Um suporte de amostra tudo-em-um para a cristalografia macromolecular do raio X com espalhamento mínimo do fundo

Este suporte de amostra pode ser usado para cultivar cristais e coletar dados de difração de raios-X. Este porta-amostras foi feito para o uso em placas de 24 poços que são amplamente utilizadas na comunidade MX. O aspecto muito importante é que não há necessidade de manipulação.

Um porta-amostras com esses aspectos descritos aqui não existia antes. Ver algo é sempre muito melhor do que apenas ler sobre isso. Ao assistir ao vídeo, um potencial usuário pode entender os recursos e complexidades do novo suporte de amostra imediatamente.

Para começar, crie uma superfície limpa e livre de poeira usando um pano úmido e sem fiapos. Pegue um suporte de amostra de sua caixa e coloque-o suavemente, folha amarela voltada para cima, na superfície limpa para evitar danos ou punção indesejada da folha coc traseira. Configure as gotas de cristalização na folha amarela, pois seria feito em lâminas de cobertura comumente usadas.

Coloque as gotas suavemente para evitar qualquer ruptura ou perfuração da folha usando uma pipeta. Nos suportes de amostra tipo 2 e tipo 3, duas gotas são o máximo recomendado. Em um suporte de amostra tipo 1, podem ser colocadas até três gotas.

Vire o suporte de amostra e coloque-o sobre uma cavidade pré-untada de uma placa estilo Linbro de 24 poços. Use os auxílios de posicionamento do suporte de amostra para guiá-lo até a sua posição ideal. Certifique-se da posição correta do suporte da amostra para evitar evaporação indesejada.

Ao colocar a placa de cristalização sob um microscópio de luz de transmissão, sem ou sem polarizadores, monitore o crescimento de cristais sem qualquer perturbação do experimento. Realize crioproteção sob um microscópio de luz de transmissão. Fure suavemente a folha de COC exterior usando uma cânula fina.

Certifique-se de que a folha amarela interna permanece intocada. A punção deve estar bem ao lado da queda que deve ser manipulada. Insira um pavio de papel fino no orifício cutucado.

Empurre cuidadosamente o pavio para a frente até tocar a folha de poliimida amarela. Mantenha o pavio em contato com a folha perfurada. O pavio vai sugar toda a solução em excesso.

O tempo necessário para a remoção completa do líquido depende da viscosidade das soluções e da composição do licor materno. Depois de todo o líquido ser sugado, retire suavemente o pavio de papel. Lembre-se da posição da queda, já que pode não ser visível após a remoção do licor materno.

Pegue uma pipeta padrão para aplicar um pequeno volume de solução crio-protetora, usando uma ponta extrudada através do mesmo orifício. Para ressecar a folha coc auto-curativa, coloque suavemente um dedo protegido no orifício por cerca de um segundo e deslize-o através da punção. A leve pressão em combinação com a temperatura elevada promoverá a ressesão de punções que não são muito grandes.

Dissolva o ligante no licor materno na concentração desejada em um tubo de reação. Gire a solução por 10 minutos a 12.000 vezes g, a fim de remover partículas insolúveis. Use uma centrífuga controlada pela temperatura, se necessário.

Coloque suavemente um máximo de três microliters de solução contendo ligantes na lacuna entre a folha DE COC e o filme de poliimida usando uma ponta de pipeta longa e extrudada;retraia a ponta. Para ressecar a folha coc auto-curativa, coloque suavemente um dedo protegido no orifício por cerca de um segundo e deslize-o através da punção. Incubar o experimento por algum tempo para permitir a difusão através da membrana.

O tempo de imersão depende muito da viscosidade da solução de difusão e seus componentes. Repita as etapas de imersão de ligante várias vezes para posteriormente absorver diferentes ligantes. Para minimizar a dispersão de solventes, remova o excesso de solução antes da coleta de dados.

Certifique-se de um ambiente de linha de feixe estável e controlado pela umidade com condições pré-estabelecidas. Para realizar a coleta de dados de difração in situ à temperatura ambiente, levante suavemente a folha de COC transparente no ponto designado usando fórceps e retire-a. Agora, retire suavemente o suporte da amostra de sua cavidade e insira-o imediatamente em uma base de suporte de amostra magnética pré-preparada.

Nenhuma cola é necessária para esta etapa. Aplique pressão suave para garantir o posicionamento correto do suporte da amostra dentro da base. Para os titulares da amostra com um anel externo removível, aplique pressão suave segurando-o no anel externo e quebre-o nos break points designados.

A amostra está agora pronta para centralizar e difração de coleta de dados. Monte o suporte de amostra em um goniômetro de linha de feixe e certifique-se de um posicionamento correto do suporte. Dependendo da geometria do goniômetro, o suporte da amostra pode ser girado em até 160 graus sem causar qualquer sombra durante o experimento de difração.

Use um pavio de papel e toque suavemente na folha de poliimida amarela da parte de trás para remover o excesso de licor materno. A amostra está agora pronta para centralizar e difração de coleta de dados. Prepare-se para a coleta de dados de difração in situ na temperatura criogênica como feito para a temperatura ambiente, em seguida, mergulhe a amostra em nitrogênio líquido e transfira-a para um frasco compatível com a COLUNA.

A geometria dos tipos 2 e 3 do suporte da amostra permite sua transferência para frascos de amostra de COLUNA padrão, que podem ser usados para montagem de amostras assistidas por robôs. O suporte de amostra tipo 1 e tipo 2 foram projetados para caber em um poço de uma placa estilo Linbro de 24 poços. Cada suporte de amostra individual contém auxiliares de posicionamento em ambos os lados da borda externa, a fim de garantir um posicionamento ideal na borda do poço.

Uma placa estilo Linbro de 24 poços foi usada com o suporte de amostra tipo 1 para equilibrar uma queda em 293 Kelvin contra 500 microliters de licor materno. Cristais de 40 a 50 mícrons foram observados após cinco horas usando um microscópio de luz de transmissão com ou sem um polarizador. Um suporte de amostra com cristais de lisezinha branca de galinha foi colocado em uma corrente de ar controlada pela umidade na linha de feixe HZB-MX 14.3.

Uma imagem típica de difração é mostrada aqui. Não é possível detectar dispersão de fundo elevada na imagem de difração. É fundamental que as contaminações da folha de poliicida sejam evitadas.

Além disso, é importante que o titular da amostra esteja posicionado com precisão e a manipulação de cristal seja realizada cuidadosamente. O porta-amostras permite o manuseio de cristais muito delicados, um dos passos mais importantes na cristalografia micromolecular. Seu uso diminui consideravelmente a chance de destruir a amostra.