Name: Análise experimental do engulfment do Thymocyte de apoptotic por macrófagos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprenda a preparar timócitos apoptóticos e macrófagos peritoneais para estudar a eficiência da eferocitose em imunologia. Este método permite analisar o englobamento celular e avaliar o impacto de inibidores específicos.

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A pesquisa no laboratório de Shao é apoiada pela concessão inovativa da pesquisa da faculdade da medicina e da faculdade Júnior concessão do piloto do departamento da medicina interna, Universidade de Cincinnati e concessão DK K01_095067 de NIDDK/NIH.

Camundongos experimentais foram criados e mantidos em nossa colônia de camundongos. Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com as diretrizes do Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de Cincinnati.
1. preparação de CFSE rotulados timócitos apoptóticos
<ol><li>Eutanizar dois ratos C57/B6 ingênuos por inalação de CO2 por 10 min e dissecar para abrir a cavidade torácica, remover (puxar) o Timo com fórceps curvo de ponta fina no prato de Petri de cultura de tecido contendo 10 ml de meio RPMI1640.</li>
	<li>Obtenha a única suspensão da pilha moendo o Timo inteiro de encontro a duas extremidades geadas das corrediças do microscópio e filtre então a suspensão com o filtro da pilha de 100 μm.</li>
	<li>Colete a suspensão de 10 ml de timo em um tubo de 50 ml e centrifugue em 300 x g por 5 minutos.</li>
	<li>Retire o sobrenadante, ressuscitem em 40 mL de 1X PBS, e contagem de números de células com um Hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugue a 300 x g durante 5 min e retire o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender em 20 mL de 1X PBS em um tubo de 50 mL como uma única suspensão da pilha com até 2 x 108 pilhas (se mais de 2 x 108 pilhas, Ressuspender o descanso das pilhas em uns outros 20 ml de 1 x PBS em um tubo diferente de 50 ml).</li>
	<li>Faça 5 μM de CFSE em igual volume (20 mL) de 1X PBS em um tubo separado de 50 mL introduzindo 40 μL de solução de estoque CFSE (2,5 mM) em 20 mL de 1X PBS e misture bem invertendo o tubo 2-3 vezes.</li>
	<li>Adicione os 20 mL de CFSE da etapa 1,7 no 20 mL da suspensão da pilha da etapa 1,6 (a concentração final de CFSE é agora 2,5 μM). Nota: para cada suspensão de célula de 20 mL, é necessário um tubo de 20 mL de CFSE.</li>
	<li>Inverta o tubo da mistura da pilha e do CFSE 2-3 vezes e incubar a mistura no escuro na temperatura ambiente por um máximo de 2 minutos, a seguir pare a reação adicionando 10 mL do soro Calor-Inactivated do cavalo.</li>
	<li>Centrifugue a mistura do tubo de 50 mL em 300 x g por 5 minutos na temperatura ambiente. Nota: se a rotulagem CFSE for bem-sucedida, o pellet de células se tornará amarelo claro na cor.</li>
	<li>Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet celular em 40 mL de 1X PBS e contagem de números de células com um Hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugue a suspensão celular a 300 x g durante 5 min e descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Lave novamente a pastilha celular com 40 mL de meio RPMI1640.</li>
	<li>Remova as células sobrenadantes e ressuscitem com meio de cultura de tecido RPMI1640 (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (calor inativado), 20 mM de glutamina e 1x Pen/Strep) em uma concentração de 7 x 106 células/ml em um prato de cultura de tecido de 100 mm. Nota: se forem obtidas mais células, será necessário um prato de cultura de tecido de 100 mm separado.</li>
	<li>Adicionar estaurosporina na cultura da suspensão da pilha em uma concentração final de 1 μm e cultura para 4 h em 37 ° c em uma incubadora da cultura do tecido fornecida com o co2de 5%.</li>
</ol>2. preparação de macrófagos peritoneais
<ol><li>Injete dois camundongos C57B6 (ou qualquer rato manipulado por genes no laboratório) intraperitonealmente com 1 mL de tioglicato de 3% envelhecido no dia 0.</li>
	<li>Eutanizar os camundongos no dia 5 como na etapa 1,1, cortar e descascar abrir a pele abdominal, mas deixar o peritônio intacto. Lave a cavidade peritoneal empurrando rapidamente 10 mL de tampão de lavagem (RPMI1640, 2% FBS, 0, 4% EDTA) na cavidade peritoneal usando uma seringa de 10 mL unida com uma agulha de 18 G.</li>
	<li>Recupere o tampão de lavagem lentamente com a mesma agulha/seringa e colete o tampão de lavagem em um tubo de 50 mL (detalhes referem-se ao artigo15do laboratório da Janssen).</li>
	<li>Lave o gavagem peritoneal duas vezes com 1X PBS, Ressuspender os macrófagos peritoneais no meio de cultura do tecido RPMI1640 em uma densidade de 2 x 106 Cells/ml e alíquota 500 μl em cada poço da placa 24-well. Deixe a placa em uma incubadora da cultura do tecido para 2 h.</li>
	<li>Remova as células flutuantes aspirando e substituindo com 500 μL de meio de cultura fresca, duas vezes.</li>
	<li>Opcionalmente, adicione o inibidor de tirosina do receptor TAM, RXDX-106, em concentrações indicadas nas legendas de figura em cada poço da cultura de macrófago e incubar por mais 2 h.</li>
</ol>3. co-cultura de macrófagos peritoneais com timócitos apoptóticos
<ol><li>Colete timócitos apoptóticos do passo 1 e lave três vezes com meio RPMI1640. A eficiência da indução apoptótica pode ser medida nesta fase com o kit Anexin V/7-AAD.</li>
	<li>Distribuir 0-12 x 106 células (em meio 500 μL) em cada poço das culturas de macrófago do protocolo #2, de acordo com o arranjo experimental (por exemplo, veja a Figura 1). Isso faz com que todo o volume de cultura de 1 mL em cada poço da placa de 24 poços. Adicione o anticorpo de obstrução na cultura imediatamente antes da adição de thymocytes apoptóticas.</li>
	<li>Cultura a mistura da pilha em 37 ° c por 4 h em uma incubadora da cultura do tecido fornecida com o CO2de 5%.</li>
	<li>Lave cada poço da cultura com 1X PBS (contendo 500 μM de EDTA) duas vezes para remover as células apoptóticas de flutuação livre.</li>
	<li>Manchar os macrófagos ligados à placa com CD11b-PE nesta fase.<ol>
<li>Lave os macrófagos ligados à placa com tampão de coloração (1X PBS, 1% BSA) uma vez.</li>
		<li>Adicionar 200 μL de tampão de coloração contendo 2 μL de CD11b-PE em cada poço.</li>
		<li>Incubar a placa a 4 ° c durante 20 min.</li>
		<li>Lave cada poço da placa três vezes com o amortecedor de coloração.</li>
		<li>Adicionar 200 μL de tampão de coloração e proceder a placa para análise de imagem o microscópio fluorescente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativamente, separe os macrófagos ligados à placa adicionando 1 mL de lidocaína a 1% em PBS e incubando por 10 min a 37 ° c.</li>
	<li>Separe os macrófagos ligados à placa com pipetagem repetida.</li>
	<li>Transfira a suspensão de macrófago para um tubo FACS de 5 mL de fundo redondo de cada poço da placa de 24 poços.</li>
	<li>Centrifugador a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire o sobrenadante e adicione 200 μL de tampão de coloração contendo 2 μL de CD11b-PE (1:200 diluição no tampão de coloração).</li>
	<li>Incubar a suspensão da célula no tampão de coloração a 4 ° c durante 20 min.</li>
	<li>Lave a suspensão da célula duas vezes com o tampão de coloração.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de tampão de coloração e proceder para a análise de FACS com um citômetro do fluxo e para analisar para a porcentagem de macrófagos do positividade de CFSE.</li>
</ol>

<ol><li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).</li>
<li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+death+and+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li>
<li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+cancer%3A+from+pathogenesis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).</li>
<li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research%3A+Where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li>
<li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li>
<li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li>
<li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+TAM+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076(2013).</li>
<li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative%2C+Gas6%2C+are+ligands+for+the+Tyro+3%2FAxl+family+of+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li>
<li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptor+tyrosine+kinases%3A+biologic+functions%2C+signaling%2C+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li>
<li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors%2C+Gas6%2C+and+protein+S%3A+roles+in+inflammation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li>
<li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li>
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<li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li>
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<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance%3A+progress+and+conundrums%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+in+Pathology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561(2015).</li>
<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+the+dead%3A+apoptotic+cell+sensing%2C+recognition%2C+engulfment%2C+and+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li>
<li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li>
<li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagocytes%3A+neutrophils+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A apoptose é um processo de morte celular altamente conservado que envolve muitas cascatas de sinal e induz expressão protéica, secreção e transporte. A apoptose é frequentemente associada a alterações morfológicas celulares17. Células apoptóticas liberam ativamente citocinas e quimiocinas que atraem fagócitos para migrar para o local e iniciar o processo de engulfment, uma via extremamente complexa controle apertado18. Por outro lado, a morte celular necrótica libera sinai...

Nosso corpo gera 1-10 bilhões de células apoptóticas em uma base diária. Um número tão grande de pilhas apoptóticas deve ser cancelado de uma maneira que as respostas imunes permaneçam quiescentes. Para garantir o despejo de células apoptóticas em tempo hábil, inúmeros tipos de células residentes no tecido e células circulantes desenvolvem mecanismos para engolfo células apoptóticas1. A regulação disfuncional da apoptose tem sido implicada no início e progressão de várias doenças inflamatórias e autoimunidade2. A apoptose também desempenha um papel crítico na patogênese do desenvolvimento do câncer e sua subsequente resistência aos tratamentos convencionais3,4. A remoção de células apoptóticas geralmente promove uma resposta anti-inflamatória, que pode estar ligada à tolerância imunológica5. A violação do afastamento de pilha apoptóticas conduz o Self-imunização e contribui ao desenvolvimento de doenças auto-imunes sistemáticas em seres humanos e em ratos6.
Quando as células passam por apoptose, elas expõem a fosfatidilserina (PtdSer) do folheto interno ao folheto externo da membrana. O PtdSer será então reconhecido pelos fagócitos através de receptores de superfície. Mais de uma dúzia de receptores foram identificados para reconhecer e/ou facilitar o engulfment de células apoptóticas. Em geral, há pelo menos três tipos de receptores de superfície envolvidos na depuração celular apoptótica: receptores tethering, reconhecem células apoptóticas; fazer cócegas nos receptores, iniciar o engulfment; os receptores de chaperoning, facilitam o processo inteiro7. As tirosina cinases do receptor TAM (TAM RTKs) consistem em Tyro-3, AXL e Mer e são expressas principalmente por células mielóides do sistema imunológico8. A função primária de TAM RTKs é servir como receptores tethering, facilitando a remoção fagocítica de células apoptóticas e detritos. Nosso grupo tem estudado o afastamento de pilha apoptóticas negociado Tam no ajuste da autoimunidade por muitos anos. A proteína de crescimento protéico dependente de vitamina K 6 (Gas6) e proteína S (prós) vincula e ativa os receptores de Tam9,10. Gas6 é produzido no coração, rins e pulmões. ProS é produzido principalmente no fígado11. TAM reconhece de células apoptóticas de tal forma que o N-terminal de Gas6/ProS se liga ao PtdSer em uma célula apoptótica e o C-terminal de Gas6/ProS se liga aos receptores TAM que ancorados na superfície dos fagócitos. Juntamente com os outros receptores, a engulfment de células apoptóticas ocorre12. Embora o Mer possa se vincular tanto aos ligantes ProS e Gas6, descobrimos que Gas6 parece ser o único ligador para a fagocitose de macrófagos mediada por Mer de células apoptóticas, que podem ser bloqueadas pelo anticorpo anti-Mer13. Os macrófagos são fagócitos profissionais. O afastamento rápido de pilhas apoptóticas por macrófagos é importante para a inibição da inflamação e de respostas auto-imunes de encontro aos antígenos intracelular. A tirosina quinase do receptor de Mer é crítica para o engulfment do macrófago e o afastamento eficiente de pilhas apoptóticas14. No baço do camundongo, Mer expressa principalmente sobre a zona marginal e os macrófagos corpóreos13.
O protocolo aqui apresentado descreve um método básico para induzir a apoptose celular e demonstrar formas de mensurar o processo e a eficiência da eferocitose. Estes protocolos podem prontamente ser adaptados para estudar o macrófagos por outros tipos da pilha no engulfment de pilhas apoptóticas de origens diferentes.

<table><tbody><tr><td>Tampão de lise de reconhecimento</td><td>GIBCO</td><td>A10492</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V / 7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Mer</td><td>R & D Systems</td><td>BAF591</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PE (clone M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553311</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 mM)</td><td>GIBCO</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352017</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas foscas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-343</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo (inativado pelo calor)</td> <td>Invitrogen</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5647</td><td>Prepare 1% de tampão em 1x PBS</td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>RXDX-106</td><td>Selleck Chemicals</td><td>CEP-40783</td><td></td></tr><tr><td>Staurosprine (100mg)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2541-100</td><td>Adicione 214,3 ml de DMSO em 100mg para fazer uma solução de meia de 1mM</td></tr><tr><td>Meio de Tioglicolato Modificado por Brewer</td><td>BD Biosciences</td><td>243010</td><td>Prepare o tampão de tioglicolato a 3% em 1&agudo; PBS, autoclavado e armazenado no escuro por 3 meses.</td></tr></tbody></table>

análise experimental do engulfment do thymocyte de apoptotic por macrófagos

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

A apoptose celular é um processo natural e desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário, na regulação homeostática, na indução da tolerância imune e na resolução da inflamação. O acúmulo de detritos apoptóticos no corpo pode desencadear respostas inflamatórias crônicas que levam a doenças auto-imunes sistêmicas ao longo do tempo. O afastamento de pilha apoptóticas danificado foi implicado em uma variedade de doenças auto-imunes. A depuração apoptótica é um processo complexo raramente detectado em condições fisiológicas. Envolve receptores de superfície abundantes e moléculas de sinalização. Estudar o processo de liberação de células apoptóticas fornece mecanismos moleculares perspicazes e respostas biológicas subsequentes, o que pode levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas. Aqui, nós descrevemos protocolos para a indução de thymocytes apoptóticas, a preparação de macrófagos peritoneais, e a análise do afastamento de pilha apoptóticas pelo fluxo citometria e pela microscopia. Todas as células serão submetidas a apoptose em um determinado estágio, e muitas células residenciais e circulantes podem captação de detritos apoptóticos. Portanto, o protocolo descrito aqui pode ser usado em muitas aplicações para caracterizar a ligação e a ingestão de células apoptóticas por muitos outros tipos de células.

Análise do engulfment macrófago-negociado peritoneal de thymocytes apoptóticas. Macrófagos peritoneais e células apoptóticas foram preparadas e cocultivadas conforme descrito no protocolo. Os macrófagos foram destacados e corados com anticorpo CD11b conjugado PE por 20 min no gelo. Os macrófagos foram então lavados e processados em um citometro de fluxo. Como visto, não há nenhum macrófago positivo de CFSE no quadrante inferior direito quando nenhuma célula apoptótica foi adicionada na cultura (<strong c...

Aqui, nós apresentamos um protocolo para preparar timócitos apoptóticos e macrófagos peritoneais e para analisar a eficiência do macrófagos e do bloqueio inibidor-negociado específico do engulfment apoptóticas dos timócitos. Este protocolo tem uma aplicação larga no afastamento Cell-negociado de outras partículas que incluem grânulos e bactérias artificiais.

Análise experimental do engulfment do Thymocyte de apoptotic por macrófagos

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Nosso corpo gera de 1 a 10 bilhões de células apoptóticas todos os dias. O desembaraço eficiente dessas células ajuda na remoção de detritos celulares e na manutenção dos estoques. Este método pode ser usado em muitas aplicações para caracterizar a ligação celular apoptótica e a ingestão por muitos outros tipos de células fagocíticas.Demonstrando este procedimento será Yuxuan Zhen, um técnico sênior do meu laboratório. Para colher timócitos, depois de abrir a cavidade torácica de um rato preto C57 6 ingênuo, use fórceps finos curvos para puxar o timo. Coloque o órgão em um prato de cultura tecidual contendo 10 mililitros de RPMI 1640 Medium.Triture todo o timo contra as extremidades foscos de dois slides de microscópio e filtre a suspensão do tecido resultante através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo de 50 milímetros. Colete os timócitos por centrífugação e resuspense a pelota em 40 mililitros. Após a contagem, centrifugar as células novamente e resuspendar até duas vezes 10 para as oito células em 20 mililitros de PBS fresco por tubo de 50 mililitros.Rotule as células com cinco CFSE micromolar em 20 mililitros de PBS por tubo. Inverta os tubos duas a três vezes para misturar antes de incubar os timócitos por não mais do que dois minutos à temperatura ambiente protegidos da luz. No final da incubação, pare a reação com 10 mililitros de soro de cavalo inativado pelo calor e colete as células por centrifugação.Resuspend as células rotuladas em 40 mililitros de PBS fresco para contagem e centrifugação seguido por uma lavagem adicional com 40 mililitros de médio. Após a lavagem média, resuspenja os timócitos em sete vezes 10 para as seis células por mililitro de cultura tecidual de concentração média de cultura tecidual e semear as células em um prato de cultura tecidual de 100 milímetros. Em seguida, adicione a staurosporina à cultura celular em uma concentração final de um micromolar e coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecido por quatro horas.Para o isolamento do macrófago peritoneal, injete dois camundongos C57 pretos 6 camundongos intraperitonel com um mililitro de 3% de thioglycolato no dia zero antes de abrir a pele abdominal sem perturbar o peritônio no quinto dia. Para lavar a cavidade peritoneal, use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 18 para empurrar rapidamente 10 mililitros de tampão de lavagem para dentro da cavidade antes de aspirar lentamente o tampão de lavagem para coleta em um tubo de 50 mililitros. Lave o lavado peritoneal duas vezes com PBS.Resuspend os macrófagos peritoneais em duas vezes 10 para as seis células por mililitro de cultura tecidual concentração média. Em seguida, 500 microliters de macrófagos em cada poço de uma placa de 24 poços e coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecido por duas horas. No final da incubação, aspire o supernascer para remover as células flutuantes e adicionar 500 microliters de meio de cultura tecidual a cada poço.Adicione imediatamente zero a 12 vezes 10 aos seis timócitos em 500 microliters de médio a cada poço da cultura e coloque a placa na incubadora de cultura tecidual por quatro horas. No final da incubação, lave cada poço duas vezes com PBS fresco para remover quaisquer células apoptóticas flutuantes livres seguidas de uma única lavagem com tampão de coloração. Em seguida, rotule os macrófagos ligados à placa com 200 microliters de tampão de coloração complementados com um anticorpo anti-CD11b apropriado por poço e coloque a placa em quatro graus Celsius por 20 minutos.Neste experimento representativo, até 30% dos macrófagos peritoneais estimulados por tiaglito demonstraram um sinal positivo no canal CFSE indicando que esses fagocitos haviam ingerido células apoptóticas rotuladas por CFSE. A observação microscópica do engolfamento do macrófago das células apoptóticas é essencial para investigar a capacidade dos macrófagos de ingerir células apoptóticas à medida que macrófagos positivos CFSE se espalham no quadrante inferior direito devido a diferentes intensidades indicando que o número de células apoptóticas dentro de macrófagos individuais é diferente. Uma maior proporção de células apoptóticas para macrófagos não só aumenta o número de macrófagos ingerindo células apoptóticas, mas também aumenta a capacidade dos macrófagos de ingerir células mais apoptóticas.Em outro conjunto de experimentos, cerca de 15% dos macrófagos tornaram-se CFSE positivos quando os tímtos apoptóticos foram adicionados à cultura macrófago por quatro horas indicando que esses macrófagos eram os macrófagos fagocíticos. Os anticorpos Mer bloqueiam a eferócitose macrófago de forma dependente de dose e o bloqueio geral pode representar cerca de 30% da eficiência da equiocistose no ambiente atual. Além disso, um recém-aprovado inibidor do receptor TAM atenua a eferocisia macrófago de forma dependente de dose até cerca de 100 concentrações de nanomolar.Lembre-se sempre de verificar a porcentagem de células apoptóticas, pois esse número afeta diretamente a eficiência da eferocitose. Os macrófagos fagocíticos podem ser ainda mais analisados pela mancha ocidental para investigar as moléculas de sinalização reguladas pelo processo de engolfação e pela microscopia para estudar a dinâmica do engolamento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de eferocitose para estudar a depuração de células apoptóticas usando microscopia confocal. A eferocitose é um processo de várias etapas em que as células apoptóticas são engolidas por fagócitos e degradadas dentro de vesículas chamadas eferrossomos. Este protocolo fornece um método para visualizar porções internalizadas e não internalizadas de células apoptóticas individuais e quantificar a eferocitose.

Ensaio de Eferocitose de Células Fixas: Um Método para Estudar a Captação Eferocítica de Células Apoptóticas por Macrófagos Usando Microscopia de Fluorescência

Este vídeo demonstra um procedimento para analisar a eferocitose mediada por macrófagos peritoneais de timócitos apoptóticos de camundongos por microscopia de fluorescência.

Análise da Eferocitose de Timócitos Apoptóticos por Macrófagos Peritoneais

Este vídeo mostra um ensaio de apoptose em células cancerígenas induzidas por células T efetoras pré-ativadas. Ao co-cultivar essas células com células cancerígenas marcadas com núcleos fluorescentes, um substrato fluorogênico clivável por caspase é adicionado. As células cancerígenas apoptóticas exibirão uma cor diferente em seus núcleos, levando à fluorescência dupla. Essa fluorescência dupla é indicativa de células cancerígenas sofrendo apoptose.

Um ensaio in vitro para estudar a citotoxicidade de células T CD8+ pré-ativadas contra células cancerígenas

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação de eventos de sinalização intracelular induzidos em células viáveis por interação física com células mortas ou moribundas adjacentes. O protocolo se concentra em eventos de sinalização induzidos pelo reconhecimento mediado por receptor das células mortas, em oposição à sua captação fagocítica ou liberação de mediadores solúveis.

Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas.

Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões

Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Descrevemos aqui um protocolo para investigar a citotoxidade de CD8 pré-activated+ T células contra as células cancerosas através da detecção de apoptotic câncer células através do tempo real microscopia. Este protocolo pode investigar os mecanismos subjacentes mieloide induzida por células T cell supressão e avaliar compostos vistos reabastecer T células através do bloqueio de células mieloides supressivas do sistema imunológico.

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Doenças neurodegenerativas estão associadas a funções de microglia disreguladas. Este artigo descreve um ensaio in vitro de fagocitose de células neuroblastoma por macrófagos iPSC. As leituras quantitativas de microscopia são descritas tanto para imagens de lapso de tempo de células vivas quanto para imagens de alto conteúdo de células fixas.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

Este protocolo é baseado na morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-AAD para detectar morte celular, usando a célula inteira e empregando microscopia eletrônica de varredura para observar a morfologia da membrana celular.

Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação

Aprenda a preparar timócitos apoptóticos e macrófagos peritoneais para estudar a eficiência da eferocitose em imunologia. Este método permite analisar o englobamento celular e avaliar o impacto de inibidores específicos.

Análise experimental do engulfment do Thymocyte de apoptotic por macrófagos

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