Name: Rotulagem de vasos sanguíneos no cérebro Teleost e pituitária usando a perfusão cardíaca com um DiI-fixative (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprenda a rotular vasos sanguíneos no cérebro e pituitária de peixes teleósteos usando perfusão cardíaca com DiI em fixador. Esta técnica simples e eficiente utiliza Oryzias latipes como modelo.

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Agradecemos ao Dr. Shinji Kanda pela demonstração de perfusão cardíaca com solução fixativa em Medaka, Sra. Lourdes Carreon G Tan, para obter ajuda com a criação de Medaka, e o Sr. Anthony Peltier para ilustrações. Este trabalho foi financiado pela NMBU e pelo Conselho de pesquisa da Noruega, concedem o número 248828 (programa de vida digital da Noruega).

Toda a manipulação animal foi executada de acordo com as recomendações para o cuidado e o bem-estar de animais da pesquisa na Universidade Norueguesa de Ciências da vida, e a supervisão de investigadores autorizados.
1. preparação de instrumentos e soluções
<ol><li>Prepare a solução de ações DiI dissolvendo 5 mg de cristal DiI em tubo plástico de 1,5 mL com 1 mL de 96% de EtOH. Vortex para 30 s e sustento coberto usando a folha de alumínio. Nota: A solução conservada em estoque de DiI pode ser conservada no escuro em-20 ° c por diversos meses.</li>
	<li>Prepare o suporte de peixe (Figura 1a) cortando um pedaço de poliestireno a 5 cm de comprimento, 3 cm de largura e 2 cm de espessura, e colando-o a um prato de plástico de 9 cm de diâmetro. Faça um furo em forma de barco de 3 cm com uma lâmina de bisturi no poliestireno.</li>
	<li>Prepare o sistema de perfusing (Figura 2) adicionando uma cânula plástica longa de 30-50 cm na extremidade da agulha.</li>
	<li>Prepare 40 mL de solução fresca de paraformaldeído a 4% (PFA) diluindo 10 mL de PFA 16% com 30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um tubo de plástico de 50 mL.</li>
	<li>Prepare 10 mL da solução fixative/DiI diluindo 1 mL da solução de ações DiI em 9 mL de PFA preparada na hora 4% em um tubo de plástico de 10 mL. Mantenha no escuro até o uso. Nota: Os cristais DiI que não são dissolvidos podem ser mantidos no tubo de solução de ações, e o novo etanol pode ser adicionado para preparar a nova solução de ações DiI (ver etapa 1,1).</li>
	<li>
Prepare 50 mL de tricaína (MS-222) estoque.
	<ol>
<li>Dissolver 200 mg de tricaína em pó em 48 mL de H2O. adicionar 2 ml de 1 M de base tris (pH 9). Ajuste a pH 7 com 1 M HCl e armazene a-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluir 5 mL de stock de tricaína em 50 mL de água limpa num copo pequeno.</li>
	<li>Prepare várias pipetas de vidro de 5 cm (Figura 2) esticando um capilar de vidro com um extrator de pipeta seguindo as instruções do fabricante.</li>
</ol>2. dissecção e perfusão
Nota: PFA é um composto tóxico volátil, portanto, a dissecção e perfusão deve ser realizada em uma capa ou em um quarto ventilado, e o usuário deve estar usando uma máscara de gás.
<ol><li>Prepare as ferramentas de dissecção, incluindo pequenas tesouras, e uma pinça afiada e uma forte antes da dissecção.</li>
	<li>Encha a seringa com a solução preparada de PFA/DiI colocando-a no tubo de 50 mL e elaborando-a. Em seguida, coloque a agulha com a cânula na extremidade da seringa (Figura 2).</li>
	<li>Fixar a seringa no banco utilizando vários pedaços de fita colocada em diferentes direções, ajustar a posição do microscópio e o assento para obter uma boa posição para dissecção e para pressionar o pistão da seringa (Figura 1B). Nota: Neste protocolo, o cotovelo é usado para pressionar o pistão da seringa, mas outras opções de possibilidades podem ser usadas, por exemplo, assistência de outra pessoa.</li>
	<li>Eutanizar o peixe com uma overdose de tricaína, colocando o peixe na solução preparada na etapa 1,7. Aguarde 30 s e teste os reflexos do peixe agarrando a sua barbatana caudal com o fórceps. O peixe pode ser usado quando ele parou de responder aos estímulos.</li>
	<li>Coloque o peixe no suporte de peixe com o seu abdômen virado para cima e fixar uma agulha na extremidade da cabeça e outro acima da cauda para manter o peixe no lugar.</li>
	<li>Abra o abdômen anterior com a tesoura cortando horizontalmente a camada superficial da pele.</li>
	<li>Usando fórceps, retire a pele acima do coração até que um acesso claro ao ventrículo e ao arteriosus do bulbus seja fornecido (Figura 3).</li>
	<li>Adicione uma pipeta de vidro na extremidade do capilar e quebre a extremidade da ponta da pipeta de vidro. Nota: O furo da ponta quebrada deve ser grande bastante deixar o líquido para fora, mas ainda pequeno bastante para incorporar facilmente o tecido. A pipeta de vidro pode ser reutilizada se não quebrado ou entupido.</li>
	<li>Traga a pipeta de vidro perto do ventrículo e adicione a pressão ao pistão da seringa com o cotovelo para forçar para fora o líquido.</li>
	<li>Fixe o ventrículo cardíaco com a pipeta de vidro enquanto adiciona pressão à seringa.</li>
	<li>Diretamente depois, perfurar o seio venoso com fórceps para permitir que o sangue deixe a circulação. Nota: O ventrículo cardíaco torna-se mais frágil por causa do fixador. Ele também se torna menos vermelho como o sangue é diluído com a solução fixative/DiI.</li>
	<li>Do ventrículo, ajuste o ângulo da pipeta de vidro para encontrar a entrada do arteriosus do bulbus. Coloque a pipeta no interior do bulbus arteriosus, como mostrado na Figura 2, e acrescente mais pressão à seringa. Nota: O arteriosus do bulbus é transparente e o tecido é elástico. Ao substituir o sangue com DiI/fixative, a pipeta de vidro dentro do coração deve tornar-se mais visível e adicionando a pressão, o tamanho do arteriosus do bulbus deve expandir. Esta etapa é crucial certificar-se de que bastante pressão estêve usada para substituir todo o sangue com a solução de fixative/DiI, e que todos os vasos sanguíneos estiveram alcançados. Muitas vezes, quando bem sucedido, o PFA provoca contrações musculares e os peixes estarão se movendo.</li>
	<li>Continue a adicionar pressão sobre a seringa para 30-60 s ainda mantendo a pipeta de vidro dentro do arteriosus bulbus.</li>
	<li>Retire a pipeta de vidro e as agulhas do peixe.</li>
	<li>Dissecar o cérebro e a hipófise, e incubar tecidos em fresco 4% PFA em PBS para 2 h no escuro à temperatura ambiente. Nota: A dissecção do cérebro e da hipófise anteriormente tem sido descrita detalhadamente de duas maneiras diferentes por Fontaine et al.26 e Ager-Wick et al.27. Por causa da fixação, o tecido torna-se bastante duro e a ligação frágil entre o cérebro e a hipófise pode ser quebrada. Após a dissecção, o processamento pós-fixação também pode ser realizado durante a noite a 4 ° c.</li>
	<li>Lave o tecido duas vezes em PBS por 10 min antes de se preparar para a imagem. Nota: O tecido pode então ser montado entre o deslizamento da corrediça e da tampa com os espaçadores entre e o meio de montagem para a imagem latente confocal (veja Figura 4), ou seccionado com um do como descrito em detalhe em Fontaine et al.26 antes de montar entre deslize e cubra o deslizamento para a imagem latente com um estereomicroscópio (veja Figura 4).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

A perfusão cardíaca com DII anteriormente tem sido usada para rotular vasos sanguíneos em várias espécies-modelo24, incluindo peixes teleósteo13.
Como DiI é diretamente entregue à membrana celular endotelial por perfusão na vasculatura, é possível aumentar a relação sinal-ruído, aumentando a concentração de DiI na solução fixativa. Além, o fluoróforo fornece a mancha intensa quando excitado com o clareamento mínimo permitindo a emissão...

Os vasos sanguíneos desempenham uma parte essencial do corpo vertebrado como eles fornecem os nutrientes necessários, oxigênio e sinais hormonais para todos os órgãos. Além disso, desde a descoberta de seu envolvimento no desenvolvimento do câncer1, eles receberam muita atenção na pesquisa clínica. Embora um número de publicações investigaram os mecanismos permitindo o crescimento e a morfogênese do vaso sanguíneo, e um grande número genes importantes para sua formação foram identificados2, muito remanesce ser compreendido a respeito da interação entre células ou tecidos e o sangue circulante.
A visualização da vasculatura sanguínea no cérebro e na hipófise é importante. Os neurônios no cérebro exigem uma alta oferta de oxigênio e glicose3, e a hipófise contém até oito tipos importantes de células produtoras de hormônio que usam o fluxo sanguíneo para receber sinal do cérebro e enviar seus respectivos hormônios para diferentes órgãos periféricos4,5. Enquanto em mamíferos, o sistema portal na base do hipotálamo nomeou a Eminência mediana, liga o cérebro e a hipófise6, tal uma ponte de sangue clara não foi descrita em peixes teleósteo. Na verdade, nos teleosts, os neurônios preoptico-hipotálamo projetam diretamente seus axônios na pars nervosa da hipófise7 e inervam principalmente os diferentes tipos de células endócrinas diretamente8,9. No entanto, alguns desses neurônios têm suas terminações nervosas localizadas no espaço extravascular, em estreita proximidade com capilares sanguíneos10. Portanto, a diferença entre peixes e mamíferos teleósteo não é tão clara, e a relação entre a vasculatura sanguínea e o cérebro e as células Hipofisárias requer maior investigação em peixes teleósteo.
O zebrafish tem, em muitos aspectos, um sistema vascular anatomicamente e funcionalmente comparável a outras espécies de vertebrados11. Transformou-se um modelo poderoso do vertebrados para a pesquisa cardiovascular na maior parte agradecimentos ao desenvolvimento de diversas linhas transgênicas onde os componentes do sistema vascular são etiquetados com as proteínas fluorescentes do repórter12. No entanto, a anatomia do sistema circulatório exato pode variar entre as espécies, ou mesmo entre dois indivíduos pertencentes à mesma espécie. Portanto, a visualização dos vasos sanguíneos pode ser de grande interesse também em outras espécies teleósteo para as quais as ferramentas de transgénese não existem.
Várias técnicas foram descritas para rotular vasos sanguíneos em mamíferos e teleosts. Estes incluem a hibridação in situ para genes vasculature-específicos, a mancha alcalina da fosfatase, a microangiografia, e as injeções da tintura (para uma revisão vêem13). A tintura catiônica lipofílica fluorescente do indocarbocyanine (DII) foi usada primeiramente para estudar a mobilidade lateral dos lipídios da membrana porque é mantida nos bicamadas do lipido e pode migrar com ele14,15,16. De fato, uma molécula de DiI é composta por duas cadeias de hidrocarbonetos e cromophores. Quando as correntes do hidrocarboneto se integrarem na membrana de pilha do BICAMADA do lipido das pilhas no contato com ela, os cromóforos permanecem em sua superfície17. Uma vez na membrana, as moléculas DiI se difusas lateralmente dentro da bicamada lipídica que ajuda a manchar estruturas de membrana que não estão em contato direto com a solução DiI. Injetando uma solução DiI através de perfusão cardíaca, portanto, rotular todas as células endoteliais em contato com o composto permitindo a rotulagem direta dos vasos sanguíneos. Hoje DiI também é usado para outros fins de coloração, tais como a imagem única molécula, mapeamento de destino, e Rastreamento neuronal. Curiosamente, existem vários fluoróforos (com diferentes comprimentos de onda de emissão) permitindo a combinação com outros rótulos fluorescentes, e a incorporação, bem como a difusão lateral de DiI pode ocorrer em ambos os tecidos vivos e fixos18, a 19.
O formaldeído, descoberto por Ferdinand Blum em 1893, tem sido amplamente utilizado nos dias atuais como o produto químico preferencial para fixação tecidual20,21. Mostra ampla especificidade para a maioria dos alvos celulares e preserva a estrutura celular22,23. Igualmente preserva as propriedades fluorescentes da maioria de Fluorophores, e assim pode ser usado para fixar os animais transgênicas para que as pilhas alvejadas expressam proteínas fluorescentes do repórter.
Neste manuscrito, um protocolo prévio desenvolvido para rotular vasos sanguíneos em pequenos modelos experimentais de mamíferos24 foi adaptado ao uso em peixes. O procedimento inteiro leva apenas um par de horas para executar. Ele demonstra como perfuse uma solução fixativa de formaldeído contendo DiI no coração de peixe, a fim de etiquetar diretamente todos os vasos sanguíneos no cérebro e da hipófise do modelo de peixe Medaka. Medaka é um pequeno peixe de água doce nativo da Ásia, encontrado principalmente no Japão. É um organismo modelo de pesquisa com um conjunto de ferramentas moleculares e genéticas disponíveis25. Portanto, a identificação dos vasos sanguíneos nesta espécie, bem como em outros permitirá melhorar a nossa compreensão sobre como o cérebro e as células Hipofisárias interagem com a vasculatura sanguínea em tecido inteiro ou fatias de tecido espesso.

<table><tbody><tr><td>16% paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>RT 15711</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 5 mL PP / PE sem agulha</td><td>Seringas</td><td>Sigma</td><td>Z116866-100EA</td></tr><tr><td>Agulhas de seringa BD Precisionglide</td> Agulhas <td>Sigma</td><td>Z118044-100EA</td><td>18G (1,20 * 40)</td></tr> <tr><td>Vidro borossilicato 10 cm OD 1,2 mm</td><td>sutter instrumento</td><td>BF120-94-10</td><td>pipeta</td></tr> <tr><td>de vidroDiI (1,1&prime;-Dioctadecil-3,3,3&prime;,3&prime;-tetrametilindocarbocianina) Tubo</td> <td>de LDPE Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>OD 1,7 mm e ID 1,1 mm</td><td>Portex</td><td>800/110/340/100</td><td></td></tr><tr><td>solução salina de tampão fosfato de cânula (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipetas</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico</td><td>VWR</td><td>391-0442</td><td></td></tr><tr><td>Super cola gel</td><td>loctite</td><td>c4356</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína (ms-222)</td> <td>sigma</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem de vasos sanguíneos no cérebro teleost e pituitária usando a perfusão cardíaca com um dii-fixative

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Os vasos sanguíneos inervam todos os tecidos em vertebrados, permitindo a sua sobrevivência, proporcionando os nutrientes necessários, oxigênio, e sinais hormonais. É um dos primeiros órgãos a começar a funcionar durante o desenvolvimento. Mecanismos de formação de vasos sanguíneos tornaram-se um assunto de alto interesse científico e clínico. Em adultos no entanto, é difícil visualizar a vasculatura na maioria dos animais vivos devido à sua localização profunda dentro de outros tecidos. No entanto, a visualização dos vasos sanguíneos permanece importante para vários estudos, como Endocrinologia e neurobiologia. Enquanto várias linhas transgênicas foram desenvolvidas em zebrafish, com vasos sanguíneos visualizados diretamente através da expressão de proteínas fluorescentes, não existem tais ferramentas para outras espécies teleósteo. Usando Medaka (Oryzias latipes) como um modelo, o protocolo atual apresenta uma técnica rápida e direta para rotular vasos sanguíneos no cérebro e hipófise por perfusing através do coração com fixador contendo DII. Este protocolo permite a melhoria de nossa compreensão em como o cérebro e as pilhas pituitárias interagem com o vasculatura do sangue no tecido inteiro ou em fatias grossas do tecido.

Este protocolo demonstra um procedimento passo a passo para rotular vasos sanguíneos no cérebro Medaka e pituitária, e ao mesmo tempo fixar o tecido. Após a rotulagem por injeção cardíaca de uma solução fixativa contendo DiI no coração, os vasos sanguíneos podem ser observados em fatias usando um estereomicroscópio fluorescente (Figura 4) ou em tecido inteiro usando um microscópio confocal (Figura 5). Na fatia grossa do tecido ou no tecido inteiro, a arquitetura...

O artigo descreve um protocolo rápido para a rotulagem de vasos sanguíneos em um peixe teleósteo por perfusão cardíaca de DII diluído em fixador, usando Medaka (Oryzias latipes) como um modelo e focando no cérebro e tecido hipofisário.

Rotulagem de vasos sanguíneos no cérebro Teleost e pituitária usando a perfusão cardíaca com um DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

O objetivo geral deste procedimento é rotular os vasos sanguíneos no cérebro e a hipófise de peixes teleost, e usamos perfusão cardíaca com um DiI fixador contendo II na espécie modelo medaka. Assim, essa técnica simples e eficiente ajudará a responder questões importantes sobre a anatomia vascular no cérebro e a hipófise de peixes teleost, bem como a relação entre neurônios ou células endócrinas e vasos sanguíneos. Algumas vantagens desta técnica incluem uma preparação rápida e fácil e simples, e sua adaptabilidade às espécies de peixes teleost.Para preparar um suporte de peixe, corte um pedaço de poliestireno a um comprimento de cinco centímetros, uma largura de três centímetros e uma espessura de dois centímetros, e cole o poliestireno a uma antena plástica de nove centímetros de diâmetro. Em seguida, use um bisturi para fazer um buraco em forma de barco de três centímetros no poliestireno. Para preparar o sistema de perfusão, adicione uma cânula de plástico de 30 a 50 centímetros de comprimento na extremidade da agulha do sistema de perfusão.Para preparar pipetas de vidro de cinco centímetros, use uma puxadora de pipeta para esticar capilares individuais de vidro de acordo com as instruções do fabricante. Antes de iniciar a dissecção, carregue uma seringa de 10 mililitros com a solução dii-fixativa preparada e coloque uma agulha com uma cânula na extremidade da seringa. Em seguida, use várias peças de fita colocadas em diferentes orientações para fixar a seringa no banco, e ajustar a posição do microscópio e do assento para obter uma boa posição para dissecção e para pressionar o pistão de seringa com o cotovelo.Em seguida, coloque um peixe eutanizado no lado do abdômen do portador do peixe para cima e fixe a cabeça e a cauda com pinos. Use a tesoura para cortar horizontalmente a camada superficial da pele para abrir o abdômen anterior, e use fórceps para remover a pele acima do coração até que um acesso claro ao ventrículo e o bulbo arteriosus seja alcançado. Adicione um tubo de vidro na extremidade do capilar e quebre a ponta da pipeta.Leve o tubo de vidro para perto do ventrículo e adicione pressão do cotovelo ao pistão de seringa para forçar o líquido para fora enquanto prende o ventrículo cardíaco com a pipeta. Em seguida, perfure imediatamente o seio venoso com fórceps para liberar o sangue de circulação. A partir do ventrículo, ajuste o ângulo da pipeta de vidro para localizar a entrada do bulbo arteriosus, e mova a pipeta abrindo dentro do bulbo arteriosus.Em seguida, adicione pressão à seringa por mais 30 a 60 segundos, mantendo a pipeta dentro do bulbo arteriosus. Para uma rotulagem ideal de todos os vasos sanguíneos é fundamental perfumar no bulbo arteriosus tempo suficiente para substituir todo o sangue pela solução dii-fixativa. Após cerca de 60 segundos de perfusão, quando não for observado mais vazamento de sangue, remova a pipeta de vidro e agulhas do peixe, e colde o cérebro e a pituitária em um fresco 4% de paraformaldeído por duas horas à temperatura ambiente no escuro.Em seguida, enxágüe os tecidos duas vezes em PBS fresco por 10 minutos por lavagem antes de preparar as amostras para a imagem. Após a injeção cardíaca de uma solução fixa que contenha DI, como demonstrado, os vasos sanguíneos rotulados podem ser observados em fatias de tecido por microscopia estéreo fluorescente ou em tecido inteiro por microscopia confocal. Observe que se a solução for injetada no ventrículo cardíaco em vez do bulbo arteriosus ou se a solução for injetada com uma pressão muito baixa e/ou por um período muito curto, será observada uma rotulagem inadequada dos vasos.Além disso, ao fotografar o mesmo tecido com os mesmos parâmetros de imagem, uma diminuição na intensidade de rotulagem pode ser observada após vários dias, com o sinal aparecendo mais espalhado dentro da amostra de tecido. Fatias de tecido de linhas transgênicas dentro das quais as células de interesse expressam proteínas fluorescentes podem ser rotuladas para proteínas específicas de interesse usando protocolos padrão de imunofluorescência que permitem a investigação de interações entre vasos sanguíneos e outros tipos de células. É importante alcançar o bulbo arteriosus.Quando isso for alcançado, a pressão adicional ao pistão de seringa deve induzir uma expansão do bulbo confirmando um procedimento bem sucedido. Essa técnica pode ser usada para investigar a interação entre células endócrinas e vasos sanguíneos na hipófise teleost em geral, mas talvez mais especificamente para investigar possíveis diferenças ou semelhanças entre os sistemas de portal em teleost e mamíferos. Como esse uso político de compostos tóxicos e voláteis, como o uso de uma máscara de gás e uma sala ventilada, devem ser sempre tomadas na realização desses procedimentos.

labeling-blood-vessels-teleost-brain-pituitary-using-cardiac

Research

JoVE Journal

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A perfusão DiI como método de visualização vascular em<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Este protocolo descreve uma abordagem eficiente e reprodutível para estudos histológicos cerebrais do camundongo, incluindo perfusão, seção cerebral, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem.

Imunostaining flutuante livre de cérebros de rato

A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

A investigação preliminar confirma que a hemorragia subaracnóidea (HSA) causa a morte do pericito cerebral. A avaliação da contratilidade dos pericitos pós-HAS requer diferenciação entre pericitos cerebrais viáveis e não viáveis. Assim, um procedimento foi desenvolvido para marcar pericitos cerebrais viáveis e não viáveis simultaneamente em cortes cerebrais, facilitando a observação usando um microscópio confocal de alta resolução.

Imagem de Pericitos Cerebrais Vitais e Não Vitais em Fatias Cerebrais após Hemorragia Subaracnóidea

Demonstramos a indução química da dilatação de grandes vasos sanguíneos em camundongos como um modelo para investigar a disfunção cerebrovascular, que pode ser usada para modelagem de demência vascular e doença de Alzheimer. Também demonstramos a visualização da vasculatura injetando composto de borracha de silicone e fornecendo orientação visual clara para medir as mudanças no tamanho dos vasos sanguíneos.

Uma abordagem visual para induzir dolicoectasia em camundongos para modelar disfunção cerebrovascular mediada por grandes vasos

Aprenda a rotular vasos sanguíneos no cérebro e pituitária de peixes teleósteos usando perfusão cardíaca com DiI em fixador. Esta técnica simples e eficiente utiliza Oryzias latipes como modelo.

Rotulagem de vasos sanguíneos no cérebro Teleost e pituitária usando a perfusão cardíaca com um DiI-fixative

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