Name: Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Aprenda a gerar RNAs circulares usando elementos Alu em minigenes reporter. Este protocolo permite analisar função e associação com doenças por meio de splicing alternativo e RT-PCR otimizado.

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Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Defesa DoD conceder AZ180075. Stefan Stamm agradece jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin foi apoiada pelo DAAD, programa alemão de intercâmbio acadêmico, Justin R. Welden recebeu o Prêmio Da Universidade de Kentucky Max Steckler.

1. Projeto das construções
<ol><li>Use o navegador de genoma UCSC24 para identificar elementos repetitivos necessários para a formação de RNA circular e incorporá-los nos construtos. É importante ressaltar que os primers para amplificação precisam estar fora dos elementos repetitivos.</li>
	<li>Cole a seqüência circular de RNA(Figura Suplementar 1 é uma seqüência de teste) em <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start" target="_blank">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start</a> e selecione o organismo certo. Envie a seqüência e vá para a visualização do navegador, diminua o zoom de 1,5x ou conforme apropriado(Figura 2A). NOTA: A seqüência de pesquisa aparece na linha superior(Figura 2A, 1). Dependendo da ordem dos éons no RNA circular, blat não ligará todos os éons. Neste exemplo, o exon 12 (Figura 2A, 4) não está ligado ao 11(Figura 2A, 2, 3),porque o exon 12 é a montante do exon 11 na seqüência circular de RNA(Figura Suplementar 1). Os elementos repetitivos estão na faixa 'repetir masker', indicada por caixas, onde a cor preta a cinza indica a conservação evolutiva(Figura 2A, 5).</li>
	<li>Passe sobre os elementos repetitivos para identificar seu subtipo em uma janela flutuante. Os elementos alu estão na linha SINE (elemento nuclear intercalado curto). Use o botão 'faixas padrão' a janela para redefinir o navegador se uma imagem diferente da Figura 2 for obtida. NOTA: A mousing sobre os éons no visor genético gera uma janela com números de exon que são gerados por computador. Esses números não correspondem à numeração de íons estabelecida na literatura e também mudam entre isoformas.</li>
</ol>2. Selecione a seqüência a ser clonada em um vetor de expressão
<ol><li>Baixe a seqüência de DNA mostrada na janela indo para Ver → DNA na linha superior do navegador de genoma UCSC. Na opção de formatação de seqüenciamento,selecione Opções de maiúsculas e cores estendidas.</li>
	<li>Selecione o caso padrão como Inferior e selecione o estojo alternar para NCBI refseq. Selecione sublinhado e negrito e itálico para Repeat Masker. Clique em Enviar. Haverá éons como letras maiúsculas e introns como letras pequenas. Verifique as fronteiras exon/intron.</li>
	<li>Neste exemplo há uma seqüência 'ccctttacCTTTTt', indicando que o navegador mostra o complemento reverso. Se este for o caso, volte e selecione a caixa de complemento reverso até ver as bordas intron corretas (agEXONgt), neste exemplo AAAAAAGgtaaggg.</li>
	<li>Copie o arquivo com a orientação correta (os éons internos são cercados por ag intronic... gt) em um documento de processamento de texto e destacar os éons(Figura Suplementar 2). NOTA: Neste exemplo, o fragmento genômico que abrange os exons 9-12 é em torno de 24 kb e, portanto, muito grande para ser amplificado a partir do DNA genômico. Portanto, cada íon cercado por cerca de 1 kb de região intrônica é amplificado individualmente e esses quatro fragmentos são montados em um vetor de clonagem.</li>
	<li>Selecione fragmentos a serem amplificados (exon ± 500 nt intron). Certifique-se de que o intron não comece ou termine em uma região repetitiva, pois os primers nessas regiões não amplificarão seqüências específicas. As regiões selecionadas são mostradas na Figura 2B, e suas seqüências são mostradas na Figura Suplementar 3. NOTA: Em geral, quanto maiores as construções, mais difícil será a clonagem. Os fragmentos podem ser montados em sentido de passo (ou seja, exon 9 é combinado com o vetor e no próximo passo exon 10 é introduzido nesta construção através da clonagem até que todos os éons estejam no lugar), ou, alternativamente, todos os fragmentos são montados simultaneamente. Uma abordagem stepwise sempre funciona, mas requer mais tempo. Uma montagem simultânea nem sempre funciona e depende de quão bem os fragmentos individuais podem ser amplificados a partir do DNA genômico e do tamanho geral da construção. Portanto, geralmente começamos com ambas as abordagens simultaneamente.</li>
</ol>3. Projete primers para clonagem
<ol><li>Use uma ferramenta web<a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">(https://nebuilder.neb.com/#!/)</a>para projetar os primers para clonagem. Por exemplo, digite os fragmentos 9, 10, 11 e 12 e a seqüência vetorial(Figura Suplementar 3)para esta ferramenta.</li>
	<li>Para a seqüência vetorial, adicione o local de inserção como o último nucleotídeo e, posteriormente, adicione os fragmentos. Uma vez que a numeração vetorial não começa com um determinado local de inserção, o local de inserção no vetor está localizado e a parte a jusante é colocada na frente da seqüência upstream. Neste exemplo, as inserções começam diretamente após o site HindIII [AAGCTT] e terminam logo após o site PmeI [GTTTAAAC] do pcDNA3.1. A seqüência de cccgctgatcag ... ccgtaaaaaaggccgc é colado na frente da posição 1 na seqüência pcDNA3.1 (gttgctggcgttttttcc ...).</li>
	<li>Ajuste os primers se seus pontos de fusão estiverem com mais de 4 °C de distância, pois eles não funcionarão na amplificação. A montagem dos fragmentos e das seqüências de primer projetadas são mostradas na Figura Suplementar 4. Os primers para clonagem também podem ser projetados manualmente25.</li>
</ol>4. Detecção de PCR e amplicon
<ol><li>Reação PCR padrão: Faça uma mistura de reação para o volume total de 50 μL por reação. Abaixo está a receita para uma reação usando polimerase 1: 10 μL de buffer de reação de 5x 1 μL de 10 mM dNTPs 2,5 μL de 10 μM Primer avançado 2,5 μL de 10 μM Primer reverso 0,5 μL de Polimerase 1 32,5 μL de Nuclease grátis H2O<ol>
<li>Opcionalmente, adicione 10 μL de 5x GC Enhancer se o produto tiver alto teor de GC; fazer uma mistura separada contendo GC Enhancer para testar a reação do PCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alíquota 49 μL da mistura em tubos PCR por amostra de reação.</li>
	<li>Adicione 1 μL de DNA ao PCR, a quantidade varia de 10 pg a 1 ng.</li>
	<li>Gire as amostras para remover o resíduo dos lados e coloque-as em uma máquina de PCR. Use a mesma máquina, bem como os mesmos pontos na máquina ao otimizar as condições do PCR.</li>
</ol>5. Otimização para fragmentos de DNA mais longos para uso de diferentes polimerases
<ol><li>Temperatura<ol>
<li>Otimize a Polimerase de longo alcance 2.<ol>
<li>Use uma temperatura de desnaturação mais baixa (Polimerase 1: 98 °C, Polimerase 2: 94 °C).</li>
			<li>Use um tempo de desnaturação mais longo (Polymerase 1: 10 s, Polymerase 2: 30 s).</li>
			<li>Use um tempo de recozimento mais longo (Polymerase 1: 30 s, Polymerase 2: 60 s).</li>
			<li>Use um tempo de extensão mais longo (Polymerase 1: 30 s/kb, Polymerase 2: 50 s/kb).</li>
			<li>Use uma temperatura de extensão mais baixa (Polimerase 1: 72 °C, Polimerase 2: 65 °C).</li>
			<li>Use uma temperatura de recozimento 5 °C abaixo do Tm dos primers.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Otimize as concentrações de primer (5x menos a 5x mais do que a concentração original do primer). Otimizar as concentrações de DNA de 10 pg a 50 pg, 100 pg, 1 ng, 5 ng, 10 ng.</li>
		<li>Como exemplo de um programa PCR para amplificar um tamanho de produto de 15 kb usando Polimerase 2, realizar uma desnaturação inicial a 94 °C para 30 s, desnaturação do DNA a 94 °C para 30 s seguido de recozimento a 58 °C para 30 s, e extensão de DNA a 65 °C para 12 min 30 s. Realize uma extensão final a 65 °C por 10 min com uma espera final de 4 °C. NOTA: A temperatura de recozimento (Ta) específica para os primers determinados por cálculos de temperatura baseados na web que são específicos para cada polimerase. Os tempos de extensão podem variar e precisam ser otimizados se os fragmentos forem maiores que 10 kb.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tempos de extensão e concentrações de DNA<ol>
<li>Use tempos de extensão mais longos para fragmentos de DNA acima de 6 kb: 1 min por 1 kb. Fragmentos mais longos devem usar menos DNA.</li>
		<li>Realizar diluições de DNA para encontrar a concentração ideal de DNA para amplificação, geralmente de 1 pg a 1 ng para plasmídeos ou 1 ng a 1 μg para DNA genômico. NOTA: Para a maioria dos usos de clonagem 1, projetada pela fusão do domínio de ligação de DNA Sso7d a um DNA termoestável proprietário polimerase26. A polimerase tem uma baixa taxa de erro e devido ao domínio Sso7d uma alta processividade, necessária para amplificar grandes (10-15 kb) fragmentos genômicos. Devido a este grande tamanho de fragmento, a montagem enzimática das moléculas de DNA27 é usada para inserção em vetores, pois este método não requer enzimas de restrição. A amplificação de fragmentos com mais de 15 kb fica cada vez mais difícil com a polimerase 1. Para amplificação de fragmentos de grande porte use polimerase 2 feita de polimerase de revisão semelhante a pirocóccusfundida a Sso7d ou ao kit PCR de longo alcance que dá, no entanto, taxas de erro mais altas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Purificação de produtos PCR para clonagem
<ol><li>Executar metade dos produtos PCR em géis de agarose de 1% contendo uma mancha de ácido nucleico intercalado (por exemplo, 1x GelGreen). Visualize os géis manchados em um transiluminador de leitores escuros. Este DNA manchado não é fiel ao tamanho. NOTA: GelGreen intercatos no DNA, semelhante ao brometo de etídio, mas é animado pela luz em torno de 500 nm (ciano), um comprimento de onda que não danifica o DNA, o que melhora muito a clonagem.</li>
	<li>Paralelamente, execute metade dos produtos PCR em um gel de 1% que está manchado após a execução com brometo de etídio(Figura 3A,B).</li>
	<li>Excise bandas do tamanho certo do gel manchado (etapa 6.1) e isolar dna usando um gel e kit de limpeza PCR. Em desvio de seu protocolo padrão, eluir o DNA em apenas 20 μL de água destilada dupla, como geralmente as concentrações de DNA são baixas.</li>
	<li>Antes da clonagem, verifique o DNA isolado em um gel de agarose para concentração e integridade (Figura 3B). Aponte para uma inserção molar 2:1 para a razão vetorial. Ao utilizar várias pastilhas, a razão é 2:2:2:1.</li>
</ol>7. Montagem de DNA e detecção de clones
NOTA: A clonagem é feita utilizando um kit de montagem de DNA enzimático, com pequenas modificações. O conjunto é realizado por 60 min a 50 °C e geralmente a faixa inferior de DNA é usada para montagem (20-100 fmol/20 μL reação). Toda a mistura de reação é adicionada a células químicas competentes e as células inteiras banhadas em uma placa de ágar de 6 cm.
<ol><li>Combine o vetor e insira em uma razão molar de 1:2 (20-500 fmol cada) em 10 μL de água.</li>
	<li>Adicione 10 μL de Mistura Mestre de Montagem de DNA.</li>
	<li>Incubar amostras por 60 minutos a 50 °C.</li>
	<li>Em seguida, transforme células competentes com a reação total de montagem. Aqui, use estirpe e etenta e 1 células para construções mais curtas ou estirpe e estirpe de E. coli 2 células para construções mais longas ou instáveis. As células devem estar em um volume de 50 μL.</li>
	<li>Descongele as células no gelo e adicione 2 μL do produto refrigerado montado às células competentes. Misture apertando suavemente o tubo 4-5 vezes. Não vórtice.</li>
	<li>Deixe a mistura no gelo por 30 min.</li>
	<li>Choque térmico a 42 °C para 30 s. Não misture.</li>
	<li>Transfira o tubo de volta para o gelo por 2 min.</li>
	<li>Adicione 950 μL de mídia SOC de temperatura ambiente ao tubo.</li>
	<li>Incubar o tubo de reação a 37 °C por 60 min. Agite vigorosamente (300 rpm).</li>
	<li>Placas de seleção quentes com o antibiótico apropriado durante a incubação a 37 °C.</li>
	<li>Pelotas as células através da centrifugação (10.000 x g, 30 s) e placa fora 1/4 e 3/4 de células em duas placas de seleção e incubar a 37 °C durante a noite.</li>
</ol>8. Validação de clones
<ol><li>Use pcr colônia, empregando primers PCR abrangendo os locais de montagem (Figura 1C) para detecção.</li>
	<li>Pegue um palito estéril e toque em uma única colônia bacteriana.</li>
	<li>Toque na parte inferior de um tubo PCR com o palito que tem a colônia e, em seguida, estique o palito em uma placa de ágar antibiótico, incubar a placa linada a 37 °C ou temperatura ambiente para construções sensíveis durante a noite.</li>
	<li>Sobreponha o tubo PCR tocado com a colônia com uma mistura de PCR contendo os primers de detecção. Estes são projetados usando primer 3<a href="http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/" target="_blank">(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</a>). O programa tem a opção de forçar o design do primer através de uma seqüência definida usando os sinais "[ccc]" para selecionar primers através da junção de montagem. O DNA de cepas positivas é isolado e verificado pelo sequenciamento.</li>
</ol>9. Análise do RNA circular expressando genes de repórteres
<ol><li>Para análise, transfect genes repórter em células eucarióticas. Aqui, use células HEK293 (ATTC #CRL-1573) pois elas dão alta eficiência de transfecção. Para economizar custos, use soluções PEI (polietilenoimina).</li>
	<li>Para a solução PEI, dissolva o cloridrato de polietilenoimina linear (PEI) a 1 mg/mL em água a um pH baixo, pH 2. Leve o pH para 7 com NaOH. Filtro estéril com filtros de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.</li>
	<li>Divida as células em seis poços (aproximadamente 150.000 células por poço) e deixe-as crescer durante a noite em 10% de FBS em mídia DMEM.</li>
	<li>Aliquot 1 μg do gene do repórter em um tubo estéril e adicione 200 μL de NaCl estéril filtrado de 150 mM. Misture com o DNA por vórtice.</li>
	<li>Adicione a solução PEI a esta mistura e vórtice, centrífuga brevemente para coletar amostras na parte inferior do tubo. Use uma razão de 1 μg de DNA por 3 μL de PEI.</li>
	<li>Incubar em temperatura ambiente por 10 min e, em seguida, adicionar diretamente às células HEK 293.</li>
	<li>Incubar células HEK293 a 37 °C, 5% CO2, durante a noite.</li>
	<li>Isole o RNA para RT-PCR através de um kit de isolamento de RNA.</li>
</ol>10. Tratamento RNase R para remover RNAs lineares
<ol><li>Use 10 μg de RNA total em um tubo livre de RNase.</li>
	<li>Adicione 10 μL de tampão RNase R 10x (0,2 M Tris-HCl (pH 8.0), 1 M KCl, 1 mM MgCl2) ao RNA.</li>
	<li>Adicionar RNase R ao RNA (1 μl = 20U).</li>
	<li>Adicione 1 μL de azul glicol ao RNA e leve o volume até 100 μL com água estéril.</li>
	<li>Incubar amostras a 37 °C por 30 min.</li>
	<li>Adicione 100 μL de fenol/clorofórmio e vórtice por 1 min.</li>
	<li>Centrífuga a 21.000 x g por 1 min para separar fases.</li>
	<li>Pegue o sobrenadante (fase aquosa) e adicione 1 volume (cerca de 80 μL de clorofórmio).</li>
	<li>Vórtice por 1 min, e depois centrífuga por 1 min para fases separadas.</li>
	<li>Tome sobrenadante, adicione 1:10 vol KAc e 2,5 vol etanol, e precipite a -20 °C por 1-4 h. Centrifugagem a 4 °C por 30 min a velocidade máxima (21.000 x g). Haverá uma pequena pelota azul na parte inferior.</li>
	<li>Retire o sobrenadante e lave com 80% de etanol. Deixe o ar secar por 5 min em temperatura ambiente e dissolva em água de 10 μL.</li>
</ol>11. Análise RT-PCR
<ol><li>Use 1 μg de RNA por reação RT.</li>
	<li>Faça uma mistura de reação para um volume total final de 20 μL por reação. Para uma reação, use 1 μL de 10 mM dNTPs, 1 μL de 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 4 μL de 5x First-Strand Buffer e 0,5 μL de Transcriptase Reversa.</li>
	<li>Alíquota 6,5 μL de mistura de reação em novos tubos PCR.</li>
	<li>Misture até 5 primers em uma mistura. No entanto, alguns primers podem fazer um par inversacom outros primers no PCR (Figura 5). As seqüências do primer estão na Tabela 2. Nós rotineiramente usamos primers de junção de exon-junção específicos de genes, mas priming com hexamers aleatórios também é possível.</li>
	<li>Adicione 1 μL de 10 μM Primer reverso ao tubo de reação RT desejado.</li>
	<li>Adicione 1 μg de RNA ao tubo de reação PCR.</li>
	<li>Adicione H2O sem RNase até um volume total de 20 μL.</li>
	<li>Gire os tubos para baixo para remover o resíduo no lado dos tubos e coloque no termociclador.</li>
	<li>Execute a reação RT no termociclador a 50 °C por 50 minutos.</li>
	<li>Armazene o cDNA RT a -20 °C ou proceda para a reação pcr.</li>
</ol>

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<li>Yang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+GFP-Based+Reporter+to+Study+Back+Splicing+and+Translation+of+Circular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+profiling+reveals+an+abundant+circHIPK3+that+regulates+cell+growth+by+sponging+multiple+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11215(2016).</li>
<li>Jia, W., Xu, B., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+expression+profiles+of+mouse+ovaries+during+postnatal+development+and+the+function+of+circular+RNA+epidermal+growth+factor+receptor+in+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells.</a> Metabolism. 85, 192-204 (2018).</li>
<li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Output+of+Protein-Coding+Genes+Shifts+to+Circular+RNAs+When+the+Pre-mRNA+Processing+Machinery+Is+Limiting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting.</a> Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).</li>
<li>Legnini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circ-ZNF609+Is+a+Circular+RNA+that+Can+Be+Translated+and+Functions+in+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis.</a> Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+circRNA+Biogenesis+and+Function+with+NF90%2FNF110+in+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection.</a> Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biogenesis+of+Nascent+Circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Biogenesis of Nascent Circular RNAs.</a> Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).</li>
</ol>

Nada para revelar.

Em geral, as RNAs circulares são baixas abundantes1, o que complica o estudo de sua função e formação. Semelhante às RNAs lineares13, o uso de minigenes repórter permite a identificação de fatores cis e trans-atuação que regulam a formação de RNAs circulares. Assim, essa abordagem gera hipóteses que podem ser ainda mais testadas usando os genes endógenos.
O passo mais crítico é o design do gene do repórter. A montagem enzimática de fragmentos de ...

RNAs Circulares As RNAs circulares (circRNAs) são RNAs univalentemente fechadas que são expressas na maioria dos organismos. Eles são gerados juntando um site de emenda downstream 5' a um site de emendas upstream 3', um processo chamado back-splicing(Figura 1A)1. Seqüências no pré-mRNA que exibem base complementar tão curta quanto 30-40 nt trazem locais de back-splice em alinhamento adequado para formação de cirrna2. Em humanos, os elementos Alu 1, representando cerca de 11% do genoma3, formam extensas estruturas de RNA duplamente encalhadas em pré-mRNA devido à sua auto-complementaridade4,5 e, assim, promovem a formação de cirrnas1.
Atualmente, três principais funções de cirrnas foram descritas. Algumas circRNAs ligam microRNAs (miRNAs) e através de atos de sequestro como esponjas miRNA6. CircRNAs foram implicadas na regulação transcricional e pós-transcricional, por meio de competição com emenda linear7 ou modulação da atividade do fator de transcrição8. Por fim, as cirrnas contêm quadros curtos de leitura abertas e a prova de estudos de princípio mostram que podem ser traduzidos9,10. No entanto, a função da maioria das cirrnas permanece enigmática. A maioria das RNAs circulares foram detectadas usando métodos de seqüenciamento de última geração11. Análises detalhadas de genes individuais usando abordagens RT-PCR direcionadas revelam que um grande número de RNAs circulares continua a ser descoberto12.
Uso de genes de repórteres para analisar o processamento pré-mRNA A análise do mRNA derivado do DNA que o repórter constrói transfeccionado em células é um método bem estabelecido para estudar emendas alternativas pré-mRNA, que podem ser aplicadas a RNAs circulares. Em geral, o éon alternativo, seus íntrons circundantes e exons constitutivos são amplificados e clonados em um vetor de expressão eucariótica. Freqüentemente, os íntrons são encurtados. Os construtos são transfeccionados em células eucarióticas e geralmente analisados por RT-PCR13,14. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada para mapear sites de emendas regulatórias e fatores transadores em experimentos de cofecção13,15,16,17,18. Além disso, a geração de minigenes que expressam proteínas permitiu a triagem de substâncias que alteram emendas alternativas19,20.
O método foi aplicado a RNAs circulares. Atualmente, pelo menos 12 backbones minigenes foram descritos na literatura e estão resumidos na Tabela 1. Com exceção do sistema de expressão baseado em tRNA21,22, todos eles são dependentes de promotores de polimerase II. Aqui, descrevemos um método para gerar minigenes de repórteres humanos para determinar fatores cis e transativos envolvidos na geração de RNAs circulares. Uma visão geral do método usando seqüências de um gene de repórter publicado23 é mostrada na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>(PEI) Policiências de cloridrato</td><td></td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de construção</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator.</td><td></td> Kit de montagem de DNA enzimático Clare Chemical Research <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td></td></tr> Kit de limpeza de gel <tr><td>e PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Glyco Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 local de clonagem</td><td>Polycloning</td><td></td><td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf" target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td></tr><tr><td>Polimerase 1</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Q5 DNA polimerase</td></tr><tr><td>2</td><td>Biorad</td><td>1725310</td><td>Polimerase de longo alcance (NEB), iproof (BioRad)</td></tr><tr><td>Polimerase 2</td><td>Qiagen</td><td>206402</td><td>Kit de polimerase de longo alcance Qiagen</td></tr> Kit de isolamento de RNA de <tr><td></td><td>18080044</td><td></td><td>Thermo Fisher</td></tr> Life <tr><td></td><td>Technologies</td><td>12183025</td><td>Ambion da Life Technologies</td></tr><tr><td>RNAse R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td>Epicentro/Lucigen</td></tr><tr><td>Células estáveis competentes</td><td>NEB</td><td>C3040H</td><td>Células estáveis Bactérias</td></tr><tr><td>clonadoras padrão</td><td>NEB</td><td>C2988J</td><td>NEB5-alpha competente</td></tr><tr><td>Ferramenta Web para a conceção de primários</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>Cálculos de temperatura baseados na Web</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td></tr></tbody></table>

uso do elemento alu contendo minigenes para analisar rnas circulares

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Além de mRNAs lineares, muitos genes eucaticos geram RNAs circulares. A maioria das RNAs circulares são geradas juntando-se a um site de emenda de 5' com um site de emenda upstream 3' dentro de um pré-mRNA, um processo chamado back-splicing. Essa circularização é provavelmente auxiliada por estruturas secundárias no pré-mRNA que aproximam os locais de junção. Nos genes humanos, os elementos alu são pensados para promover essas estruturas secundárias de RNA, pois os elementos alu são abundantes e exibem complementaridades de base uns com os outros quando presentes em direções opostas no pré-mRNA. Aqui, descrevemos a geração e análise de grandes elementos Alu contendo genes de repórteres que formam RNAs circulares. Através da otimização dos protocolos de clonagem, genes de repórter com comprimento de inserção de até 20 kb podem ser gerados. Sua análise em experimentos de cofecção permite a identificação de fatores regulatórios. Assim, este método pode identificar seqüências de RNA e componentes celulares envolvidos na formação de RNA circular.

Os genes dos repórteres permitem determinar fatores regulatórios que influenciam a formação circular de RNA. No entanto, esses genes de repórteres são grandes e contêm elementos repetitivos que muitas vezes tornam construções de DNA instáveis. Devido ao seu grande tamanho, muitas vezes é necessário excluir partes dos íntrons, o que é conseguido amplificando peças genômicas contendo os éons e partes menores de flanqueamento intrônico. Essas peças de DNA são montadas enzimáticamente, permitindo a construção sem enzimas de ...

Clonamos e analisamos genes de repórteres gerando RNAs circulares. Esses genes de repórter são maiores do que construções para analisar emendas lineares e conter elementos Alu. Para investigar os RNAs circulares, os construtos são transfeccionados em células e o RNA resultante é analisado usando RT-PCR após a remoção do RNA linear.

Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Este protocolo é significativo porque permite ao usuário gerar um sistema de expressão genômica que pode sofrer emendas alternativas e, neste caso, formar RNAs circulares que podem ser testadas para sua função e associação de doenças. A principal vantagem dessa técnica é que ela abrirá caminho para que outros usem esse protocolo em biologia molecular e clonagem ao estudar emendas alternativas na formação e função circular de RNA. Meu conselho para alguém que experimente essa técnica pela primeira vez seria otimizar as condições do PCR.Execute gradientes ou realize o PCR de touchdown com diferentes temperaturas de ressarcimento e tempos de extensão. Normalmente fragmentos mais longos ao longo de seis KB estenderão um KB por ciclo e diferentes temperaturas de ressarcial precisarão ser testadas para a melhor amplificação. A demonstração desse método é fundamental porque dará aos usuários uma melhor representação visual dos aspectos mais difíceis do procedimento, especialmente a geração de primers.Para iniciar este procedimento, carregue o Navegador de Genomas ucsc e use-o para identificar elementos repetitivos necessários para a formação circular de RNA e incorporá-los nos construtos.

use-of-alu-element-containing-minigenes-to-analyze-circular-rnas

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Linear-amplificação mediada (LAM)-PCR é um método desenvolvido para identificar as posições exactas dos vectores de integração no genoma viral. A técnica evoluiu para ser o método superior para estudar a dinâmica clonais em pacientes de terapia genética, biossegurança de tecnologias inovadoras de vetores, a diversidade de células T, modelos de células-tronco do câncer, etc...

Linear Amplificação Mediada por PCR - Localização de elementos genéticos e Caracterização de Unknown Flanquear DNA

Este vídeo mostra as etapas básicas para realizar a análise de transcriptoma completo em amostras de medula espinhal embrionária de pintinho dissecado após a transfecção com eletroporação in ovo.

RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

Este artigo apresenta um método sensível chamado Circle-Seq para purificar o DNA circular extracromossômico (eccDNA). O método abrange purificação de coluna, remoção de DNA cromossômico linear restante, amplificação de círculo rolante e sequenciamento de alto rendimento. O Circle-Seq é aplicável à triagem em escala genômica de eccDNA eucariótico e ao estudo da instabilidade do genoma e da variação do número de cópias.

A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas

A amplificação rápida dois diferentes 3' extremidades do cDNA (3' corrida) protocolos descrito aqui fazem uso de dois diferentes polimerases de DNA para mapear sequências que incluem um segmento de quadro de leitura aberta (ORF), o códon de parada e o inteiro 3' UTR de uma transcrição de usando o RNA obtidos de linhagens celulares de cancro diferentes.

Adaptação 3' rápida amplificação do CDNA termina para mapear transcritos em câncer

Sequenciamento de próxima geração (NGS) é uma poderosa ferramenta para a caracterização do genoma que é limitada pela taxa de erro elevada da plataforma (~0.5–2.0%). Descrevemos os nossos métodos de sequenciamento de correção de erro que permitam obviar a taxa de erro NGS e detectar mutações em fracções de alelo variante tão raras como 0,0001.

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

A identificação das interações físicas entre genes e dos elementos reguladores é um desafio, mas tem sido facilitada pelos métodos de captura de conformação de cromossomo. Esta modificação no protocolo de 4C-seq atenua o viés PCR, minimizando a amplificação excessiva de modelos PCR e maximiza o mappability de leituras, incorporando um passo de digerir adição da enzima de restrição.

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

RNAs circulares (circRNAs) são RNAs não codificadores que podem ter papéis na regulação transcricional e mediar interações entre proteínas. Após a avaliação de diferentes parâmetros para a construção de bibliotecas de sequenciamento circRNA, um protocolo foi compilado utilizando a preparação total da biblioteca de RNA com o pré-tratamento RNase R e é apresentado aqui.

Identificação de RNAs circulares usando sequenciamento de RNA

Este protocolo apresenta uma ferramenta rápida e útil para avaliar o papel de uma proteína com função não caracterizada na regulação alternativa de emenda após o tratamento quimioterápico.

Usando a ferramenta E1A Minigene para estudar alterações de emenda mRNA

O sequenciamento de RNA de quantificação absoluta (AQRNA-seq) é uma tecnologia desenvolvida para quantificar a paisagem de todos os pequenos RNAs em misturas biológicas. Aqui, as etapas de preparação da biblioteca e processamento de dados do AQRNA-seq são demonstradas, quantificando as mudanças no pool de RNA de transferência (tRNA) em Mycobacterium bovis BCG durante a dormência induzida por fome.

AQRNA-seq para quantificar RNAs pequenos

As nanomáquinas baseadas em DNAzyme podem ser usadas para detecção altamente seletiva e sensível de ácidos nucléicos. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o projeto de nanomáquinas baseadas em DNAzyme com um núcleo 10-23 usando software livre e sua aplicação na detecção de um fragmento de vírus Epstein-Barr como exemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos

Aprenda a gerar RNAs circulares usando elementos Alu em minigenes reporter. Este protocolo permite analisar função e associação com doenças por meio de splicing alternativo e RT-PCR otimizado.

Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares

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