Gravações electrofisiológicas de correntes do íon da único-pilha o esforço de tesoura bem definido

O objetivo deste protocolo é descrever uma câmara de fluxo de placa paralela modificada para uso na investigação da ativação em tempo real de canais de íons mecanosensíveis por tensão de cisalhamento.

O uso da câmara de fluxo de placas paralelas modificadas pode ajudar os pesquisadores a responder a perguntas-chave relativas à resposta funcional dos canais de íons mecanosensíveis ao estresse de cisalhamento. A principal vantagem desta técnica é que ela permite que a investigação em tempo real flua canais de íons ativados em uma câmara de fluxo de placa paralela facilmente montada e reutilizável. Para iniciar o procedimento, aplique uma fina camada de solução de elastômero de silicone ao redor das bordas do espaço retangular da peça C, e coloque suavemente o vidro de tampa retangular, peça D, diretamente na solução elastômero para cobrir completamente o espaço retangular aberto da peça C.Limpe cuidadosamente o excesso de solução de elastômero de silicone.

Em seguida, repita o procedimento para adricar o vidro de tampa retangular, peça F, até o fundo da peça E e permitir que a solução de elastômero de silicone cure durante a noite à temperatura ambiente. Agora, monte a câmara de fluxo MPP colocando sequencialmente cada peça em cima da anterior, começando com a câmara inferior, peça E, em seguida, peça C, peça B, seguida pela peça A na parte superior. Em seguida, alinhe os orifícios de parafuso de cada peça nas curvas e aparasse firmemente as peças para evitar que vazamentos ocorram enquanto administram o fluxo para a câmara de fluxo MPP.

Em uma placa de seis poços, coloque quatro a cinco, 12 milímetros de vidro de cobertura em cada poço. Salve as células entre 10% e 30% de confluência, de tal forma que células únicas possam ser acessadas para gravações eletrofisiológicas. Posteriormente, incubar as células em condições de cultura padrão por pelo menos duas horas para permitir que as células aderam, e não mais do que 24 horas, pois as células endoteliais se tornarão planas e difíceis de remendar quando semeadas em subconfluência por mais de 24 horas.

Em seguida, remova um vidro de cobertura contendo as células aderidas de um poço da placa de seis poços e enxágue rapidamente em PBS. Em seguida, transfira o vidro de cobertura com células para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo dois mililitros de solução eletrofisiológica BAF. Transfira imediatamente o vidro de cobertura com células para a câmara de fluxo MPP.

Transfira o círculo de vidro de cobertura para o vidro de cobertura retangular, peça D, que é aderido à peça C da câmara de fluxo MPP. Adicione a solução BAF para submergir completamente o círculo de vidro de cobertura e as células. Posteriormente, posicione o círculo de vidro de cobertura na peça D de tal forma que as células estejam alinhadas com as aberturas de fenda da peça B.Certifique-se de que o círculo de vidro de cobertura adere à peça D através da solução de aderência de vidro para evitar a interrupção da posição do círculo de vidro de cobertura pela aplicação de fluxo.

Em seguida, monte a câmara de fluxo MPP aparafusando as peças na ordem apropriada. Transfira a câmara para o estágio do microscópio e perfunda imediatamente a câmara com a solução BAF. Em seguida, identifique uma célula saudável com uma borda escura e núcleo óbvio para o experimento.

Evite células que parecem estar fazendo blubbing ou células que estejam em contato com outras células. Para controlar o estresse da cisalhamento, configure um sistema de perfusão de gravidade conectando um cilindro de seringa graduado de 30 mililitros a uma trava Luer de três vias equipada com tubos de microbore. Em seguida, conecte o cilindro graduado à gaiola de Faraday em torno da plataforma de eletrofisiologia usando fita dupla face.

Antes de inserir a tubulação na câmara MPP, preencha a seringa e tubos com solução BAF. Em seguida, insira a tubulação no orifício de entrada da câmara de fluxo MPP da peça A.Preencha a câmara de fluxo MPP com solução, de tal forma que ela esteja sendo removida no reservatório de vácuo. Pare o fluxo para a câmara e recarrete o cilindro graduado até a marca máxima.

Calcule a taxa de fluxo manualmente usando um cronômetro permitindo que a solução flua através da câmara a uma determinada altura do cilindro de seringa. Levante ou baixe a seringa para alterar o fluxo e calcular o estresse da cisalhamento em uma câmara paralela usando esta equação. Repita este processo até encontrar um nível desejado de estresse de tesoura.

Posteriormente, transfira uma câmara montada contendo células aderidas para o estágio do microscópio da plataforma de eletrofisiologia. E insira a tubulação, pré-preenchida com solução BAF, no orifício da peça A.Então, encha a câmara e lave as células com 10 mililitros de solução BAF, simultaneamente. Uma vez que a configuração de patch desejada seja obtida com sucesso, permita que as correntes do canal se estabilizem em um banho estático à temperatura ambiente.

Assim que as correntes se estabilizarem, aplique a tesoura de forma escalada, permitindo que a corrente aumentada se estabilize antes do próximo passo do aumento do estresse da tesoura. Remova a exposição da cisalhamento às células parando o fluxo para a câmara, permitindo que as correntes de canais mecanosensíveis retornem às correntes de base observadas no banho estático. Mostrado aqui é uma gravação bruta representativa da corrente Kir de uma célula mesentórica endotelial do rato primário com notável corrente de vazamento linear para fora.

Uma rampa de 140 negativos para 40 mililitros positivos foi aplicada no patch acima de 400 milissegundos. A corrente de vazamento impede a análise da atividade real do canal Kir. Para subtrair a corrente de vazamento, primeiro calcule a condutância linear da corrente de vazamento.

Inclinação G múltipla por tensões correspondentes de todo o traço bruto para traçar a corrente de vazamento nos dados brutos. A linha deve sobrepor exatamente o vazamento linear externo. Em seguida, subtraia a corrente de vazamento plotada de todo o traço para que a corrente externa linear seja cerca de zero picoamperes por picofarad, e a corrente Kir real pode ser analisada.

A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este procedimento é posicionar corretamente o vidro de cobertura na câmara para que as células sejam acessíveis para experimentos. Além disso, certifique-se de que o deslizamento da tampa está adequadamente aderido à peça D, de tal forma que o fluxo de fluido não interrompa o vidro de cobertura contendo células.