Name: Síntese enzimática de metabólitos Epoxidizados de ácidos docosahexaenóico, eicosapentaenóico e Aracidônico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Aprenda a síntese enzimática de ácidos graxos epoxidados enantiopuros usando a enzima P450 BM3. Este método rápido e econômico produz quantidades significativas de metabolitos de DHA, EPA e ácido araquidônico para pesquisa em bioquímica.

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Este trabalho é financiado por r00 ES024806 (institutos nacionais de saúde), DMS-1761320 (National Science Foundation) e fundos de arranque da Universidade Estadual de Michigan. Os autores desejam agradecer ao Dr. Jun Yang (Universidade da Califórnia em Davis) e Lalitha Karchalla (Michigan State University) para obter assistência com a otimização da reação enzimática, e Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass espectrometria e Metabolomics Facility) para obter assistência com a aquisição de dados da HRMS.

Atenção: por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) relevantes antes de utilizar os produtos químicos listados.
1. expressão do selvagem-tipo BM3
<ol><li>Inocular pBS-BM3 transfected DH5α E. coli (uma doação generosa de Dr. F. Ann Walker) em 5 ml de caldo lb estéril com 0,5 mg de ampicilina adicionado em um tubo de cultura de 20 ml.</li>
	<li>Incubar a cultura celular em uma coqueteleira a 37 ° c por 24 h a 200 rpm. Adicione a cultura de partida durante a noite (5 mL) e 100 mg de ampicilina a 1 L de caldo LB estéril em um frasco de Fernbach ou Erlenmeyer. Agitar a 37 ° c por 6 h a 200 rpm, depois a 30 ° c por 18 h a 200 rpm.</li>
	<li>Colete e centrifugue a cultura celular a 4 ° c por 10 min a 1.000 x g. Descarte o sobrenadante e armazene a pelota da pilha em-78 ° c até a purificação da enzima. Nota: o sobrenadante pode ser quimicamente esterilizado por tratamento com lixívia ou esterilizado usando uma autoclave e, em seguida, derramado para baixo do dreno.</li>
</ol>2. purificação de BM3.
<ol><li>
Lise celular
	<ol>
<li>Descongelar o pellet de células no gelo e ressuscita em 40 mL de tampão de solubilização gelada (4 ° c) (Tris de 10 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonil de 0, 1 mM (PMSF;), EDTA de 0, 1 mM; pH 7,8). Cuidado: PMSF é tóxico pelo contato.</li>
		<li>Quando no gelo, proceda as pilhas por 1 minuto com um homogeneizador ultra-sônico (ajuste 10 do poder da saída, dever 100%), seguido por uma ruptura de 1 minuto no gelo a fim lyse as pilhas. Repita este procedimento 6 vezes. Centrifugue o lisado da pilha em 4 ° c por 30 minutos em 11.000 x g aos restos da pilha da pelota.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cromatografia de afinidade
	<ol>
<li>Prepare uma coluna de cromatografia de troca aniónica forte (ver tabela de materiais; diâmetro: 2,8 cm x 6 cm, volume da coluna: 37 ml) por lavagem com 5 volumes de coluna (CV) de tampão a (10 mm Tris, pH 7,8) a 4 ° c.</li>
		<li>Adicione os lisados de células à coluna equilibrada e lave a coluna com 3 CV de tampão frio a. elute o BM3 lavando a coluna com tampão frio B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).</li>
		<li>Colete a fração eluente marrom-avermelhada. Se a proteína não estiver sendo usada imediatamente, misture-a com um volume igual de glicerol e congelamento de flash com nitrogênio líquido. Armazene a solução congelada em-78 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. epoxidação de DHA por BM3
<ol><li>Prepare a reacção adicionando 0,308 g (0,940 mmol) de DHA em 18,8 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) a 2 L de tampão de reacção de agitação (fosfato de potássio de 0,12 M, 5 mM MgCl2, pH 7,4) juntamente com 20 nm da enzima BM3 descongelada. A concentração enzimática pode ser determinada pelo método de ensaio espectral de monóxido de carbono/ditionita19.</li>
	<li>Enquanto a solução está mexendo, comece a reação adicionando 1 equivalente de NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido, sal de tetrassódico, 0,808 g, 0,940 mmol) dissolvido em tampão de reação. Mexa a reação por 30 min enquanto borbulhando ar através da mistura de reação com um balão cheio de ar anexado a uma seringa e agulha.</li>
	<li>Utilizando um espectrofotômetro (ver tabela de materiais), verifique a absorvância da mistura de reacção a 340 nm para determinar se o NADPH está esgotado. Se não houver absorvância remanescente indicando o consumo de NADPH, a reação está completa. Nota: normalmente, a reacção é concluída após 30 min.</li>
	<li>Saciar a mistura de reacção adicionando lentamente 1 M de ácido oxálico, Dropwise, até que o pH da solução atinja 4.</li>
</ol>4. extração de AEPD
<ol><li>Extraia a solução tampão extinto com 2 L de éter dietílico (anidro, sem peróxido) 3 vezes. Colete a camada de éter (6 L) e seque com sulfato de magnésio anidro (MgSO4).</li>
	<li>Filtre o MgSO4 da solução e concentre a camada de éter seco em um evaporador rotativo para produzir o resíduo bruto da EDP.</li>
	<li>Purificar o resíduo por cromatografia em coluna flash (um cartucho de sílica 40 g é suficiente). Comece em 10% acetato de etilo (etoac) em hexanos e rampa até 60% etoac em hexanos mais de 22 min. Nota: três picos principais são obtidos e recolhidos, eluição na ordem de 1. DHA não reagido; 2. mistura de isómeros EDP; e 3. di-epoxida (produtos de oxidação normal (ver Figura 1)).</li>
	<li>Combine as frações e concentre-as no evaporador rotativo. A partir deste exemplo, 0, 74 g, (24%) de DHA não reagido, 0,151 g (47%) dos isómeros da EDP, e 0, 76 g, (22%) de di-epoxida foram obtidos.</li>
</ol>5. esterificação de AEPD, separação de 16 (s), 17 (r)-e 19 (s), 20 (r)-EDP e saponificação de ésteres
Cuidado: o Trimethylsilyldiazomethane (TMS-diazometano) é muito tóxico pelo contato e pela inalação. Use somente em uma capa das emanações com o equipamento protetor pessoal apropriado.
<ol><li>Diluir os epóxidos (0,151 g, 0,435 mmol) em um balão de fundo redondo ou um pequeno frasco para injetáveis com 2 ml de metanol anidro (MeOH) e 3 ml de tolueno anidro, adicione uma barra de agitação e adicione TMS-diazometano (1,2 equivalentes molar, ou 0,26 ml de uma solução de 2 M em hexanes) Argon.</li>
	<li>Aguarde 10 min e adicione TMS-diazometano adicional (0, 50 mL) até que uma cor amarela pálida permaneça.</li>
	<li>Após 30 min, concentre cuidadosamente a mistura usando o evaporador rotativo e purifique o resíduo por cromatografia em coluna flash. Elute com 4% etoac em hexanos (usando uma coluna de gel de sílica 40 g ou cartucho) por 22 min. Neste exemplo, 19, 20-éster metílico de EDP (0,116 g, 74%) e 16, 17-éster metílico de EDP (0, 29 g, 19%), foram obtidos como óleos claros (rendimento total, 93%).</li>
	<li>Recolher as frações contendo os regioisómeros de éster metílico purificados. 19 (s), 20 (R)-elutos do éster metílico de EDP primeiramente, seguidos por 16 (s), 17 (R)-éster metílico de EDP.</li>
	<li>Se qualquer fração mista permanecer (contendo ambos os isómeros; pode ser avaliada por cromatografia em camada delgada (TLC) em 8:1 hexano/EtOAc e manchada com permanganato de potássio (KMnO4)), recromatógrafo-los com o mesmo sistema de solvente como antes.</li>
	<li>Concentrar as frações contendo os regioisómeros individuais. Nota: neste ponto, a identidade e a pureza podem ser avaliadas por RMN (usando CDCl3 como o solvente; ver a legenda para a Figura 2).</li>
	<li>Para converter os regioisómeros de éster metílico de EDP individuais nas suas formas de ácido, diluir o éster EDP em THF: Water (aproximadamente 0,7 mL/0,1 mmol de éster). Adicionar 2 M aquosa LiOH (3 equivalentes molar) e mexa durante a noite. Nota: a completude da reacção pode ser avaliada por TLC, utilizando 3:1 hexanes/EtOAc, manchando com KMnO4; o produto tem um fator de retenção de ~ 0,3.</li>
	<li>Saciar a reação lentamente com ácido fórmico, até que o pH da mistura atinja 3-4. Adicionar água e acetato de etila (1-2 mL/0.100 mmol de éster) e separar as camadas. Extraia a camada de água com EtOAc (3 x 5 mL), lave com solução de salmoura saturada (NaCl) e seque a camada EtOAc sobre o sulfato de sódio anidro (na2so4).</li>
	<li>Concentre a solução de acetato de etila utilizando um evaporador rotativo, adicione hexanos (10 ml) e concentre-se novamente. Repita duas vezes para remover azeotropicamente o ácido fórmico residual. Purify o resíduo pela cromatografia de coluna instantânea, farmacológicos com 10-30% etoac sobre 15 minutos.</li>
	<li>Concentre as frações desejadas e seque em vacuo para pagar o ácido purificado. Nota: nesta fase, a pureza enantiomérica pode ser avaliada (por HPLC quiral, ver as legendas para a Figura 3 - Figura 4 para coluna e condições). A pureza química pode ser avaliada por CLAE C18 (achiral) (ver tabela de materiais e referência 14).</li>
</ol>

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<li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li>
<li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li>
<li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Apresentamos aqui um método operacionalmente simples e econômico para a preparação dos dois metabólitos epoxídicos mais abundantes de DHA-19, 20 e 16,17-EDP. Estes ácidos graxos epóxi podem ser preparados em altamente enantiopure (como seu S, R-isómeros) forma usando selvagem-tipo BM3 enzima. Vários pontos críticos que podem ser usados para solução de problemas, e a extensão do nosso método para a preparação de metabólitos epóxi enantiopure de AA e EPA, são descritos abaixo.
B...

Como o interesse no papel que os ácidos gordos polyinsaturados (particularmente Omega-3 e Omega-6 ácidos gordos polyinsaturados) jogam na biologia humana cresceu nos últimos anos, os investigadores tomaram a observação da escala larga de benefícios atraentes que seus metabolitos Exposição. Em particular, os metabólitos de ácidos graxos epóxi produzidos pela classe de enzimas do citocromo P450 têm sido um grande ponto de foco. Por exemplo, muitos epoxídeos de PUFA, incluindo ácidos epoxyeicosatrienoic (Eets), ácidos ver (edps) e ácidos ver (EEQS), desempenham um papel crítico na regulação da pressão arterial e inflamação1,2 , 3. º , 4. º , 5. Curiosamente, os enantiômeros e regioisômeros específicos dos epoxídeos AA e EPA são conhecidos por terem efeitos variados sobre a vasoconstrição6,7. Enquanto os efeitos fisiológicos dos enantiômeros e regioisômeros de EETs e EEQs foram documentados, pouco se sabe sobre o efeito dos ácidos epoxydocosapentaenóicos análogos (EDPs) formados a partir de DHA. O uso generalizado do óleo de peixe8, que é rico em EPA e DHA, também despertava o interesse na AEPD9. Os benefícios destes suplementos são acreditados para ser em parte devido aos metabolitos a jusante DHA (16,17-EDP e 19,20-EDP sendo o mais abundante) porque in vivo níveis de EDPs coordenar muito bem com a quantidade de DHA na dieta10, o 11.
Estudar os mecanismos e alvos destes ácidos graxos epóxi por Metabolomics, biologia química, e outros métodos tem provado desafiador, em parte porque eles existem como misturas de Regio-e estéreo-isómeros, e um método de obtenção de quantidades puras do são necessários enantiômeros e regioisômeros. Os meios convencionais para sintetizar quimicamente estes compostos provaram ineficaz. O uso de peroxyacid como o ácido meta-chloroperoxybenzoic para o epoxidação tem muitas desvantagens, notàvel a falta do selectivity do epoxidação, que necessita a purificação cara e meticulosa de regioisômeros e de enantiomers individuais. A síntese total dos metabólitos de DHA e EPA é possível, mas também sofre de desvantagens que o tornam impraticável para a síntese em larga escala, como altos custos e baixos rendimentos12,13. A produção global eficiente pode ser conseguida com síntese enzimática, pois as reações enzimáticas são Regio-e estereosseletivas14. Estudos mostram que a epoxidação enzimática de AA e EPA (com BM3) é tanto regioseletiva e enantioseletiva15,16,17,18, mas este procedimento não foi testado com DHA, ou em um grande Escala. O objetivo geral de nosso método era escalar acima e aperfeiçoar esta epoxidação chemoenzimática para produzir ràpida quantidades significativas de ácidos gordos puros da cola Epoxy como seus enantiomers individuais. Usando o método apresentado aqui, os pesquisadores têm acesso a uma estratégia simples e rentável para a síntese de EDPs e outros metabólitos de epóxi PUFA.

<table><tbody><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>NA</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>GoldBio</td><td>A30125</td><td>NA</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-3</td><td>NA</td></tr><tr><td>Metanol anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322515</td><td>NA</td></tr><tr><td>Sulfato de sódio anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421-500</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anidro tolueno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>NA</td></tr><tr><td>Ácido Araquidônico (AA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-71A</td><td>Sensível ao ar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Diethyl Ether</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMSO (grau de biologia molecular)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>NA</td></tr><tr><td>Ácido Docosahexaenóico (DHA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-84A</td><td>Sensível ao ar.&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilenodiaminotetracético)</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td>NA</td></tr><tr><td>Ácido Eicosapentaenóico (EPA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>&nbsp; U-99A</td><td>Sensível ao ar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetato de etila</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>34858</td><td>NA</td></tr><tr><td>Cartuchos de coluna Flash 25, 40, 4, tamanhos de 12 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>145170203, 145154064, 5170200</td><td>Alternativamente, a cromatografia de coluna convencional pode ser usada</td></tr><tr><td>ácido fórmico (grau HPLC)</td> <td>J.T. Baker</td><td>0128-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td>NA</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>VWR</td><td>BDH24575</td><td>NA</td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>NA</td></tr><tr><td>Hidróxido de lítio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442410</td><td>NA</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>2444-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>Metanol (grau HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-41-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>NADPH Sal Tetrassódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>481973</td><td>Sensível ao ar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido oxálico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>194131</td><td>NA</td></tr><tr><td>pBS-BM3 transfectado DH5&alpha; E. coli</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA PMSF (fluoreto de fenilmetanossulfonil)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Tóxico!</td></tr><tr><td>Permanganato de Potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td><td>Para coloração TLC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Sigma</td><td>795496</td><td>NA</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td>NA</td></tr><tr><td>Q Resina de fluxo rápido de sepharose (GE Healthcare life sciences)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-0515-01</td><td>Para purificação de troca aniônica da enzima</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano, anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td>NA</td></tr><tr><td>TMS-Diazometano (2,0 M em hexanos)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>362832</td><td>Muito tóxico.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GoldBio</td><td>T-400</td><td>NA</td></tr><<tr><td>strong>Também necessário:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema automático de purificação de flash (usamos um Buchi Reveleris X2)&nbsp;</td><td>Coluna de HPLC Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td><td>Centrífuga Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>capaz de 10.000 x g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coluna de HPLC quiral (Lux celulose-3), 250 x 4,6 mm, 5 &micro; M, 1000 &Aring;)</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suprimentos de química geral: um funil separatório de 2 L, béqueres e frascos Erlenmeyer com capacidade de 1000-2000 L, frascos de 20 mL, frascos de HPLC, pequenos frascos de fundo redondo e barras de agitação.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC (usamos uma bomba analítica Shimadzu Prominence LC-20AT e detector UV-vis SPD-20A</td><td>Espectrofotômetro Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td>NMR: Espectrômetro Agilent DD2 (500 MHz)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic dismembrator ou homogeneizador ultrassônico</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

síntese enzimática de metabólitos epoxidizados de ácidos docosahexaenóico, eicosapentaenóico e aracidônico

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Os metabólitos epoxidizados de vários ácidos graxos poli-insaturado (PUFAs), denominados ácidos graxos epóxi, têm uma ampla gama de papéis na fisiologia humana. Estes metabolitos são produzidos endogenamente pela classe de enzimas do citocromo P450. Por causa de seus efeitos biológicos diversos e potentes, há um interesse considerável em estudar estes metabolitos. Determinar as funções únicas destes metabolitos no corpo é uma tarefa difícil, como os ácidos graxos epóxi deve primeiro ser obtido em quantidades significativas e com alta pureza. A obtenção de compostos de fontes naturais é muitas vezes trabalhoso, e Hidrolina de epoxida solúvel (sEH) rapidamente hidrolisar os metabolitos. Por outro lado, a obtenção desses metabólitos por meio de reações químicas é muito ineficiente, devido à dificuldade de obtenção de regioisômeros puros e enantiômeros, baixos rendimentos e purificação extensa (e cara). Aqui, nós apresentamos uma síntese enzimática eficiente de 19 (s), 20 (r)-e 16 (s), 17 (r)-ácidos epoxydocosapentaenoic (edps) de DHA através do epoxidação com BM3, uma enzima CYP450 bacteriana isolada originalmente do bacilo megaterium (que é prontamente expresso em Escherichia coli). A caracterização e a determinação da pureza são realizadas com espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massas (MS). Este procedimento ilustra os benefícios da síntese enzimática de metabolitos da epoxi de PUFA, e é aplicável à epoxidação de outros ácidos gordos, incluindo o ácido araquidônico (AA) e o ácido eicosapentaenóico (EPA) para produzir o epoxyeicosatrienoic análogo ácidos (Eets) e ácidos ver (EEQS), respectivamente.

O cromatograma de coluna flash (realizado usando um sistema automatizado de purificação de flash como descrito abaixo) obtido após a purificação da mistura bruta de epoxidação enzimática é mostrado na Figura 1. Após a esterificação e separação dos regioisómeros, foram obtidos 16 (s) puros, 17 (r)-EDP e 19 (s), 20 (r)-ésteres metílicos de EDP. Tipicamente, eles estão presentes em uma proporção aproximada de 1:4 a 1:5, sendo ...

Nós apresentamos um método útil para a síntese e a purificação enzimáticas em grande escala de enantiômeros e de regioisômeros específicos dos epóxidos do ácido araquidônico (AA), do ácido docosahexaenóico (DHA), e do ácido eicosapentaenóico (EPA) com o uso de um citocromo bacteriano Enzima P450 (BM3).

Síntese enzimática de metabólitos Epoxidizados de ácidos docosahexaenóico, eicosapentaenóico e Aracidônico

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Assim, nosso protocolo nos permite preparar ácidos graxos epóxi, e este método pode ajudar a avançar na pesquisa sobre os mecanismos pelos quais esses metabólitos atuam no corpo. Historicamente, ácidos graxos epóxi puros são muito difíceis de obter. Então nosso protocolo é simples, rápido, econômico, e nos permite preparar quantidades significativas desses metabólitos.Sim, desenvolvemos um protocolo para DHA, mas também funciona muito bem para EPA e ácido aracidônico. Trabalhe rapidamente, pois alguns dos reagentes são sensíveis ao ar, especificamente DHA e NADPH, e certifique-se de emparelhar tudo com antecedência para que a configuração seja simples. Além disso, esteja ciente dos perigos.Nosso protocolo utiliza técnicas em enzima e química orgânica. A visualização é fundamental para ajudar leitores e espectadores que não estão familiarizados com as técnicas especializadas nesses campos. Para inocular, use um laço estéril ou pipeta mergulhado em estoque de glicerol de pBS-BM3 transfectado DH5-alfa E.coli em cinco mililitros de caldo LB estéril suplementado com 0,5 miligramas de ampicilina.Incubar a cultura celular em um shaker a 37 graus Celsius por 24 horas a 200 rpm. Em seguida, adicione a cultura inicial de cinco mililitros e 100 miligramas de ampicilina a um litro de caldo LB estéril em um frasco Erlenmeyer. Agite a 37 graus Celsius por seis horas a 200 rpm, depois a 30 graus Celsius por 18 horas a 200 rpm.Depois disso, colete a cultura celular em tubos de centrífuga, e centrifugar a cultura celular a quatro graus Celsius por 10 minutos a 1.000 vezes g. Despeje o supernatante em outro frasco. Descontaminar com alvejante ou usando a autoclave, e armazene a pelota da célula a menos 78 graus Celsius até a purificação da enzima.Para realizar a lise celular, primeiro descongele a pelota celular no gelo, e resuspend em 40 mililitros de tampão de solubilização gelada contendo Tris, PMSF e EDTA. Enquanto no gelo, sonicate as células por um minuto com um homogeneizador ultrassônico, com uma configuração de potência de saída de 10 e dever de 100, seguido por uma quebra de um minuto no gelo, a fim de lise as células. Repita este procedimento seis vezes.Centrifugar a célula lysate a quatro graus Celsius por 30 minutos a 11.000 vezes g para pelotar os detritos celulares. Para realizar cromatografia de afinidade, em uma sala fria ou geladeira com uma porta deslizante, a quatro graus Celsius, primeiro prepare uma forte coluna de cromatografia de troca de ânion lavando a resina com cinco volumes de coluna de tampão A de Tris de 10 mililitros no pH 7.8. Em seguida, adicione o supernatante das células à coluna equilibrada, e lave a coluna com três volumes de coluna de tampão frio A.Em seguida, elute o BM3 lavando a coluna com seis volumes de coluna de tampão frio B de Tris 10-mililitro e cloreto de sódio de 600 mililitros.Colete a fração de eluente marrom-avermelhado. Se a proteína não estiver sendo usada imediatamente, misture-a com um volume igual de glicerol e congele com nitrogênio líquido. Armazene a solução congelada a menos 78 graus Celsius.Para realizar a epóxida de DHA, primeiro determine a concentração da enzima BM3 descongelada, de acordo com o método de ensaio espectral de monóxido de carbono. Em seguida, em um béquer contendo dois litros de tampão de reação sendo agitado em uma placa de agitação magnética, adicione 0,94 mililitros de DHA diluídos em 18,8 mililitros de DMSO e a enzima BM3 diluída para 20 nanomolar. Enquanto a solução está mexendo, comece a reação de epóxida adicionando 8,7 mililitros de tampão de reação contendo 0,94 mililitros de NADPH.Mexa a reação por 30 minutos enquanto borbulha o ar na mistura de reação com um balão cheio de ar preso a uma seringa e agulha colada no interior do béquer. Depois disso, elasenhe um microliter da mistura de reação e coloque-o em um espectrômetro NanoDrop para medir a absorvância em 340 nanômetros. Use a água como em branco.Se não houver absorção restante, o que indica que o NADPH foi consumido, a reação está completa. Sacie a mistura de reação adicionando lentamente um molar ácido oxálico dropwise, até que o pH da solução atinja aproximadamente quatro. Agora, extraia a solução tampão saciada com dois litros de éter dietil anidro e livre de peróxido.Use um funil separador para agitar e separar as camadas, e colete o éter em um frasco de Erlenmeyer. Repita duas vezes adicionais e adicione aproximadamente 50 gramas de sulfato de magnésio anidro para secar o éter. Em um funil de filtro de vácuo, despeje o éter seco para filtrar o sulfato de magnésio e transfira a camada de éter filtrada para um frasco de fundo redondo do evaporador rotativo.Ajuste a velocidade de rotação para médio e inicie o vácuo para concentrar o líquido para produzir resíduos brutos de EDP. Carregue o resíduo em um cartucho de sílica de 40 gramas para realizar a cromatografia da coluna flash usando uma máquina automatizada de purificação de flash. Comece com acetato de 10% de etila em hexanos, e aumente até 60% de acetato etílico em hexanos ao longo de 22 minutos.As frações são coletadas automaticamente em tubos. Em seguida, misture as frações de cada pico em um frasco de fundo redondo, coloque o evaporador rotativo e inicie a evaporação. Três frações são obtidas, DHA, isômeros EDP e diepoxide.Para esterify os 0,151 gramas de epóxi, em um frasco de fundo redondo ou frasco pequeno, adicione dois mililitros de metanol anidro e três mililitros de tolueno anidro, e adicione uma barra de agitação. Conecte o frasco com um balão cheio de argônio através de um septo de borracha e uma agulha, e adicione 0,26 mililitros de tms-diazometano de dois molares através de uma seringa enquanto mexe. Espere 10 minutos e adicione 05 mililitros adicionais de TMS-diazometano até que uma cor amarela pálida apareça.Após 30 minutos, concentre cuidadosamente a mistura usando o evaporador rotativo e use um cartucho de coluna de gel de sílica de 40 gramas na máquina de cromatografia flash para purificar o resíduo. Eluto com uma concentração isocrática de acetato de 4% de etila em hexanos ao longo de 22 minutos. Recolher as frações contendo o éster de metila purificado 19S, 20R-EDP eluates primeiro, seguido por 16S, 17R-EDP metil ester.Agora, avalie as frações por cromatografia de camada fina em uma mistura de hexano-a-etil-acetato de oito para um. Mancha com permangênio de potássio para verificar se há frações mistas contendo ambos os isômeros. Concentre as frações correspondentes a cada pico em um evaporador rotativo e, em seguida, pese sobre um equilíbrio para determinar a quantidade de ésteres EDP obtidos.Se permanecerem frações mistas, re-cromatógrafo-as com o mesmo sistema de solvente que anteriormente utilizado. Concentre cada fração contendo o regioisômero individual em um evaporador rotativo. Para converter regioisômeros individuais de metila metil edp em suas formas ácidas, diluir o éster EDP em um pequeno frasco com aproximadamente 0,7 mililitros de THF por 0,1 milimoles de éster, juntamente com 0,175 mililitros de água.Esfrie o frasco a zero graus Celsius em um banho de gelo, adicione três equivalentes da solução de hidróxido de lítio e mexa em uma placa de agitação sob argônio durante a noite enquanto aquece à temperatura ambiente. Pela manhã, sacie a reação adicionando lentamente ácido fórmico, até que o pH da mistura atinja de três a quatro. Em seguida, adicione água e dois mililitros de acetato etílico para separar as camadas.Extrair a camada de água com 10 mililitros de acetato etílico três vezes, lavar com 20 mililitros de solução de salmoura saturada e adicionar vários gramas de sulfato de sódio anidro na solução para secar a camada de acetato etílico. Concentre a solução de acetato etílico usando o evaporador rotativo, adicione 10 mililitros de hexanos e concentre-se novamente. Repita duas vezes para remover azeotropicamente ácido fórmico residual.Purifique o resíduo por cromatografia de coluna flash, eluindo com acetato de 10 a 30% de etila ao longo de 15 minutos. Concentre as frações desejadas no evaporador rotativo, e seque em vacuo para pagar o ácido purificado. O cromatograma da coluna flash obtido após a purificação da mistura bruta da epóxida enzimática é mostrado aqui.Três picos principais foram obtidos, eluting na ordem de, primeiro, DHA não redigido, segundo, mistura de isômeros EDP, e, terceiro, diepoxide, que são produtos normais de super oxidação. Após a esterificação e separação dos regioisômeros, os espectros de nmr do próton indicam que foram obtidos estileiros de alta pureza 16S, 17R-EDP e 19S, 20R-EDP. Quiral HPLC confirmou pureza enantiomerica das formas ácidas dos EDPs.Certifique-se de manter seu caldo estéril durante o manuseio e inoculação para evitar contaminação. A epóxidação pode ser usada para outros ácidos graxos. Então também tentamos com ácidos aracidonicos e eicosapentaenoicos, e obtivemos bons rendimentos desses epóxidos de inantiopure, então 14, 15-EET e 17, 18-EEQ.Assim, um protocolo que permite aos pesquisadores acessar ácidos graxos epóxi pode ajudar na pesquisa sobre as funções biológicas desses compostos, o que poderia levar ao seu uso como chumbo medicamentoso. Os produtos químicos perigosos são o PMSF, que é perigoso pelo contato, e o TMS-diazometano, que é muito tóxico pelo contato e inalação. Assim, este último deve ser usado em um capô de fumaça e com equipamento de proteção individual adequado.

enzymatic-synthesis-epoxidized-metabolites-docosahexaenoic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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