Name: Amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a amputação da falange P3 em camundongos adultos para estudar a formação de blastema e ossificação intramembranosa. Este modelo permite analisar populações celulares críticas e mecanismos regenerativos em mamíferos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos aos membros do laboratório Muneoka e do Instituto Texas de Medicina Genômica (TIGM). Este trabalho foi apoiado pelo Texas A & M University.

<ol><li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Paediatric+Journal%22%5BJournal%5D)">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li>
<li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li>
<li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li>
<li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalangeal+regrowth+in+rodents%3A+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Clinical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li>
<li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li>
<li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li>
<li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li>
<li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li>
<li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li>
<li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarlson%2C+BM+%22Principles+of+Regenerative+Biology%22">Principles of Regenerative Biology</a>. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).</li>
<li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li>
<li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+%28Mus%29+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li>
<li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li>
<li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li>
<li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%3A+The+Official+Journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li>
<li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Trauma%22%5BJournal%5D)">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li>
<li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).</li>
<li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+And+Related+Research%22%5BJournal%5D)">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li>
<li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li>
<li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digit+Tip+Regeneration%3A+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha%2FCXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li>
<li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BoneJ%3A+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um procedimento padronizado da amputação P3 longe do ponto de origem do rato adulto, mancha immunohistochemical fluorescente para visualizar e investigar a formação do blastema e a ossificação intramembranosos, e a exploração sequencial in vivo do μct a identificar alterações morfológicas ósseas, volume e comprimento pós-amputação. A amputação P3 é um modelo único, proceduralmente simples e reprodutível para analisar um ambiente pró-regenerativo da ferida que desencadeia a formação de blastema. Al...

Os mamíferos, incluindo humanos e camundongos, têm a capacidade de regenerar as pontas de seus dígitos após a amputação distal da falange terminal (P3) 1,2,3. Em camundongos, a resposta de regeneração é dependente do nível de amputação; As amputações cada vez mais proximal do dígito exibem uma resposta regenerativa progressivamente atenuada até a falha regenerativa completa em amputações que transecting e proximal à matriz de prego P34,5,6 , 7 anos de , 8. a regeneração P3 é mediada pela formação de um blastema, definido como uma população de células proliferantes que passam por morfogênese para regenerar as estruturas amputadas9. A formação de um blastema para regenerar as estruturas perdidas pela amputação, um processo denominado regeneração epimórfica, distingue a resposta de regeneração P3 de nível multitecidual do reparo tecidual tradicional após a lesão6, 10. a regeneração P3 é um modelo reprodutível e proceduralmente simples para investigar processos regenerativos complexos, incluindo cicatrização de feridas11,12, histólise11,12, revascularização13, regeneração periférica14do nervo, e conversão de blastemal ao osso através da ossificação intramembranosos15.
Estudos prévios com imunohistoquímica demonstraram que o blastema é heterogêneo, avascular, hipóxico e altamente proliferativo11,13,15,16. Após a amputação distal do P3, o blastema precoce é inicialmente associado ao periósteo P3 e ao endoesteto e caracteriza-se por proliferação robusta e osteogênese nascente adjacente à superfície óssea15. Subseqüente à degradação do osso e ao fechamento da ferida, o blastema heterogêneo é dado forma pela fusão de pilhas periosteal e endoroubo-associadas, seguidas pela diferenciação de componentes blastemal que incluem o osso através da ossificação intramembranosos quinze anos.
O reparo ósseo em resposta à lesão ocorre tipicamente pela ossificação endocondral, ou seja, por meio de um calo cartilaginoso inicial que forma um modelo de formação óssea subseqüente17,18. A ossificação intramembranosos do osso longo, isto é, formação do osso sem um intermediário cartilaginoso, é induzida geralmente usando dispositivos complexos da distracção ou a fixação cirúrgica19,20. A resposta de regeneração de dígitos é um modelo pré-clínico que oferece vantagens sobre os modelos de ossificação intramembranosa convencional: 1) não requer lesão pós-fixação externa ou interna para estimular a ossificação intramembranosa, 2) é realizada com 4 dígitos de cada animal, maximizando as amostras e minimizando o uso de animais, e 3) a análise sequencial in vivo do tomography microcomputado (μCT) pode ser executada com facilidade e velocidade.
No presente estudo, mostramos o plano de amputação P3 padronizado para obter uma resposta de regeneração reprodutível e robusta. Adicionalmente, Nós demonstramos um protocolo aperfeiçoado da imunohistoquímica da fluorescência usando seções da parafina para visualizar a formação do blastema, o revascularização no contexto da regeneração, e a conversão blastemal ao osso através de intramembranosos Ossificação. Também demonstramos o uso de μCT in vivo sequencial para identificar alterações na morfologia óssea, volume e comprimento no mesmo dígito ao longo da regeneração. O objetivo deste protocolo é investigar a formação de blastema de mamíferos após a amputação e demonstrar 2 técnicas, imunohistoquímica de fluorescência e μCT in vivo sequencial, para o estudo da regeneração óssea intramembranosa.

<table><tbody><tr><td>Proteína Bloco de Soro Livre</td><td>DAKO</td><td>X0909</td><td>Pronto para usar</td></tr><tr><td>anticorpo anti-PCNA de camundongo</td><td>Abcam</td><td>ab29</td><td>1:2000 Diluição</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CXCR4</td> R<td>& D Systems</td><td>MAB21651</td><td>diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-vWF XIII humano de coelho</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>Diluição 1:800</td></tr><tr><td>Anti-osterix de coelho, anticorpo SP7</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td>Diluição 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Runx2 de coelho</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>HPA022040</td><td>1:250 diluição</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 IgG anti-rato de cabra conjugada (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra conjugada Alexa Fluor 488 (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra conjugada Alexa Fluor 568 (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>Reagente antidesbotamento</td> <td>Prolong GoldInvitrogen</td><td>P36930</td><td>Pronto para usar</td></tr><tr><td>Surgipath Decalicifier 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800400</td><td>Pronto para usar</td></tr><tr><td>Z-Fix, Fixador aquoso de zinco tamponado formalina</td><td>Anatech LTD</td><td>174</td><td>Pronto para usar</td></tr><tr><td>CD-1 Mouse Fêmea</td><td>Envigo</td><td>ICR(CD-1)</td><td>8-12-semanas de idade</td></tr><tr><td>vivaCT 40</td><td>SCANCO Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Aqui, nós apresentamos um protocolo da amputação terminal distal do falange (P3) do rato adulto, um modelo mamífero processualmente simples e reprodutível da regeneração epimórfica, que envolve a formação do blastema e a ossificação intramembranosos analisadas por Immunohistochemistry da fluorescência e tomography microcomputado in-vivo seqüencial (μCT). A regeneração dos mamíferos é restrita a amputações que transecting a região distal do terminal falange (P3); os dígitos amputados em uns níveis mais proximal não conseguem regenerar e submeter-se à cura fibrótica e à formação da cicatriz. A resposta de regeneração é mediada pela formação de um blastema proliferativo, seguido pela regeneração óssea via ossificação intramembranosa para restaurar o comprimento esquelético amputado. A amputação P3 é um modelo pré-clínico para investigar a regeneração epimórfica em mamíferos, e é uma ferramenta poderosa para o projeto de estratégias terapêuticas substituir a cura fibrótica com uma resposta regenerativa bem sucedida. Nosso protocolo usa a imunohistoquímica de fluorescência para 1) identificar populações de células de blastema precoces, 2) revascularização do estudo no contexto da regeneração e 3) investigar a ossificação intramembranosa sem a necessidade de osso complexo dispositivos de estabilização. Também demonstramos o uso de μCT sequencial in vivo para criar imagens de alta resolução para examinar as alterações morfológicas após a amputação, bem como quantificar mudanças de volume e comprimento no mesmo dígito ao longo da regeneração. Nós acreditamos que este protocolo oferece a utilidade tremenda para investigar epimórfica e respostas regenerativa do tecido nos mamíferos.

O rato adulto que regenera os dígitos P3 em 6/7 DPA (Figura 2a-D), 9 DPA (Figura 2e-H), e 10 DPA (Figura 2i-L) foi immunomanchado com os anticorpos a Runx2, a OSX, e a PCNA para visualizar o osso intramembranosos regeneração, e immunomanchado com os anticorpos a CXCR4 e a fvw para visualizar a formação do blastema. Representações de μCT representativas de dígitos verificados antes d...

Aqui, nós apresentamos um protocolo da amputação terminal adulta do falange do rato para investigar a formação mamífero do blastema e a ossificação intramembranosos, analisadas pelo immunohistochemistry fluorescente e pelo tomography microcomputado in-vivo seqüencial.

Amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

A amputação P3 é um modelo pré-clínico para investigar a regeneração epimórfica dos mamíferos e uma poderosa ferramenta para identificar populações e mecanismos de células críticas que controlam a regeneração endógena. O modelo P3 permite a identificação de populações de células explosivas precoces e tardias, o estudo da revascularização durante a regeneração e a investigação da ossificação intramembrana sem requisitos complexos de dispositivo de estabilização óssea. Demonstrando o procedimento comigo estarão Osama Qureshi, Alyssa Falck, e Katherine Zimmel, técnica, e Regina Brunaeur, professora assistente de pesquisa do nosso laboratório.Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um mouse CD-1 de oito a 12 semanas de idade, aplique pomada aos olhos do animal e coloque o mouse sob um microscópio de dissecção de 10X. Use iodo de povidona cirúrgica e 70% de etanol para esterilizar os dígitos de cada membro traseiro e usar microscisores para cortar os cabelos longe do local cirúrgico. Aplique um microliter de bupivacaína tópica localmente para anestesiar o local cirúrgico, e levemente jogar uma pata traseira para expor a superfície do dígito medial.Em seguida, segurando o bisturi em um ângulo paralelo à almofada de gordura, use um bisturi estéril número 10 para amputar a ponta distal da falange terminal de dígitos dois e quatro. Aplique um microliter adicional de bupivacaína localmente a cada dígito amputado e devolva o rato a uma gaiola limpa para permitir que as feridas se curem sem curativo de ferida e com monitoramento até a recumbência total. Para assegurar um plano de amputação P3 bem sucedido, segure o bisturi paralelo à almofada de gordura durante a amputação e realize a varredura micro-CT para confirmar o comprimento correto da amputação.No ponto final experimental apropriado, use um bisturi para cortar o dígito no meio do osso da falange média aproximadamente no segundo recuo da almofada de gordura ventral. Transfira o tecido para um frasco de cintilação de 20 mililitros contendo 10 mililitros de formalina de zinco tamponada fresca fixativa por 24 a 48 horas. E use um microtome para adquirir seções de quatro a cinco micrômetros de espessura de cada dígito, colocando as fatias em um banho de água de 38 a 41 graus Celsius complementado com uma solução adesiva histológica à medida que são obtidas.Em seguida, capture as fatias em slides adesivos e coloque os slides em um aquecedor de slides Celsius de 37 graus para secar. Quando os slides tiverem sido desparafinados, mergulhe as amostras em um frasco de coloração de uma solução de recuperação de antígeno apropriada, e aqueça os slides a 95 graus Celsius por 25 minutos, certificando-se de que a ebulição não ocorra. No final da incubação, permita que o frasco chegue à temperatura ambiente, e coloque os slides em uma caixa de slides de plástico coberta de uma polegada com papel de tecido umedecido na base.Adicione 100 microliters de proteínas pré-armadase K a cada amostra. Cubra cada slide com uma pequena faixa de parafilm para garantir que as seções não fiquem secas. Após 12 minutos a 37 graus Celsius, remova cuidadosamente o filme de parafina e drene suavemente as lâminas em papel de tecido para remover o excesso de solução de bloqueio.Em seguida, adicione 100 a 200 microliters da solução de anticorpos primária de interesse a cada slide. Devolva os locais à câmara umidificante coberta com filme de parafina para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, depois de lavar os slides em soro fisiológico tamponado tris mais etiqueta TWEEN ou TBST os slides com uma solução de anticorpos secundários apropriada para uma incubação de 45 minutos à temperatura ambiente protegido da luz.No final da incubação, lave os slides em TBST e deixe-os secar. Em seguida, use 100 microliters de meio de montagem anti-fade para colocar cuidadosamente as tampas nos slides secos e armazenar os slides plano à temperatura ambiente durante a noite protegidos da luz para permitir que o meio de montagem seque. Para a tomografia microcomputante in vivo ou micro-CT, o microcsor com tubos para permitir o fluxo de oxigênio dentro e fora da câmara animal micro-CT, certificando-se de que o oxigênio de saída está equipado com um filtro de carvão ativado para prender o isoflurane.Defina o Voxelsize para 10,5 micrômetros a 55 quilovoltage de pico e 145 microamps com 1.000 projeções por 180 graus e rotação contínua com um Tempo de Integração de 200 milissegundos, resultando em um máximo de 213 fatias por varredura. Quando o scanner estiver pronto, coloque suavemente o rato anestesiado na câmara animal micro-CT com os dígitos do membro traseiro dispostos em lado ventral de associação plana e próxima para cima com a pata esquerda no lado esquerdo e a direita no lado direito da plataforma de varredura. Em seguida, aplique fita cirúrgica para fixar suavemente os dígitos no lugar.Aplique pomada oftálmica aos olhos do animal antes de iniciar o exame. Após a varredura, devolva o animal a uma gaiola limpa com monitoramento até a recumbência total, e permita até várias horas para reconstrução de imagens microcS. Para análise da imagem óssea 3D reconstruída, usando o software fornecido com o micro-CT, converta os arquivos de imagem em uma série de arquivos DICOM.Quando todos os arquivos tiverem sido convertidos, baixe a série DICOM em uma única pasta usando um downloader de arquivos em lote em um navegador da Web. Carregue o plug-in BoneJ na pasta plug-in ImageJ. Arraste e solte a pasta da série de arquivos DICOM na barra ImageJ para abrir os arquivos.Uma pilha de imagens de 16 bits exibindo todos os valores cinzentos será aberta. Para exibir somente osso, clique em Ajustar e Limiar de imagem. Deslize a barra superior para a extrema direita e ajuste a barra inferior até que apenas o osso seja destacado vermelho.O menor valor de limiar será de aproximadamente 10.000 a 13.000 a uma intensidade máxima de sinal de 32.767. Clique em Aplicar e na nova caixa de diálogo, clique em Plano de Fundo Preto. Em seguida, clique em OK. Uma imagem de oito bits exibindo valores em preto e branco será gerada.Com o branco correspondente ao osso. Desenhe um retângulo ao redor do osso P3 para selecioná-lo e duplicar a pilha. Para gerar uma imagem 3D, clique em Plugins e 3D Viewer e use a ferramenta de seleção à mão livre para circular o osso a ser excluído.Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione Preencher a seleção para cortar qualquer osso desnecessário da imagem. Para quantificar o volume ósseo da renderização 3D, abra o plug-in BoneJ e selecione a Fração de Volume. Uma janela de resultados aparecerá e o volume ósseo exibido em milímetros cúbicos.Para quantificar o comprimento do osso da renderização 3D, use a ferramenta ImageJ multipoint. Para capturar uma imagem da renderização 3D, clique em Exibir e tirar uma foto. Em seguida, salve a imagem como um arquivo TIF ou JPEG.Nestas imagens, seções de um rato adulto regenerando dígito P3 foram imunossuídas com anticorpos para visualizar a regeneração óssea intramembrana e a formação de blastema nos dias seis a sete, nove e 10 pós-amputação. Aqui, são mostradas renderizações representativas de microcsps de dígitos digitalizados antes da amputação e em vários pontos de tempo ao longo da regeneração com marcos utilizados para identificar medidas de comprimento. O modelo de dígito do rato é um sistema poderoso para analisar um ambiente de ferida pró-regenerativa que desencadeia a formação de blastema quando amputado a um nível distal.Por outro lado, a amputação proximal dos dígitos serve como um sistema modelo para investigar a falha regenerativa, bem como um local para testar estratégias para melhorar a regeneração.

adult-mouse-digit-amputation-regeneration-simple-model-to-investigate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Modelos animais são frequentemente empregados para mimetizar lesões ósseas graves em pesquisas biomédicas. Devido ao seu pequeno tamanho, o estabelecimento de lesões ósseas estabilizadas em camundongos está além das capacidades da maioria dos grupos de pesquisa. Aqui, descrevemos um método simples para estabelecer e analisar defeitos femorais experimentais em camundongos.

Um Defeito modelo simples Critical porte Femoral em Ratos

Apresentamos um protocolo para capturar a dinâmica da regeneração da barbatana caudal de larvas de peixe-zebra em uma escala de tecido inteiro usando estereomicroscopia baseada em campo claro. Esta técnica permite capturar a dinâmica de regeneração com resolução de célula única. Esta metodologia pode ser adaptada a qualquer estereomicroscópio equipado com uma câmera CCD e software de lapso de tempo.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

Um modelo de tenotomia de Aquiles e lesão por queimadura de ossificação heterotópica permite o estudo confiável da formação óssea ectópica induzida por trauma sem a aplicação de fatores exógenos.

Direto Rato Trauma / Burn Modelo de ossificação heterotópica

Embora os modelos de camundongos sejam ferramentas inestimáveis para a engenharia de tecidos ósseos, os modelos de defeitos de ossos longos são escassos. Essa necessidade motivou o desenvolvimento do presente protocolo, que utiliza uma placa bloqueada com quatro parafusos e um gabarito dedicado para realizar e estabilizar um defeito reprodutível, femoral, de tamanho crítico e com baixa morbidade.

Estabelecimento de um Defeito Modelo segmentar Femoral Critical-size em Ratos estabilizada por osteossíntese Placa

Este artigo descreve como realizar um método cirúrgico para inibir a formação de epiderme de feridas durante a regeneração do membro axolotl, suturando imediatamente a pele de espessura total sobre o plano de amputação. Este método permite que os pesquisadores investiguem os papéis funcionais da epiderme da ferida durante os estágios iniciais da regeneração dos membros.

Inibição da Formação de Epiderme ferida através de cirurgia de retalho de pele completa durante a regeneração do membro axolotl

Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico para o estabelecimento de uma fratura diafisária no fêmur de camundongos, que é estabilizada com um fio intramedular, para estudos de consolidação da fratura.

Estabelecimento de um Modelo de Fratura Diafisária do Fêmur em Camundongos

Este protocolo demonstra passo-a-passo detalhes de como extrair o primeiro molar inferior no camundongo. Ele fornece um método alternativo para pesquisadores com foco na cicatrização e regeneração dos ossos maxilares.

O Estabelecimento de um Modelo de Cicatrização de Molares Mandibulares Murinos

Apresenta-se um protocolo para cirurgia de osteotomia femoral com o uso de fixação interna em axolotes maduros. O procedimento pode ser utilizado para realizar estudos comparativos sobre regeneração de membros e consolidação de fraturas em anfíbios aquáticos.

Estabilização de uma osteotomia de fêmur com fixação de placa em Ambystoma mexicanum

Neste protocolo, mostramos como preparar tecido de axolote para microscopia de força atômica (AFM) e realizar medições de indentação na cartilagem intacta e em regeneração.

Medições de Microscopia de Força Atômica de Cartilagem em Membros de Axolote Intactos e em Regeneração

O modelo de lesão da medula óssea murina é uma ferramenta útil para estudar a osteogênese pós-natal por ossificação intramembranosa. Este protocolo cirúrgico simplificado descreve o procedimento de ablação da medula óssea para avaliação a jusante da nova formação óssea e respostas celulares após a lesão.

Metodologia aprimorada para estudar a osteogênese pós-natal via ossificação intramembranosa em um modelo de lesão da medula óssea murina

O objetivo deste estudo foi padronizar uma abordagem cirúrgica segura e reprodutível para realizar uma amputação transversa completa da mandíbula em Ambystoma mexicanum , visando o estudo da regeneração do tecido craniofacial.

Desenho e Padronização de um Modelo de Lesão Mandibular para o Estudo da Regeneração de Tecido Craniofacial no Modelo Ambystoma mexicanum

Aprenda a amputação da falange P3 em camundongos adultos para estudar a formação de blastema e ossificação intramembranosa. Este modelo permite analisar populações celulares críticas e mecanismos regenerativos em mamíferos.

Amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa (Vídeo) | JoVE Journal

Amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa

Explorar mais vídeos