Name: Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprenda a técnica de digestão em membrana para análise de interações proteína-proteína por espectrometria de massa. Este método elimina a eletroforese em gel de poliacrilamida, aumentando a produtividade em proteômica.

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Este estudo foi apoiado em parte pela sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI conceder número 17K09869 (para AM), a sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI Grant Number 15K09418 (para TM), uma bolsa de pesquisa da Kanehara Ichiro Medical Science Foundation e uma bolsa de pesquisa da Suzuken Memorial Foundation (tudo para TM).

1. imunoprecipitação
Nota: utilizou-se tampão de lise de sulfato de dodecilo (SDS) não-sódico e eluição de citrato, conforme descrito nas seções a seguir. No entanto, o uso de uma técnica de imunoprecipitação em casa alternativa pode ser também aplicável para a preparação de amostras de LC-MS/MS.
<ol><li>Transfect cultivou pilhas com os vetores que codificam um Tag do epítopo sozinho ou uma proteína da fusão. Para a aquisição de dados representativos, transferir J774 células (1 x 106) com vetores de codificação de proteína verde fluorescente (GFP) sozinho ou GFP-fundido Capn6 (calpain-6 gene) usando lipossomas catiônicos.</li>
	<li>Conjugar o anticorpo aos grânulos magnéticos.<ol>
<li>Para este efeito, misture o anticorpo anti-GFP (2 μL/reacção) com grânulos magnéticos (25 μL/reacção) em 500 μL de tampão de fosfato de citrato (24,5 mM de ácido cítrico, 51,7 mM de fosfato de sódio dibásico; pH 5,0) num tubo de ensaio de 1,5 mL.</li>
		<li>Gire a mistura a 50 rpm por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, lave as esferas conjugadas com IgG três vezes com tampão de fosfato de citrato contendo 0,1% de polioxietileno (20) de monolaurato de sorbitano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyse as células transfected usando um tampão de Lise apropriado. Para a aquisição de dados representativos, lyse as células transfected por 30 min no gelo em 400 μL de tampão de lise (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% poli (oxyethelene) octilfenilo éter) contendo 40 μmol/L de fenilmetilsulfonila fluoreto, 50 μg/mL leupeptina mL aprotinina, 200 μmol/L de sódio orthovanadate, e 1 mM etileno glicol tetraacético ácido (EGTA) em 1,5 mL tubos de ensaio 24 h após a transfecção.</li>
	<li>Limpar o lisado por centrifugação em 15.000 x g por 5 min e recolher o sobrenadante.</li>
	<li>Preclear o lisado. Adicionar contas magnéticas sem rótulo (25 μL/reacção) num tubo de ensaio de 1,5 mL. Lave as contas três vezes com 500 μL de tampão de fosfato de citrato. Após a remoção do tampão do fosfato do citrato na lavagem final, adicione o lisado da pilha sobre os grânulos magnéticos. Gire a mistura usando rotador a 50 rpm por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloc o tubo de teste em um suporte magnético por 5 minutos para a separação magnética, e colete o lysate da pilha. Recomenda-se a utilização do suporte magnético designado pelo fabricante.</li>
	<li>Vincular as proteínas alvo para os grânulos conjugados. Coloc os grânulos G-conjugados da imunoglobulina (IG) em um suporte magnético por 5 minutos para a separação magnética, rejeite o tampão do citrato, e adicione então o lisado da pilha aos grânulos separados.</li>
	<li>Gire a mistura a 50 rpm por 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Separe as proteínas alvo de proteínas não-alvo livres. Lave as contas três vezes usando 500 μL de tampão de fosfato de citrato contendo 0,1% de polioxietileno (20) de monolaurato de sorbitano. Após a lavagem final, adicionar 30 μL de tampão citrato (pH 2 – 3), e incubar por 5 min à temperatura ambiente para eluir as proteínas-alvo. Nota: se a recuperação da imunoprecipitação for insuficiente, o uso de Tags de epítopo alternativos, como FLAG ou HIS, pode melhorar a eficiência. Se a eficiência da eluição for insuficiente, o uso de outros eluantes, como uma solução baseada em SDS, pode melhorar a eficiência.</li>
</ol>2. digestão da em-membrana das proteínas
Nota: o uso de materiais e equipamentos sem proteínas é necessário para evitar a contaminação com proteínas exógenas. Além disso, recomenda-se que o operador Use uma máscara cirúrgica e luvas para evitar a contaminação por proteínas humanas.
<ol><li>Corte as membranas de PVDF em peças de 3 mm x 3 mm usando tesouras cirúrgicas que foram limpas com metanol e secas imediatamente antes do uso.</li>
	<li>Adicionar 2 – 5 μL de etanol nas peças de membrana de PVDF em folha de alumínio limpa.</li>
	<li>Antes de secar completamente, adicione o eluante (2 – 5 μL cada, 4 – 6 peças por amostra) nas membranas hidrofílicas de PVDF e, em seguida, seque as membranas até que a superfície da membrana se torne fosca. As membranas secas podem ser armazenadas a 4 ° c.</li>
	<li>Transfira todas as membranas para 1,5 mL de tubos plásticos, acrescente 20 – 30 μL de etanol para fazer as membranas hidrófilas, e depois retire o etanol usando uma pipeta.</li>
	<li>Antes que a membrana seque completamente, adicione 200 μL de solução de reação baseada em ditiotreitol (DTT) (80 mm NH4HCO3, 10 mm DTT e 20% acetonitrila) e incubar-lo a 56 ° c por 1 h.</li>
	<li>Substitua a solução de reacção por 300 μL de solução de iodoacetamida (80 mM NH4HCO3, 55 mm iodoacetamida e 20% acetonitrila), e incubar para 45 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Lave as membranas duas vezes com 1 mL de água destilada e uma vez com 1 mL de acetonitrila a 2% por mistura Vortex por > 10 s.</li>
	<li>Dissolva a tripsina liofilizada MS-grade (tabela de materiais) diretamente na solução de reação (30 mm NH4hco3 contendo 70% acetonitrila). Adicionar 100 μL da solução de reacção contendo 1 μg de tripsina (tabela de materiais) (30 mm NH4hco3 contendo 70% de acetonitrila) e incubar a 37 ° c durante a noite.</li>
	<li>Transfira a solução de reacção que contém as escavações trióticas para um tubo de ensaio limpo de 1,5 mL utilizando uma pipeta.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de solução de lavagem (70% de acetonitrila/1% de ácido trifluoroacético) à membrana e incubar a 60 ° c durante 2 h. recolher a solução de lavagem e misturá-la com a solução de reacção. Adicione outro 100 μl de solução de lavagem à membrana e a proceda durante 10 min. Em seguida, colete a solução de lavagem e misture com a solução de reação.</li>
	<li>Cubra o tubo de ensaio com um pedaço de filme de laboratório e fazer um par de pequenos buracos com uma agulha. Seque a solução usando um concentrador de vácuo.</li>
	<li>Dissolver o resíduo em 10 μL de 0,2% de ácido fórmico. Após a centrifugação (12.000 × g, 3 min à temperatura ambiente), transfira o sobrenadante para um tubo de amostra. Nota: as lavas são as etapas críticas desta seção. Durante a digestão da proteína na membrana, a lavagem das membranas contendo as proteínas imobilizadas após a redução e alquilação com água destilada, seguida de acetonitrila a 2%, por mais de 10 seg cada, é fundamental para a remoção dos reagentes.</li>
</ol>3. ionização LC-electrospray (ESI)-análise MS/MS
<ol><li>Ative um instrumento ESI-MS/MS (tabela de materiais) acoplado a um sistema de HPLC nano-LC (tabela de materiais). Vincule uma pré-coluna (tabela de materiais) e uma coluna analítica (tabela de materiais).</li>
	<li>Antes da análise, calibrar o espectrómetro de massas utilizando digere tripóticos de albumina sérica bovina dissolvida em 0,2% de ácido fórmico, que fornece peptídeos padrão.</li>
	<li>Analise as amostras usando o modo íon positivo e uma faixa de massa de 400 – 1250 m/z; em seguida, adquira até 10 MS/MS Spectra (100 ms cada) com uma faixa de massa de 100 – 1600 m/z e um gradiente linear de 2% – 80% acetonitrila e 0,2% de ácido fórmico para 80 min a um caudal de 300 nL/min.</li>
	<li>Analise os dados de saída usando software para identificação de proteínas (tabela de materiais) para identificar as proteínas associadas ao candidato. Para a identificação positiva de uma proteína candidata, é necessária a detecção de pelo menos um fragmento peptídico de alta fidelidade (> 95% de fidelidade).</li>
	<li>Omita as proteínas que são precipitadas similarmente em lysates GFP-expressando (transfection do vetor que expressa uma etiqueta de GFP sozinho) da lista de proteínas do candidato. Nota: se poucas proteínas forem identificadas na análise do banco de dados, a modificação das condições de aquisição MS/MS (por exemplo, mudando o tempo de 100 ms cada para 50 ms cada) pode aumentar o número de proteínas identificadas.</li>
</ol>

<ol><li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+protein+folding%3A+progress+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Atherosclerosis+and+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li>
<li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li>
<li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li>
<li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li>
<li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li>
<li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6%2C+a+microtubule-stabilizing+protein%2C+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li>
<li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+elongation%2C+co-translational+folding+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li>
<li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%25+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós descrevemos previamente uma análise das modificações oxidativas do apolipoproteína B-100 na lipoproteína de baixa densidade oxidado usando LC-MS/MS precedido por uma técnica da digestão da em-membrana6. No presente estudo, combinamos esta técnica com imunoprecipitação e identificamos várias proteínas associadas ao calpain-6. Esta técnica nova representa um método conveniente da seleção para proteínas associadas do candidato. Calpain-6 é um membro não-proteolítico da família proteolítica Calpai...

Embora as proteínas desempenham papéis constitutivos em organismos vivos, eles são continuamente sintetizados, processados e degradadas no ambiente intracelular. Além disso, as proteínas intracelulares freqüentemente interagem fisicamente e bioquimicamente, o que afeta a função de um ou ambos1,2,3. Por exemplo, a ligação direta do homólogo CWC22 da proteína do spliceosome-associado com o fator 4a3 da iniciação da tradução eucarióticas (eIF4A3) é necessário para a montagem do complexo4da junção do eXoN. Consistente com isso, um mutante eIF4A3 que carece de afinidade por CWC22 não consegue facilitar a junção de exon emenda de mRNA de complexo-driven4. Assim, o estudo das interações protéicas é crucial para a compreensão precisa da regulação fisiológica, bem como das funções celulares.
Os avanços recentes na espectrometria maciça (MS) foram aplicados à análise detalhada de interações da proteína-proteína. Por exemplo, a coprecipitação de proteínas endógenas ou de proteínas marcadas com as proteínas associadas, seguida pela análise de MS, possibilita a identificação de novas interações protéicas5. Entretanto, um grande gargalo da análise de MS/MS é recuperação pobre das escavações tríptico de amostras da proteína. Para a realização de análises proteômicas em lisados celulares, as técnicas de digestão em gel e na membrana são geralmente empregadas para preparar amostras de MS/MS. Nós temos comparado previamente um procedimento da digestão do em-gel com uma técnica da digestão da em-membrana6, e mostramos que o último estêve associado com a melhor cobertura da seqüência. A membrana do difluoreto do polyvinylidene (PVDF) pode ser apropriada para esta finalidade porque é mecanicamente robusta e resistente às concentrações elevadas de solventes orgânicos7,8, permitindo a digestão enzimática de imobilizados proteínas na presença de 80% acetonitrila9. Além disso, a imobilização em uma membrana pode induzir alterações conformacionais nas proteínas alvo, levando a melhorias na eficiência da digestão tripética10. Consequentemente, neste artigo, nós descrevemos o uso da análise da imunoprecipitação-LC/MS/MS de interações da proteína usando uma técnica da digestão da em-membrana. Este método simples facilita a análise conveniente de interações proteína-proteína mesmo em laboratórios não-especializados.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrila</td><td>Wako</td><td>014-00386</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Wako</td><td>030-05525</td><td></td></tr><tr><td>DiNA</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>nanoflow cromatografia líquida de alta eficiência</td></tr><tr><td>DiNa AI</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>cromatografia líquida de alto desempenho nanoflow equipada com amostrador automático</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads proteína G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Wako</td><td>066-00461</td><td></td></tr><tr><td>HiQ Sil C18W-3</td><td>KYA Tech Co.</td><td>E03-100-100</td><td>0,10 mmID * 100 mmL</td></tr><tr><td>de iodoacetamida</td><td>Wako</td><td>095-02151</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors AV Anticorpo monoclonal (JL-8)</td> <td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Wako</td><td>018-21742</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Sigma</td><td>N6507</td><td>poli (oxietileno) éter octilfenílico (n = 9)</td></tr> <tr><td>peptídeo padrão</td><td>KYA Tech Co.</td><td>tBSA-04</td><td>digestão tríptica de albumina de soro bovino</td></tr><tr><td>PP frasco</td><td>KYA Tech Co.</td><td>03100S</td><td>tubo de amostra de plástico</td></tr><tr><td>Inibidor de protease cooctail</td><td>Sigma</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>Software ProteinPilot</td> Software <td>Sciex</td><td>5034057</td><td>para identificação</td></tr><tr><td>de proteínas Tripsina modificada de grau de sequenciamento</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Tripsina</td></tr><tr><td>Ortovanadato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico di-hidratado</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Wako</td><td>206-10731</td><td></td></tr><tr><td>coluna de armadilha</td><td>KYA Tech Co.</td><td>A03-05-001</td><td>0,5 mmID * 1 mmL</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600 sistema</td><td>Sciex</td><td>4466015</td><td>Espectrômetro de massa em tandem de tempo de voo quadrupolo híbrido</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Wako</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Wako</td><td>160-21211</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

As proteínas intracelular numerosas interagem fisicamente de acordo com suas circunstâncias intracelular e extracelular. De fato, as funções celulares dependem em grande parte das interações proteína-proteína intracelular. Portanto, a pesquisa sobre essas interações é indispensável para facilitar a compreensão dos processos fisiológicos. A co-precipitação das proteínas associadas, seguida pela análise de espectrometria de massas (MS), possibilita a identificação de novas interações proteicas. Neste estudo, nós fornecemos detalhes da técnica nova da imunoprecipitação-cromatografia líquida (LC)-análise de MS/MS combinada com a digestão da em-membrana para a análise de interações da proteína-proteína. Esta técnica é apropriada para immunoprecipitants crus e pode melhorar a produção de análises proteômica. As proteínas recombinantes marcadas foram precipitadas com anticorpos específicos; em seguida, os immunoprecipitants inchados em partes da membrana do difluluoreto do polyvinylidene foram sujeitados ao alkylation redutora. Após a tripsinização, os resíduos de proteínas digeridas foram analisados utilizando-se LC-MS/MS. utilizando esta técnica, pudemos identificar várias proteínas associadas a candidatos. Assim, esse método é conveniente e útil para a caracterização de novas interações proteína-proteína.

Por meio do procedimento descrito acima, os imunoprecipitantes foram analisados utilizando-se LC-MS/MS (Figura 1). Após a exclusão de proteínas derivadas exogenamente (proteínas de outras espécies e IgGs), 17 proteínas foram identificadas em imunoprecipitantes associados ao calpain-6 (tabela 1) e 15 proteínas foram identificadas em imunoprecipitantes associados à GFP ( Tabela 2). Das proteínas calpain-6 e GFP-associadas, 11 f...

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica da digestão da em-membrana para a preparação das amostras para a espectrometria maciça. Esta técnica facilita a análise conveniente das interações proteína-proteína.

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Pesquisar a interação proteína-proteína é indispensável para a compreensão de processos fisiológicos em diversos campos. Neste vídeo introduzimos a técnica de digestão na membrana que permite aos pesquisadores realizar uma análise abrangente das proteínas de ligação por MS de forma conveniente. A principal vantagem desta técnica é que podemos melhorar o throughput de análise proteômica para imunoprecipitantes brutos porque a separação de proteínas por eletroforese de gel de poliacrilamida não é necessária.Comece a conjugar o anticorpo às contas magnéticas, misturando o anticorpo anti-GFP com as contas em 500 microliters de tampão fosfato citrato. Gire a mistura a 50 RPM por uma hora em temperatura ambiente. E depois lave as contas conjugadas três vezes com tampão fosfato citrato contendo 1% de polisorbato 20.Células transfectadas de Lyse de acordo com as instruções do manuscrito. Raspe o prato e transfira o lise para o tubo de ensaio de 1,5 mililitro. Em seguida, limpe o lise por centrifugação a 15.000 x g por cinco minutos e colete o supernatante.Prepare contas magnéticas não rotuladas lavando-as três vezes com 500 microliters de tampão fosfato citrato. Após a lavagem final, remova o tampão e adicione a célula lysate às contas. Gire a mistura a 50 RPM por 30 minutos em temperatura ambiente.Realize a separação magnética no suporte magnético e colete o lisecelular. Para ligar as proteínas alvo às contas conjugadas da imunoglobulina, coloque as contas no suporte magnético por cinco minutos. Descarte o tampão citrato e adicione a célula lysate às contas.Gire a mistura por uma hora a 50 RPM. Para separar as proteínas-alvo das proteínas não-alvo gratuitas, lave as contas três vezes com 500 microliters de tampão fosfato citrato contendo 1% de polisorbato 20. Após a lavagem final, adicione 30 microliters de tampão citrato, e deixe as contas sentarem por cinco minutos à temperatura ambiente para elutar as proteínas alvo.Para preparar a membrana, corte as membranas PVDF em pedaços de 3 milímetros por 3 milímetros usando tesouras cirúrgicas que foram limpas imediatamente antes do uso. Coloque os pedaços de membrana sobre a folha de alumínio e adicione dois a cinco microliters de etanol a cada peça. Antes que as membranas estejam completamente secas, adicione dois a cinco microlitradores do eluente proteico a cada peça e o ar seque-os até que a superfície da membrana fique fosca.Em seguida, transfira as membranas em tubos de 1,5 mililitro e armazene-as a quatro graus Celsius. Se usar imediatamente, adicione dois a 30 microliters de etanol que os tornarão hidrofílicos. Remova o etanol com uma pipeta, mas antes que as membranas sequem, adicione completamente 200 microliters de solução de reação baseada em DTT a cada tubo, e incuba-os a 56 graus Celsius por uma hora.Após a incubação, substitua a solução de reação por 300 microliters de solução de iodoacetamida e incuba no escuro por 45 minutos. Em seguida, lave as membranas duas vezes com água destilada e uma com 2% de acetonitrilo por vórtice por pelo menos dez segundos. Trabalhar com acetonitrila relacionada a diafragm pode ser extremamente perigoso.Uma máscara, óculos e luvas devem ser sempre usados ao realizar o procedimento de digestão na membrana. Prepare a trippsina de acordo com as instruções do manuscrito, e adicione 100 microliters de solução de reação de trippsina a cada membrana. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius para digestão.No dia seguinte, transfira a solução de reação para um tubo limpo de 1,5 mililitro e adicione 100 microliters de soluções de lavagem à membrana. Incubar a membrana a 60 graus Celsius por duas horas, depois coletar a solução de lavagem e misturá-la com a solução de reação. Adicione mais 100 microliters de solução de lavagem à membrana e sonicá-la por 10 minutos.Em seguida, colete a solução de lavagem e misture-a com a solução de reação. Cubra o tubo de ensaio com um pedaço de filme de laboratório e faça pequenos buracos no filme com uma agulha. Seque a solução usando um concentrador de vácuo e dissolva o resíduo em 10 microlitres de ácido fórmico de 2%.Centrifugar o tubo a 12.000 x g por três minutos, e transfira o supernatante em um tubo de amostra. Analise a amostra usando um espectrômetro de massa ligado a um sistema nano LC/HPLC. Por meio deste protocolo, foram identificadas 17 proteínas no imunoprecipitante associado à Calpain-6, 15 no imunoprecipitante associado ao GFP e 11 em ambas.É importante notar que a detecção de pelo menos um fragmento de peptídeo de alta fidelidade é necessária para identificação positiva de uma proteína candidata. Proteínas que precipitaram no liceu expresso em GFP, bem como histones, proteínas exógenas e ribossômicas foram omitidas da lista. Lavar as membranas antes da digestão tripptica com água destilada e 2% de acetonitrilo é o passo mais importante no procedimento de digestão on-membrana sobre proteínas.Seguindo este método, é possível confirmar a co-precipitação da proteína alvo realizando outros experimentos, como imunoprecipitação e análise de manchas ocidentais. Este método simples permite que os pesquisadores explorem as novas interações proteína-proteína com análises convenientes e altamente sensíveis.

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Research

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Biochemistry

Bioquímica

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Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

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Este vídeo demonstra complexos proteicos co-imunoprecipitados em uma membrana de PVDF para análise de interação proteína-proteína. As proteínas reduzidas dos complexos foram tratadas com tripsina para clivar as proteínas individuais nos peptídeos menores e, em seguida, os peptídeos restantes foram extraídos da membrana do PVDF. O peptídeo puxado derivado de ambas as proteínas do complexo foi então seco e ressuspenso em baixa concentração de ácido fórmico para posterior análise.

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A abordagem bioquímica é descrita a identificação in vivo de interacções proteína-proteína (PPI), de proteínas de membrana. O método combina a proteína de ligação cruzada, de purificação por afinidade e espectrometria de massa, e é adaptável para quase qualquer tipo de célula ou organismo. Com esta abordagem, embora a identificação de IPP transientes torna-se possível.

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Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

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Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

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