Name: Imunolabellagem de degeneração da miofibra em biópsias musculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprenda a técnica de imunolabellagem de miofibras necróticas em biópsias musculares usando camundongos mdx. Este método utiliza captura de IgG para identificar células necroticas e avaliar degeneração muscular em distúrbios neuromusculares.

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Este trabalho foi apoiado pela Associação Française contre les Myopathies com o programa Translamuscle. Os autores agradecem ao Dr. Perla Reyes-Fernandez e ao Dr. Matthew Borok por sua leitura cuidadosa do manuscrito.

Os experimentos foram realizados de acordo com a legislação da Comunidade Francesa e Europeia (licença número 11-00010).
1. Preparação da goma de Tragacanth
<ol><li>Em um copo de vidro, dissolva 6 g de pó de tragacanth em 100 mL de água desionizada. Cubra com papel alumínio e deixe por pelo menos 3 h. Ocasionalmente mexa manualmente com uma espátula de metal como a mistura rapidamente se torna viscosa.</li>
	<li>Deixe a mistura de tragacanth a 60 °C durante a noite em um banho de água ou no forno. Selar cuidadosamente o copo para evitar a secagem. Mexa pelo menos uma vez antes de adianizar.</li>
	<li>Aliquot e armazenar a 4 °C por até 2 semanas.</li>
</ol>2. Coleção do músculo
NOTA: Para este experimento, um rato mdx macho de 4 semanas de idade foi sacrificado por luxação cervical. Este procedimento não requer anestesia e é um método de matança humana de acordo com a legislação local.
<ol><li>Dissecação do músculo tibialis anterior (TA)<ol>
<li>Depois de raspar a perna do rato, coloque o rato de costas e pine os pés em um quadro de cortiça com agulhas. Usando tesoura de precisão (ou um bisturi) e fórceps, retire a pele da perna do pé até o joelho para expor todo o comprimento da tíbia e TA.</li>
		<li>Com tesoura, faça uma incisão entre a tíbia e o TA. Isto facilitará a separação do TA do osso e fornecerá um aperto fácil ao epimysium. Usando fórceps de precisão, retire cuidadosamente a camada de epimisão da superfície do TA. NOTA: A partir desta etapa, o TA pode ser mais suscetível à secagem, que deve ser evitada.</li>
		<li>Na região do tornozelo, isolar o tendão TA de outros tendões com fórceps. Puxe suavemente o tendão TA para isolá-lo da tíbia e músculos circundantes.</li>
		<li>Quando a barriga TA é totalmente separada, segure o tendão para cima de modo que apenas a parte proximal do músculo TA está ligado ao joelho. Cortar suavemente o tendão proximal o mais próximo possível do osso do joelho.</li>
		<li>Coloque o TA em uma gaze que é levemente umedecido com soro para evitar a secagem antes de congelar o músculo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pré-cool 70-100 mL de isopentane em um plástico ou copo de politetrafluoroetileno, mergulhando parcialmente em nitrogênio líquido. Deixe esfriar até que o isopentane na parte inferior do copo se torne um sólido branco.</li>
	<li>Em um pedaço circular de cortiça (20 mm x 11 mm x 8 mm), coloque ~ 0,5 mL de goma tragacanth. Cuidadosamente pré-rotular o outro lado da cortiça para que a biópsia pode ser devidamente identificado após a etapa de congelamento.</li>
	<li>Incorporar o TA na goma com fórceps, tendão distal para cima. Para permitir seções transversais apropriadas do músculo, segure o músculo com seu eixo perpendicular à superfície da cortiça. A qualidade das criossecções melhorará se a biópsia não estiver completamente incorporada na gengiva. Permita que pelo menos metade do TA (lado do tendão) seja descoberto pela gengiva.</li>
	<li>Mergulhe rapidamente a cortiça com o músculo embutido na camada de isopentane descongelada e fria. Note-se que a cortiça vai flutuar no líquido isopentane. Segure a amostra de cabeça para baixo como o músculo precisa ser mergulhado em isopentane. Deixe as amostras no isopentane por cerca de 2 min para permitir o congelamento completo. NOTA: A partir desta fase, o TA deve permanecer congelado até criosecção. Guarde o músculo no gelo seco antes do armazenamento a longo prazo em um congelador de -80 °C.</li>
</ol>3. Criossecagem
<ol><li>Definir a temperatura do criostat em -25 °C. Mantenha a temperatura do objeto em torno de -20 °C. Corrigir o objeto no criostat usando temperatura de corte ideal (OCT) composto. Apare o músculo até atingir a barriga muscular, em seguida, corte 7-10 seções μm. NOTA: A estabilização da temperatura do objeto requer pelo menos 10 min.</li>
	<li>Mantenha lâminas de vidro usadas para coletar criosecções à temperatura ambiente (RT). Colete pelo menos duas seções em cada slide. As seções musculares irão automaticamente ficar e descongelar no contato do slide de vidro quente. Retire o slide e mantê-lo em RT.</li>
	<li>Permitir que as seções sequem pelo menos 20 min no RT em um ambiente ventilado.</li>
	<li>Guarde as criosmas em lâminas de vidro a -80 °C até o uso.</li>
</ol>4. Imunorotulagem
<ol><li>Descongele slides em RT por pelo menos 15 min em um ambiente ventilado.</li>
	<li>Delineie a área das seções com uma pena hidrofóbica. Permita que a barreira hidrofóbica seque.</li>
	<li>Corrija o tecido com paraformaldeído de 2% por 10 min em uma câmara úmida.</li>
	<li>Lave as seções com sosseo-soline tampão de fosfato (PBS) 2x por 5 min cada.</li>
	<li>Bloqueie as seções musculares com 10% de soro de cabra diluído em PBS por 1 h em RT em uma câmara úmida.</li>
	<li>Incubar as seções para 2 h em RT (ou durante a noite em 4 °C) em uma câmara úmida com os anticorpos primários diluídos em 5% de soro de cabra. Para a rotulagem simples da captação de IgG em miofibras, apenas incubação seções com anticorpo coelho para rato pan-laminina. NOTA: Outros antígenos da matriz extracelular podem ser direcionados, desde que forneçam uma rotulagem clara da matriz extracelular circundante das miofibras. Marcadores para regeneração muscular, inflamação ou outros parâmetros podem ser combinados, desde que os anticorpos não são levantadas em um hospedeiro do mouse. O microscópio utilizado para a análise deve incluir uma cor suplementar de fluorescência.</li>
	<li>Lave as seções com PBS 3x por 5 min cada.</li>
	<li>Incubar as seções com anticorpo secundário policlonal de cabra fluorescente vermelha para coelho IgG H&L e anticorpo secundário policlonal de cabra fluorescente verde para camundongoIgH&L. Incubate em RT por 45 min em uma câmara úmida.</li>
	<li>Lave com PBS 3x por 10 min cada.</li>
	<li>Monte as seções em médio de montagem fluorescente contendo 100 ng/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e cubra cada slide com um coverslip.</li>
	<li>Deixe a secagem durante a noite a 4 °C antes da imagem.</li>
</ol>

<ol><li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy%3A+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li>
<li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases%3A+cytochemical+and+immunocytochemical+data%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li>
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<li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li>
<li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li>
<li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li>
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<li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li>
<li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+%28mdx%29+and+normal+muscle+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li>
<li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Necrose da miofibra é uma conseqüência comum do exercício traumático em músculos normais. É bem compensado por uma poderosa capacidade regenerativa dos progenitores musculares locais. No entanto, em várias condições musculares, como em DMs, a capacidade regenerativa das células de satélite é comprometida pela mioneconese crônica e fibrose excessiva. Os resultados recentes mostram que as fibras musculares podem morrer por necroptose, uma forma regulada de necrose. Mais especificamente, a inibição da necroptose pode se tor...

O músculo esquelético estriado consiste principalmente em fibras musculares (miofibras), que são responsáveis pela função contélica voluntária característica. Essas células são estruturas multinucleadas e pós-mitocômicas que suportam o estresse mecânico ocorrendo durante a contração. A estabilidade estrutural da membrana de miofibra (sarcolemia) e sua matriz extracelular são cruciais para a homeostase do tecido. As células de satélite compreendem a principal população de progenitores musculares no músculo esquelético maduro e existem em estado quiescente em músculos saudáveis. Após a morte por miofibra, a regeneração muscular é apoiada por células via satélite após um programa miogênico que envolve ativação de células via satélite, proliferação, diferenciação e fusão para, em última análise, formar novas miofibras multinucleadas.
A morte da miofibra pode ocorrer em múltiplas condições musculares, incluindo trauma mecânico, lesões de isquemia-reperfusão ou distrofias musculares, e está associada à morfologia necrótica das células mortas1,2. A morte necrótica é caracterizada pela permeabilidade rápida da membrana plasmática e liberação de conteúdo celular no compartimento extracelular3. Pode resultar de um processo não regulamentado que não envolva nenhuma sinalização celular adequada (ou seja, necrose acidental) ou de uma via intracelular orquestrada (ou seja, necrose regulada). Em miofibras, ambos regulamentados4 enão regulamentados 5 processos podem levar à necrose. Uma conseqüência típica da mioneconese é a liberação de padrões de moléculas associados a danos, ativando uma poderosa resposta inflamatória6. A presença de macrófagos é observada em torno de 48 h e 72 h após lesão7. Além de seu papel na limpeza de detritos necróticos, eles também são importantes na regeneração muscular8,9.
Distrofias musculares (DM) são um grupo heterogêneo de patologias que muitas vezes resultam de um defeito na estrutura da sarcolema. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença juvenil ligada ao X que afeta aproximadamente 1 em cada 3.500 nascimentos masculinos em todo o mundo10,e é causada pela ausência de expressão de distrofina na sarcolema. A degeneração crônica do tecido muscular em meninos dmd leva a extrema fraqueza muscular e mortalidade precoce. Inflamação resultante da morte necrótica aumenta a citotoxicidade, e promove a fibrose muscular e a perda da função muscular11,12. Tratamentos atualmente em ensaios clínicos visando as raízes de distúrbios degenerativos musculares, como a terapia gênica, são esperados para aliviar a mioneconese. Técnicas simples para quantificar com precisão a degeneração muscular são, portanto, necessárias.
Vários métodos são rotineiramente usados para monitorar a perda de miofibra in vivo. A medição da atividade enzimática da cineza de creatina (CK) no sangue permite quantificação confiável da necrose contínua nos tecidos musculares e cardíacos. In situ, a coloração hematoxilina e eosina (H&E) é o método mais popular usado atualmente no diagnóstico para avaliar a remodelação da regeneração da degeneração. No entanto, a base molecular da rotulagem de H&E das células mortas ainda não está clara. Além disso, modificações de cor que sugerem morte por miofibra na coloração de H&E são relativamente sutis e não facilitam a quantificação confiável e reproduzível. Métodos que revelam a fragmentação do DNA, como o terminal desoxinucleotidyl transferase dUTP nick end labelling (TUNEL), imperfeitamente rotular morte necrótica3. Eles também são mal adaptados para monitorar a morte de células sincrial, como miofibras. A injeção de corantes vitais, como o corante azul de Evan (EBD), representa uma alternativa útil para avaliar miofibras que perderam a integridade da sarcolema, mas não é necessariamente conveniente em alguns protocolos experimentais. Por exemplo, a presença de EBD em amostras de sangue pode afetar os resultados das medições de CK, um ensaio colorimétrico. Além disso, a adposição intracelular de EBD torna a co-imunorotulagem desafiadora. Portanto, um método alternativo que permite a rotulagem direta das miofibras submetidas à necrose é de interesse.
O mecanismo de ação de corantes vitais depende da perda da integridade da membrana plasmática em miofibras necróticas e da captação passiva do corante injetado. Da mesma forma, as miofibras necróticas captam proteínas do sangue, como a albumina, para a qual a EBD tem uma forte afinidade13,14, imunoglobulina G (IgG) e IgM15. A presença anormal de proteínas do sangue dentro de miofibras, portanto, representa marcadores convenientes para mioneconese in situ. Manchar estas proteínas pode ser uma alternativa para o uso de corantes vitais.
Usando a captação de IgG como um marcador da mioneconese in situ, este protocolo é usado para avaliar a degeneração muscular no tibialis anterior (TA) de camundongos deficientes em distrophina mdx. Este método apresenta vantagens significativas sobre técnicas alternativas: 1) é reproduzível e simples em sua execução; 2) não requer qualquer tratamento animal antes da coleta muscular, como a injeção de corantes vitais circulantes, e 3) como qualquer imunorotulagem convencional, é compatível com a co-rotulagem.

<table><tbody><tr><td>Discos circulares de cortiça</td><td>Pyramid Innovation</td><td>R30001-E</td><td>Não se esqueça de rotular claramente a cortiça para que o ID da amostra possa ser determinado após o congelamento</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 sn34</td><td>A criosecção muscular deve ser realizada entre -20 e -25&deg;C. Espessura:7-10 micrômetros.</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Uma barreira hidrofóbica ao redor das seções musculares. Previne a dispersão do meio durante a incubação</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>FST</td><td>91117-10</td><td>/</td></tr><tr><td>Cabra anti-Mouse IgG (H+L) anticorpo, Alexa Fluor Plus 488</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A-11029</td><td>Diluição: 1/500</td></tr><tr><td>Cabra anti-Coelho IgG (H+L) anticorpo Alexa Fluor Plus 594</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A32740</td><td>Diluição: 1/500</td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td>Na etapa de bloqueio, use diluição de 10% em PBS. Para incubação de anticorpos, use diluição de 5% em PBS</td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78-78-4</td><td>Meio de congelamento. Deve ser resfriado em um béquer colocado em nitrogênio líquido.</td></tr><tr><td>camundongo mdx</td><td>Jackson Laboratory</td><td>C57BL / 10ScSn-Dmdmdx / J</td><td>Os camundongos Mdx são mutados para o gene da distrofina. A partir das três semanas de idade, os músculos são caracterizados por degeneração crônica</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>Imager.D1</td><td>/</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Cellpath</td><td>KMA-0100-00A</td><td>Matriz de incorporação</td></tr><tr><td>PFA (Paraformaldeído)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>28908</td><td>Usado para fixação de criossecção (2% ou 4% PFA pode ser usado)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Eurobio</td><td>CS3PBS00-01</td><td>Meio de diluição para imunomarcação</td></tr><tr><td>Scisors de precisão</td><td>FST</td><td>fst 14001-12 e fst 14001-14</td><td>Usado para a coleta muscular</td></tr><tr><td>Anticorpo de coelho para pan-Laminina de camundongo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9393</td><td>Diluição: 1/1000</td></tr><tr><td>Tragacanth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1128</td><td>Alíquotas para manter em +4&deg; O</td></tr></tbody></table>

imunolabellagem de degeneração da miofibra em biópsias musculares

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

A necrose das fibras musculares (mionecrose) desempenha um papel central na patogênese de várias condições musculares, incluindo distrofias musculares. Espera-se que as opções terapêuticas que abordem as causas da patogênese da distrofia muscular aliviem a degeneração muscular. Portanto, um método para ensaio e quantificar a extensão da morte celular em biópsias musculares é necessário. Métodos convencionais para observar a degeneração da miofibra in situ são pouco quantitativos ou dependem da injeção de corantes vitais. Neste artigo, um protocolo de imunofluorescência é descrito que mancha miofibras necróticas, visando a captação de imunoglobulina G (IgG) por miofibras. O método de captação de IgG é baseado em características celulares que caracterizam a morte necrótica, incluindo 1) a perda de integridade da membrana plasmática com a liberação de padrões moleculares associados a danos e 2) a captação de proteínas plasmáticas. Nas seções transversais de urina, a co-imunorotulagem de miofibras, proteínas de matriz extracelular e o mouse IgG permite a identificação limpa e direta das miofibras com destino necrótico. Este método simples é adequado para análise quantitativa e aplicável a todas as espécies, incluindo amostras humanas, e não requer a injeção de tinudura vital. A coloração de miofibras necróticas pela captação de IgG também pode ser emparelhada com outras co-imunorotulagem.

As miofibras estão cercadas por uma matriz extracelular contendo laminina. A coloração vermelha delimita a periferia das miofibras e permite sua identificação. IgG é mostrado em verde. Os núcleos são manchados com DAPI e são encontrados azuis o microscópio. No entanto, os núcleos são mostrados em branco aqui (Figura 1). Uma imunoreatividade IgG fraca é esperada no compartimento extracelular, que pode ser aumentado em caso de inflamação. A coloração verde dent...

Descrito aqui é um protocolo para imunorotulagem direta de miofibras necróticas em criosecções musculares. As células necróticas são permeáveis para as proteínas séricas, incluindo a imunoglobulina G (IgG). Revelar a captação de IgG por miofibras permite a identificação e quantificação de miofibras que sofrem necrose, independentemente da condição muscular.

Imunolabellagem de degeneração da miofibra em biópsias musculares

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

A necrose do miofibra é característica de múltiplas doenças neuromusculares e desempenha um papel central na patogênese. Um método específico e confiável para avaliar a degeneração muscular é importante para o diagnóstico e a pesquisa translacional. Esta técnica extremamente adaptável permite a rotulagem de antígeno múltiplo ao mesmo tempo na mesma seção dentro dessa miofibers.É possível com corantes vitais. A coloração de H&E é um método empírico que não é adaptável para conjugação confiável e reprodutível. A coloração da absorção de IGG, no entanto, é específica para células musculares necróticas e aplicável às biópsias humanas.Esta técnica pode fornecer insights sobre todos os distúrbios neuromusculares caracterizados pela micose. Depois de remover o cabelo da perna de interesse coloque o animal mdx macho de quatro semanas na posição supina e fixar as patas em uma tábua de rolha. Usando tesouras de precisão ou fórceps, remova a pele da perna do pé para o joelho para expor toda a extensão da tíbia e tibialis anterior.Use a tesoura para fazer uma incisão entre a tíbia e a tibialis anterior. Use fórceps para remover cuidadosamente a camada de epimísio da superfície do músculo. No t

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Biologia

Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão...

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Os principais tipos de células aderentes derivadas do músculo humano são células miogênicas e fibroblastos. Aqui, as populações de células são enriquecidas usando classificação de células ativadas por magnetismo com base no antígeno CD56. A imunomarcação subsequente com anticorpos específicos e o uso de técnicas de análise de imagem permitem a quantificação das características citoplasmáticas e nucleares em células individuais.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Aqui, apresentam-se um protocolo para a fibra muscular rápida análises, o que permite melhor qualidade de coloração, e assim aquisição automática e quantificação de populações de fibras utilizando o software ImageJ livremente disponíveis.

Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica

Nós descrevemos uma nova técnica experimental que chamamos minimamente invasiva músculo incorporação (MIME), que se baseia a evidência de que o tecido muscular esquelético contém células miogênico viáveis que podem facilitar o doador-mediada por células myogenesis quando implantado em um músculo do hospedeiro.

Minimamente invasivo músculo incorporação (MIME) - uma nova técnica Experimental para facilitar Myogenesis doador-mediada por células

A autofagia ativa está associada à regeneração muscular produtiva, que é essencial para a ativação da célula tronco (MuSC). Aqui, fornecemos um protocolo para a detecção in situ de LC3, um marcador de autofagia em MuSCs MyoD-positivos de seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos.

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Coloração imuno-histoquímica de isoformas de cadeia pesada de miosina emergiu como o discriminador de estado-da-arte do tipo de fibra muscular esquelético (ou seja, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aqui, apresentamos um protocolo de coloração juntamente com um algoritmo semi-automático de romance que facilita a rápida avaliação da morfologia do tipo de fibra e fibra.

Semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

Evidências crescentes indicam que a infiltração excessiva de lipídios dentro do músculo esquelético resulta em lipotoxicidade e diabetes. Aqui, apresentamos um protocolo completo, incluindo processamento de tecidos, coloração com Bodipy, aquisição de imagens e análise, para quantificar o tamanho, densidade e distribuição subcelular de gotículas lipídicas de forma específica do tipo fibra.

Tipo de fibra e análise subcelular-específica do conteúdo de gotícula lipídica no músculo esquelético

Esse protocolo descreve o isolamento de fibras musculares únicas intactas do sóleo oxidativo e o estabelecimento de culturas de mioblast altamente purificadas derivadas dessas fibras. O procedimento otimizado gera de forma confiável aproximadamente 300–500 miofibras intactas por camundongo, permitindo análises moleculares e celulares posteriores.

Ensaio de Isolamento de Fibra Única para Avaliação do Comportamento da Miofibra Oxidativa

Prática de PAAF (PAAF) por estagiários é relativamente difícil, devido à falta de uma lesão facilmente disponível, apropriado. Preparação de uma lesão phantom AV para a prática do procedimento de PAAF e proficiência masterização é relativamente fácil.

Preparação e Utilização de lesões Fantasma à Prática biópsias aspirativa por agulha fina

Aprenda a técnica de imunolabellagem de miofibras necróticas em biópsias musculares usando camundongos mdx. Este método utiliza captura de IgG para identificar células necroticas e avaliar degeneração muscular em distúrbios neuromusculares.

Imunolabellagem de degeneração da miofibra em biópsias musculares

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