Cirurgia do Hemisection da medula espinal torácica e avaliação do locomotor do aberto-campo no rato

O hemisection espinal torácico do rato é um modelo valioso e reprodutível de ferimento unilateral da medula espinal para investigar os mecanismos neural da recuperação locomotora e da eficácia do tratamento. Este artigo inclui um guia detalhado passo a passo para realizar o procedimento de hemisection e avaliar o desempenho locomotor em uma arena de campo aberto.

A hemiseção espinhal produz déficits locomotores reprodutíveis quantificáveis e ideais que podem ser capturados com a escala de locomotiva que desenvolvemos. A principal vantagem dessa técnica é a seletividade e reprodutibilidade da lesão, o que leva a uma variabilidade reduzida nos fenótipos comportamentais entre os animais. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um rato adulto anestesiado, faça uma incisão de 2,5 centímetros na pele raspada sobrepor as vértebras T-6 a T-10 e use uma tesoura sem corte para retrair a pele e a gordura superficial.

Use uma tesoura de dissecção contundente e um retrátil auto-retentor para separar os músculos paravertebrales, inserindo no aspecto dorsal das vértebras T-7 a T-9 e use fórceps finos e aplicadores de ponta de algodão para debridar e limpar qualquer tecido restante para expor os processos espinhosos e a lâmina vertebral. Coloque a taxa sob um microscópio estéreo e use aparadores ósseos delicados para cortar cuidadosamente as facetas bilateralmente nas vértebras T-7 e T-8. Use um bisturi para fazer um corte superficial de um milímetro no tecido conjuntivo dorsal entre a laminae vertebral T-8 e T-9, tomando cuidado para não ferir o cordão subjacente e usar aparadores ósseos para remover o processo espinhoso da vértebra T-8.

Com fórceps hemostáticos curvados cuidadosamente fixados no processo giranso T-7, gire a extremidade caudal do laminado T-8 ligeiramente rostrally aproximadamente 20 graus e insira os aparadores ósseos sob a lamina T-8. Faça um corte médio estendendo-se ao longo da lâmina, continuando a laminectomia repetindo os cortes no lado esquerdo e direito da lâmina vertebral medial aos processos transversais para expor a medula espinhal. Goteje 100 microlitadores de 2% lidocaína no canal espinhal exposto e use fórceps finos e tesouras de iridectomia para remover a dura sobreposição do segmento espinhal T-8.

Repita a administração lidocaína ao cabo exposto e identifique a linha média do cabo por visualização de uma linha central criada entre os processos espinhosos que se estendem entre a vértebra T-7 exposta a T-9. Utilizando fórceps finos para estabilizar a medula espinhal, use uma faca dissecando para hemisectar a medula espinhal a partir da linha média em direção a um lado do animal, tomando cuidado para não cortar através da artéria espinhal anterior no lado ventral. Utilizando a tesoura de iridectomia, corte cuidadosamente qualquer tecido remanescente no lado da lesão da medula espinhal para garantir que o quadrante ventral-lateral seja apropriadamente transctoado e coloque uma esponja hemostática estéril, aproximadamente seis por dois milímetros em soro fisiológico na cavidade exposta acima da medula espinhal.

Em seguida, use suturas de poliglactina 4-O 910 para fechar camadas musculares e a pele ao redor do local de incisão e coloque o rato em um ambiente quente sob uma lâmpada de calor com monitoramento até uma recuperação completa. No ponto de tempo experimental apropriado para testes comportamentais, depois que os ratos foram habituados à arena, inicie a gravação de vídeo e coloque um rato no centro da arena, sob condições de luz fraca para incentivar a atividade locomotor. Deixe o rato explorar por pelo menos quatro minutos, movendo o rato de volta para o centro da arena quando ele permanecer parado por mais de 20 segundos para promover a locomoção.

Em seguida, escore o desempenho locomotor da sessão de testes gravada. Para os movimentos articulares dos membros, marque os movimentos articulares da articulação de escalada traseira durante a locomoção espontânea separadamente para o tornozelo, joelho e quadril, como normal, leve ou ausente. Para suporte de peso, avalie a capacidade dos músculos extensores de subida traseira para contrair e apoiar o peso corporal carregado quando o membro estiver no chão para quando o rato estiver parado, bem como durante a locomoção ativa.

Para a posição de dígito, avalie a posição dos dígitos de recuo enquanto o rato estiver parado e durante a locomoção. Complete o parâmetro de estaca apenas se o rato puder suportar seu peso corporal durante a pisada classificando a orientação da colocação da pata de ceteira no momento do contato inicial e na decolagem do chão, além da fluidez da fase de balanço durante a estação. Complete o parâmetro de coordenação de forequipe/ceta apenas se ocorrer quatro etapas consecutivas durante o teste e se os membros puderem suportar ativamente o peso corporal.

Avalie a posição da cauda durante a locomoção como para cima ou para baixo. Em seguida, adicione as pontuações individuais de cada parâmetro para fornecer um total para cada subida traseira para um máximo de 20 pontos. Para avaliar e comparar os tamanhos das lesões entre grupos experimentais, a área máxima da lesão como percentual da seção transversal total da medula espinhal pode ser facilmente calculada com a coloração histológica das seções da medula espinhal.

Por exemplo, esta lesão representativa do hemicord esquerdo com sobreposição da proporção da área de lesão máxima compartilhada entre ratos demonstrou o tamanho médio da lesão de aproximadamente 47% da área do cordão transversal. Essas mudanças representativas no desempenho locomotor no estado intacto nas primeiras cinco semanas após a hemiseção do lado esquerdo demonstram um prejuízo significativo de locomoção na linha traseira esquerda do animal durante as três primeiras semanas após a cirurgia. Uma melhora no nível de locomoção é observada no recuo direito por duas semanas após o procedimento.

As coisas mais importantes a se lembrar são que uma identificação precisa da linha média espinhal para a hemiseção e o cuidado e monitoramento adequados pós-cirúrgicos dos animais são essenciais para um protocolo bem sucedido. Esta avaliação comportamental fornece um protocolo ideal para a triagem de índices de alta parada para suplementação com testes especializados para abordar questões específicas de interesse sobre a recuperação de locomotores.