morte celular9,17. Porque o ambiente dentro de esferoides 3D inerentemente desenvolve todas essas propriedades7,8,9,10,11, empregando culturas de células 3D pode melhorar substancialmente a tradução dos resultados para as condições in vivo, mas permitir uma triagem eficiente e acessível de alta taxa de transferência do crescimento líquido. No entanto, a grande maioria dos estudos sobre a resposta medicamentosa das células cancerosas ainda são realizadas em condições 2D. Isso provavelmente reflete que, enquanto alguns ensaios podem ser relativamente facilmente implementados para culturas de células 3D, muitos, como ensaios de viabilidade, western blotting, e análise de imunofluorescência, são muito mais convenientemente feito em 2D do que em 3D.
O objetivo do presente trabalho é fornecer ensaios facilmente amáveis e protocolos precisos para análises do efeito do tratamento com medicamentos anticancerígenos sobre a viabilidade de células cancerosas e sobrevivência em um tumor 3D que imita o ajuste. Especificamente, fornecemos e comparamos três métodos diferentes para a formação de esferóides, seguidos de métodos para análises qualitativas e quantitativas de crescimento, viabilidade e resposta a medicamentos.

<table><tbody><tr><td>2-(4-amidiminofenil)-1H-indol-6-carboxamidina (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td># C10595&nbsp;</td><td>Para coloração de núcleos</td></tr><tr><td>5-Fluorouracil (5-FU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F6627</td><td>Componente no tratamento quimioterápico</td></tr><tr><td>5-(N-etil-isopropil) amilorida (EIPA)</td><td>Life Technologies</td><td>#E3111</td><td>Inibidor do anticorpo NHE1</td></tr><tr><td>contra PARP e sinalização celular cPARP</td><td></td><td>#9542</td><td>Usado em western blotting</td></tr><tr><td>Anticorpo contra sinalização celular Ki-67</td><td></td>#<td>9449</td><td>Usado para IHC</td></tr><tr><td>Anticorpo contra a</td><td>sinalização celular</td> p53<td>#2524&nbsp;</td><td>Usado para IHC</td></tr><tr><td>Anticorpo contra &beta;-actina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5441</td><td>Usado em western blotting</td></tr><tr><td>Bactoagar</td><td>BD Bioscience</td><td>#214010</td><td>Usado para preparação de gel de agarose</td></tr><tr><td>Escada de proteína de referência</td><td>Invitrogen</td><td>#10747-012</td><td>Usado para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Bio-Rad DC Protein Assay kit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>#500-0113, #500-0114, #500-0115&nbsp; &nbsp;</td><td>Usado para determinação de proteínas a partir de lisados</td></tr><tr><td>B&uuml; câmara rker</td><td>Marienfeld</td><td>610311</td><td>Para contagem de células&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência BX63</td><td>Olympus</td><td></td><td>Usado para imagens fluorescentes</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>#G9681</td><td>Usado para o ensaio de viabilidade celular</td></tr><tr><td>Cisplatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4394&nbsp;</td><td>Componente no tratamento quimioterápico</td></tr><tr><td>Microplaca Corning Spheroid, 96 poços, Preto com fundo redondo transparente,&nbsp; Fixação ultra-baixa, Com tampa, Estéril</td><td>Corning</td><td>#4520</td><td>Usado para o crescimento de esferoides com medições de luminescência como ponto final</td></tr><tr><td>Corning 96 bem, fundo redondo claro,&nbsp; Microplaca de fixação ultrabaixa, Com tampa, Estéril</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>Suficiente para o crescimento esferóide sem medições de luminescência como ponto final</td></tr><tr><td>Criterion TGX Géis Pré-fabricados</td><td>Bio-Rad</td><td>5671025</td><td>Utilizado para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Doxorrubicina</td><td>Abcam</td><td>#120629</td><td>Componente no tratamento quimioterápico</td></tr><tr><td>FLUOStar Optima Leitor de microplacas</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Usado para gravação de luminescência&nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldeído&nbsp;</td><td>VWR Chemicals&nbsp;</td><td>#9713.1000&nbsp;</td><td>Usado para fixação celular</td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Fator de Crescimento Reduzido Basement Membrane</td><td>Matrix Gibco</td><td>#A1413202</td><td>Mantenha em 4 &deg; C para evitar a solidificação. Referido como rBM no protocolo.</td></tr><tr><td>Soro FBS Sigma#F9665 inativado por calor</td><td></td><td></td> <td>para meio de crescimento</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Análise de imagem científica</td></tr><tr><td>Medim Uni-safe casette</td><td>Medim Histotechnologie</td><td>10-0114</td><td>Usado para armazenamento de esferoides incorporados</td></tr><tr><td>Mini comprimidos de coquetel inibidores de protease</td><td>Roche Diagnostics GmBH&nbsp;</td><td># 11836153001</td><td>Usado para preparação de tampão de lise</td></tr><tr><td>Microscópio MZ16</td><td>Leica</td><td></td><td>Usado para imagens microscópicas de luz</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 4x Buffer de Amostra&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>#NP0007</td><td>Usado para western blotting</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western blotting substrate</td><td>Thermo scientific</td><td>#32106</td><td>Usado para western blotting</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P7170-1L</td><td>Usado para coloração de banda de proteína</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Gráfico científico e software estatístico</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio (solução de 1mg/ml em água)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P3566</td><td>Sensível à luz&nbsp;</td></tr><tr><td>Reservatórios estéreis, multicanal</td><td>SPL lifesciences</td><td>21002</td><td>Usado para semear células para formação de esferoides</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra-Plus Slide de adesão&nbsp;</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>#J3800AMNZ</td><td>Lâmina de vidro do microscópio usada para encaixar</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T5648</td><td>Usado como tratamento quimioterápico</td></tr><tr><td>Trans-blot Turbo 0,2 e micro; m membranas de nitrocelulose</td><td>Bio-Rad</td><td>#170-4159</td><td>Usado para western blotting</td></tr><tr><td>Tris/Glycine/SDS running buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>#161 0732</td><td>Usado para solução SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>#T4174&nbsp;</td><td>Enzima de dissociação celular</td></tr></tbody></table>

avaliando a viabilidade celular e morte em 3d culturas esferóides de células cancerosas

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Os esferoides tridimensionais de pilhas de cancro são ferramentas importantes para telas da droga do cancro e para ganhar a introspecção mecanicista na biologia da pilha de cancro. O poder desta preparação encontra-se em sua habilidade de imitar muitos aspectos das condições in vivo dos tumores ao ser rápido, barato, e versátil bastante permitir a seleção relativamente high-throughput. As condições da cultura esferóide podem recapitular os gradientes físico-químicos em um tumor, incluindo a crescente acidez extracelular, o aumento do lactato e a diminuição da disponibilidade de glicose e oxigênio, da periferia esferóide ao seu núcleo. Também, as propriedades mecânicas e as interações Cell-Cell de tumores in vivo são em parte imitada por este modelo. As propriedades específicas e, consequentemente, as condições ideais de crescimento, de esferóides 3D, diferem amplamente entre diferentes tipos de células cancerosas. Além disso, a avaliação da viabilidade celular e morte em esferóides 3D requer métodos que diferem em parte daqueles empregados para culturas 2D. Aqui nós descrevemos diversos protocolos para preparar esferoides 3D de pilhas de cancro, e para usar tais culturas para avaliar a viabilidade e a morte da pilha no contexto de avaliar a eficácia de drogas anticâncer.

Os ensaios de crescimento esferóide com base no protocolo de formação esferóide, ilustrados esquematicamente na Figura 1A e na Figura 1B, foram utilizados como ponto de partida para análise dos efeitos de tratamentos medicamentoso anticancerígenos em um tumor 3D imitando o ajuste. A facilidade com que os esferoides são formados é a linha celular específica, e algumas linhas celulares necessitam de suplementação com RBM, a fim de...

Aqui, nós apresentamos diversos métodos simples para avaliar a viabilidade e a morte em spheroids da pilha de cancro 3D, que imitam os gradientes physico-químicos de tumores in vivo muito melhor do que a cultura 2D. O modelo esferóide, portanto, permite a avaliação da eficácia do câncer de drogas com melhor tradução para as condições in vivo.

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Os protocolos aqui apresentados foram otimizados para a cultura 3D e permitem uma investigação eficiente e acessível dos processos associados ao crescimento, proliferação e morte de células cancerígenas em um ambiente 3D. As principais vantagens do uso da cultura 3D é que eles são uma possibilidade única para recapitular aspectos-chave do microambiente tumoral in vitro. O spheroid 3D é uma importante ferramenta para o rastreamento de medicamentos contra o câncer, que está sendo cada vez mais usado para melhorar a tradução entre condições in vitro e in vivo em pesquisas de terapia contra o câncer.Alguns dos protocolos exigem uma certa quantidade de prática e habilidade. Isso é, em particular, verdadeiro para a produção de esferoides pelo método de queda de mão, e para incorporar esferoides para imunohistoquímica. Como elementos-chave desses procedimentos são difíceis de descrever por escrito, como inserir esferoides em uma gota de agarose, a demonstração visual ajudará os pesquisadores a realizar esses procedimentos.Diluir a suspensão celular preparada em um tubo de 15 mililitros para obter a densidade celular ideal. Transfira a suspensão da célula diluída para um reservatório estéril e use uma pipeta multicanal para distribuir 200 microliters na placa previamente preparada. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade.A cada dois ou três dias, adquira imagens microscópicas leves dos esferoides. Após a aquisição das imagens, remova 100 microliters do meio gasto de cada poço, e substitua-o por 100 microliters de meio fresco. Primeiro, descongelar membrana reconstituída no gelo.Mantenha todas as placas e reservatórios embrulhados individualmente no gelo antes de usar. Em seguida, diluir a suspensão celular preparada em um tubo de 15 mililitros para obter a densidade celular ideal. Coloque o tubo contendo a suspensão celular diluída no gelo.Encha os recipientes de plástico com gelo e transfira-os para o capô. Transfira as placas e reservatórios refrigerados para um capô de cultura celular. Coloque as placas e reservatórios de volta no gelo.Resuspenque o rBM suavemente para garantir um gel homogêneo. Adicione a concentração ideal do rBM às suspensões celulares resfriadas. Inverta o tubo para garantir que a suspensão rBM e da célula estejam devidamente misturadas.Em seguida, transfira essa mistura para um reservatório estéril, e use uma pipeta multicanal para distribuir 200 microliters para cada poço de uma placa de 96 poços refrigerado, ultra-baixa. Centrifugar a placa a 750 vezes g por 15 minutos para garantir que as células estejam agrupadas quando o rBM endurecer. Use a centrífuga de descida suave ou função de frenagem mínima.Primeiro, adicione seis mililitros de PBS a um prato de cultura celular. Diluir a suspensão celular preparada para obter uma diluição adequada. Uma diluição prática é de 50.000 células por mililitro.Despeje a suspensão da célula em um reservatório estéril e use uma pipeta multicanal para colocar cuidadosamente até 30 gotas de suspensão na tampa do prato de cultura celular, resultando em uma concentração de 2000 células por gota. Em um movimento rápido, mas controlado, inverta a tampa e coloque-a em cima do prato de cultura celular contendo PBS. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por quatro a seis dias.Se os esferoides forem usados para lises proteicas ou incorporação, puxe-os removendo a tampa, inclinando-a e, em seguida, lavando as gotas com um mililitro de mídia aquecida. Transfira o meio esferoide resultante para um tubo de 1,5 mililitro. Deixe o spheroid se acomodar no fundo do tubo antes de prosseguir com lises proteicas ou incorporação.Corte a ponta de uma pipeta P200 para capturar mais facilmente os esferoides sem perturbar sua estrutura. Para cada condição, puxe um mínimo de 12, mas idealmente entre 18 e 24 esferoides em um tubo de 1,5 mililitro. Coloque os tubos no gelo e deixe os esferoides se instalarem na parte inferior.Em seguida, passe do laboratório de células estéreis para o laboratório regular. Lave os esferoides duas vezes em um mililitro de um X PBS gelado, certificando-se de deixar os spheroids se acomodarem antes de remover o PBS entre cada etapa de lavagem. Em seguida, aspire o máximo de PBS possível sem perturbar ou remover os esferoides.Adicione cinco microliters de tampão de lise aquecida com fosfattase e inibidores de protease por esferoide. Vórtice os esferoides por 30 segundos e, em seguida, realizar uma centrifugação rápida por 10 segundos. Repita esses intervalos de vórtice e centrifugação por cinco a 10 minutos, ou até que os esferoides sejam dissolvidos.Depois de preparar a solução PI, remova 100 microliters de meio de cada poço na placa de 96 poços, certificando-se de não remover os esferoides. Adicione 100 microliters de um X PBS aquecidos a cada poço, seguido pela remoção de 100 microliters de líquido dos poços. Repita esta etapa de lavagem três vezes para lavar qualquer meio restante.Em seguida, adicione 100 microliters da solução PI a cada poço. Cubra a placa em papel alumínio e incubar por 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por 10 a 15 minutos. Depois disso, repita o processo de lavagem com um X PBS aquecido três vezes, como descrito anteriormente, para lavar a solução PI e diminuir o sinal de fundo ao fotografar.Usando um microscópio de epifluorescência, imagem dos esferoides. Dentro do software de imagem, abra o menu multicanal. Defina o tempo de exposição para os canais relevantes e pressione As Configurações de leitura após ajustar cada canal.Abra o menu Z-stack e defina o início e o fim ajustando o foco da imagem. Inicialmente tenha o esferoide fora de foco, em seguida, mova o ponto focal através de todo o esferoide até que a imagem fique embaçada mais uma vez. Em seguida, ajuste o tamanho da etapa para ficar entre 18 a 35 micrômetros e pressione Iniciar.Para começar, fixe os esferoides em um capô de fumaça no primeiro dia, conforme descrito no protocolo de texto. No segundo dia, coloque o gel de agarose em um béquer cheio de água em um forno de micro-ondas para aquecê-lo e manter o gel aquecido em uma placa de aquecimento de bancada definida a 60 graus Celsius, até que seja necessário. Lave os esferoides duas vezes no capô da fumaça usando um mililitro de um X PBS gelado por lavagem.Então, aspirar a maior parte da PBS. Prepare uma ponta de pipeta de 20 microliter cortando-a em uma inclinação para obter uma ponta mais pontiacção com um orifício maior. Depois disso, faça uma queda de gel de agarose em um slide de microscópio.Coloque o slide em um bloco de aquecimento quente para evitar que a agarose se solidifique. Usando a ponta de pipeta modificada, pegue o máximo de esferoides possível em um volume de 15 a 20 microliters. Injete cuidadosamente os esferoides no centro da queda do gel agarose, certificando-se de não tocar no slide do microscópio.Incubar à temperatura ambiente ou a quatro graus por cinco a 10 minutos para deixar o gel agarose endurecer. Quando a gota de gel se solidificar um pouco, mas ainda estiver bastante macia, use um bisturi para empurrá-lo cuidadosamente do deslizamento do microscópio em uma fita de tecido plástico. Transfira o de tecido para um béquer cheio de etanol e armazene em temperatura ambiente.Neste estudo, uma série de métodos são apresentados para a análise de alterações induzidas pelo tratamento anticâncológico na viabilidade e morte de células cancerosas na cultura 3D. A concentração de rBM adicionada pode afetar profundamente a morfologia dos esferoides. A adição de até 2,5% de rBM permite a formação de esferoides em células cancerígenas de mama SKBr-3, sem efeito adicional em concentrações mais elevadas.Em contraste, as células cancerígenas pancreáticas BxPC-3 formam espontaneamente pequenos esferoides compactos. Neste tipo de célula, o aumento do rBM para 1,5% ou mais provoca uma mudança morfológica distinta de esferoide para estruturas mais convolucidas com saliências e invaginações. Um exemplo do uso de culturas esferoides para a triagem da eficácia da quimioterapia é mostrado aqui.Imagens de microscópio leve são adquiridas a cada dois ou três dias durante um experimento de resposta a doses realizado para determinar a dose necessária para 50% de viabilidade reduzida em células cancerígenas de mama MDA-MB-231. O arranjo espacial de células mortas sobre uma concentração crescente de um inibidor pode ser visualizado usando a coloração de PI. Como visto, os spheróides de controle mostram um núcleo apoptótico limitado, tardio, enquanto as células mortas são distribuídas por todo o esferoide à medida que a concentração do inibidor é aumentada.A técnica esferoide mostrada aqui pode ser aplicada a muitos outros ensaios, como invasão 3D, migração ou análise microphoretic. Também é aplicável para co-culturas com fibroblasto, adipócitos ou células imunes, que podem fornecer informações importantes sobre interações celulares no microambiente tumoral. O desenvolvimento dessa técnica tem sido muito importante na elucidação do papel do microambiente tumoral em inúmeros aspectos do desenvolvimento do câncer, incluindo expressão genética, invasão e assistência ao tratamento.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Os esferoides são um tipo de modelo de cultura de células 3D usado para representar com mais precisão o ambiente de uma célula em comparação com os modelos de monocamada de cultura de células 2D. No protocolo de exemplo, veremos os cientistas gerarem esferóides a partir de uma linha de células de câncer colorretal e aplicarem imagens de células vivas para rastrear o crescimento dos esferoides.

Geração de esferóides a partir de linhagens celulares: um método de cultura celular tridimensional (3D)

Este método avalia a invasão de células cancerígenas de esferóides em uma matriz 3D circundante.  Os esferoides são gerados através do método de cultura de gota suspensa e, em seguida, incorporados em uma matriz composta de materiais de membrana basal e colágeno tipo I.  A invasão dos esferóides é posteriormente monitorada.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

Aqui, um método é descrito para a preparação de co-cultura 3-dimensional (3D) esferoide de células de câncer no pâncreas e fibroblastos, seguidos por medição das funções metabólicas, usando um analisador de fluxo extracelular.

Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

Este protocolo destina-se a avaliar a citotoxicidade de células T (células T carro) imunoterapia redirecionada contra células cancerosas estruturadas 3D (esferoides) em tempo real.

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Aqui são apresentados métodos para entender os efeitos anticânculos do supernatante livre de células Lactobacillus (LCFS). As linhas de células cancerígenas colorretais mostram mortes celulares quando tratadas com LCFS em culturas 3D. O processo de geração de esferoides pode ser otimizado dependendo do andaime e os métodos de análise apresentados são úteis para avaliar as vias de sinalização envolvidas.

Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Apresentamos um protocolo para o cultivo de esferoides de alta reprodutibilidade e sua caracterização fenotípica usando captura de imagens e proteômica.

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

Este artigo demonstra um método padronizado para a construção de esferoides tumorais tridimensionais. Uma estratégia para observação esferoide e análise de aprendizagem profunda baseada em imagens usando um sistema de imagem automatizado também é descrita.

Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos

Aprenda a avaliar viabilidade celular e morte em culturas esferoides 3D de células cancerosas. Este método otimizado melhora a avaliação da eficácia de drogas anticâncer e facilita a tradução para condições in vivo.

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