Análise de interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas de fermentação de banho in vitro

Nosso protocolo pode ser amplamente utilizado para alta produtividade e triagem rápida das interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana. Baixo custo e evitar efeitos de interferência do metabolismo do hospedeiro. Esse procedimento tem potencial para ser utilizado no diagnóstico.

Primeiro, dissolver o EPS e o amido individualmente em água quente em um agitador magnético para fazer tanto a concentração de oito gramas por litro. No meio de cultura básica preparada, VI, adicione 100 mililitros da solução BIF EPS para fazer a cultura VI SOLUÇÃO BIF. Adicione 100 mililitros da solução de amido para tornar a cultura VI solução de amido.

Autoclave as duas mídias com fonte de carbono, e o meio sem fonte de carbono como controle, a 121 graus Celsius por 15 minutos. Deixe esfriar até a temperatura ambiente e adicione feno e cisteína. Transfira uma sub-amostra de cinco mililitros de cada tubo médio para cultura.

E guarde em uma incubadora anaeróbica. Armazene a mídia restante a 4 graus Celsius. Para preparar a amostra fecal humana, transfira um grama de amostra fecal fresca em 10 mililitros de PBS anaeróbicos molares de 0,1 molar em pH sete em um copo de vidro.

Em seguida, use uma haste de vidro para mexê-la para conseguir um chorume. Em uma câmara anaeróbica, adicione 500 microliters do chorume fecal filtrado nos três meios de fermentação preparados, individualmente. Em seguida, incubar a 37 graus Celsius.

Após 24 horas e 48 horas, colete dois mililitros de amostras fermentadas na câmara anaeróbica. E então centrífuga fora da câmara a 6000 vezes G, por três minutos. Transfira cuidadosamente os supernacantes para novos tubos de centrífugas que serão usados para análise de degradação de polissacarídeos e medidas de ácidos graxos de cadeia curta.

Armazene as pelotas de centrifugação a 80 graus Celsius. Carregue 0,2 microliters dos supernantes fermentados em cada gel de sílica pré-revestido 60 TLC e redemoinho para espalhar. Em seguida, use um secador de cabelo com ar quente para secar.

Mergulhe uma extremidade das placas amostradas em 20 mililitros de solução de ácido fórmico:n-butanol:água por vários minutos, até que a eletroforese se estenda quase até a outra extremidade. Em seguida, tire as placas com fórceps, e seque com um secador de cabelo. Em seguida, mergulhe as placas no reagente orcinol por dois minutos para tingir.

E seque de novo. Transfira as placas para um forno a 120 graus Celsius para aquecer por três minutos. Em seguida, tire fotos da placa para avaliar a degradação do EPS medindo bandas TLC.

Para estudar os efeitos do EPS na produção de SCFA, adicione um mililitro dos supernantes fermentados a tubos de centrífuga de dois mililitros e adicione 0,2 mililitros de 25 por cento de peso/volume de ácido metafosfórico a cada amostra. Vórtice para misturar completamente as soluções. Centrifugar as misturas a 13.000 vezes G durante 20 minutos.

Enquanto isso, prepare soluções de 120 ácidos acesso, propírico, butírico, isobutírico, valerico e isovalerico em tubos. Em seguida, adicione um mililitro de cada ácido preparado a um tubo contendo 1,2 mililitros de 25 peso/volume por cento de ácido metafosfórico. E carregá-los na garrafa de amostra do instrumento de cromatografia gasosa como os coquetéis padrão.

Tire os tubos da centrífuga e transfira os supernantes para tubos frescos. Use uma seringa equipada com filtro de 0,22 mícrons para filtrar os supernantes em novos tubos para análise de cromatografia a gás. Neste estudo, a produção de EPS mucoide foi observada em culturas de bifidobacterium longum em placas de PYG, após incubação anaeróbica por 72 horas.

A centrifugação de restos culturais, seguida pela precipitação e secagem do etanol, resultou na coleta de EPS semelhante à celulose. A análise da TLC revelou que a taxa de degradação do amido pela microbiota fecal humana foi mais rápida que a do EPS BIF. A Análise principal de coordenadas mostra a cultura VI BIF, e os grupos de amido da cultura VI, agrupados separadamente um do outro, indicando que a disponibilidade de EPS e amido formam diferencialmente as comunidades bacterianas fecais humanas.

Análises discriminantes lineares sobre o tamanho do efeito mostram que os gêneros collinsella, coprococcus, parabacteroides e rhodopseudomonas foram significativamente mais abundantes na cultura vi amostras de BIF do que na cultura VI amostras de amido. Além disso, as medições de GC mostram SCFAs que foram medidos a partir de culturas de fermentação incluíram ácidos acéticos, propônicos, isobutíricos, butíricos, isovalericos e valericos. Após a fermentação durante 24 horas e 48 horas, cinco das seis concentrações do SCFA foram semelhantes e não estatisticamente diferentes entre os grupos cultura VI BIF, amido cultura VI e cultura VI.

No entanto, as concentrações de ácido propriônico foram significativamente maiores na cultura vi grupo BIF do que no grupo de amido cultura VI, após 48 horas de fermentação. Faça este experimento em condições anaeróbicas e, em seguida, transfira as amostras fixas para uma incubadora anaeróbica o mais rápido possível. Alguns dos reagentes TLC são perigosos.

Você deve ter cuidado para usá-los.