Reconhecimento da seqüência do ADN pelo primase do ADN usando o perfilamento da primase da elevado-produção

Este protocolo descreve a coleta de dados maciços da microarray de ligação proteína-DNA para primase, uma enzima que se liga transitóriamente a sequências específicas de DNA e, por sua vez, catalisa a formação de primers de RNA. Este vídeo abordará como a tecnologia de microarray pode ajudar a redefinir sites de reconhecimento de sequências primase e como uma abordagem de alto rendimento pode complementar a bioquímica clássica. Esta técnica combina duas abordagens: microarray de ligação de DNA primase e ensaio de atividade primase.

A microarray fornece dados maciços de ligação primase às sequências de DNA, enquanto o ensaio bioquímico fornece informações sobre a formação de primer de RNA por primase de DNA. A atividade enzimática testada depende da percepção do experimento de microarray e de sua menor produção em sua natureza. A ligação entre a eficiência da ligação, a seleção da sequência de DNA e a atividade da enzima é sondada.

A identificação da determinação sequencial usando microarray, nos permite tirar conclusões precisas baseadas em dados maciços da microarray. Esta abordagem tem sido usada até agora para descrever sequências de vinculação de DNA de fatores de transcrição. Fatores de transcrição são proteínas estáticas que se ligam firmemente ao DNA.

Demonstrando o procedimento será Stefan Ilic. Para iniciar este procedimento, pré molhe o slide de microarray colocando-o em um frasco de coplin contendo 0,01% Triton-X 100. E girando em um rotador de laboratório, adicione 125 rpm por cinco minutos.

Pipetar a solução de bloqueio em uma caixa de plástico. Em seguida, remova o slide de microarray do frasco de coplin. Use uma limpeza fina para conduzir o lado não-DNA e as bordas do slide.

Coloque lentamente a microarray na caixa de plástico. Incubar em temperatura ambiente por uma hora com agitação lenta. Depois disso, lave o slide uma vez com 0,01% Tween-20 em PBS.

Em um rotador de laboratório a 125 rpm por cinco minutos. Remova o Tween-20 e enxágue o slide uma vez com 0,01% Triton-X 100 em PBS em um rotador de laboratório a 125 rpm por dois minutos. Em seguida, transfira rapidamente o slide para um frasco de coplin contendo PBS.

Primeiro, montar a câmara do PMB conforme descrito no protocolo de texto. Coloque o slide no espaço designado. Use pinças para empurrá-la para baixo e para a esquerda.

Coloque a junta de silício por cima, certificando-se de que está bem alinhada com a parte inferior da câmara PBM. Em seguida, feche a câmara e aperte os parafusos na diagonal. Pipeta a mistura de ligação de proteína em cada poço da junta.

Em seguida, incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Para começar, pipeta 0,05% Tween-20 em PBS na câmara PBM para lavar brevemente o slide. Usando um aspirador de vácuo, remova a solução dos poços da câmara tendo o cuidado de não tocar nos pontos de DNA.

Repita isso, lave brevemente o slide com PBS. E use o vácuo para remover a solução dos poços da câmara enquanto tome cuidado para não tocar nos pontos de DNA. Em seguida, adicione Alexa 488 anticorpo conjugado a cada poço da câmara PBM.

Incubar no escuro à temperatura ambiente por 30 minutos. Depois disso, lave brevemente o slide dentro da câmara PBM adicionando algumas gotas de 0,05% Tween-20 em PBS em cada poço. E use o aspirador de vácuo para remover a solução dos poços da câmara, tomando cuidado para não tocar nos pontos de DNA.

Desmonte a câmara PBM e remova o slide. Enxágüe os slides duas vezes em 0,05% Tween-20 em PBS, com cada enxágue durando três minutos. Em seguida, enxágue os slides duas vezes em PBS, com cada enxágue durando três minutos cada.

E uma vez em água dupla destilada por três minutos. Seque as lâminas com ar comprimido. E armazená-los em uma caixa de slides escuro até estar pronto para digitalizar.

Quando estiver pronto, use um scanner de microarray para escanear o chip com uma excitação de 495 nanômetros e uma emissão de 19 nanômetros. E coletar a intensidade mediana da fluorescência. Neste estudo, o perfil de primase pi é usado para mapear os locais de ligação primase, incluindo aqueles que são difíceis, se não impossíveis de serem observados usando ferramentas clássicas.

É importante ressaltar que o perfil de primase pi permite a revisitação da compreensão tradicional dos locais de ligação primase. Especialmente o perfil de primase pi throughput revela especificidades vinculantes, além das sequências de reconhecimento conhecidas de 5'GTC3', o que leva a mudanças nas atividades funcionais do primase de DNA T7. Ou seja, dois grupos de sequências são identificados.

Fortes sequências de DNA de ligação que continham TG nos flancos e sequências de DNA de ligação fraca que continham AG nos flancos. Nenhuma ligação primase aos modelos de DNA que faltavam 5'GTC3'dentro de suas sequências foi detectada. Os locais de reconhecimento de DNA primase que contêm características específicas, como flancos ricos em TG, aumentam a ligação de DNA primase em até 10 vezes.

Surpreendentemente, eles também aumentam o comprimento do RNA recém-formado. É importante ressaltar que o perfil primase de alto rendimento nos permite observar e quantificar a variabilidade no comprimento do primer em relação à sequência do modelo de DNA. Ao realizar este procedimento, as etapas de lavagem devem ser sutis.

E os buffers devem conter componentes que registraram o primase no DNA. Também é determinado um limiar de eventos de ligação fúteis bioquimicamente. Portanto, a análise da microarray é insuficiente.

Métodos como ressonância de plasma superficial e ensaios de mudança de gel podem determinar a afinidade vinculante do primase para selecionar as sequências de DNA. Meu laboratório implementa modelos de previsão de aprendizado de máquina para detectar determinantes de sequência de primase que produzem primers produtivos que podem ser estendidos pela polimerase de DNA. Na era do big data, uma implementação de métodos estatísticos para analisar big data, a técnica definitivamente ajudará a caracterizar melhor sequências específicas de DNA e vincular o reconhecimento de sequência à atividade de primase.

Qualquer pessoa que trabalhe com radiação deve ter uma compreensão completa das regulamentações e perigos associados ao uso de radiação ionizante. Deve passar por treinamento e deve trabalhar com equipamentos de segurança.