Name: Análise da localização de snRNA Spliceosomal em células HeLa humanas usando microinjeção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a técnica de microinjeção de snRNAs marcados com fluorescência em células HeLa para estudar a localização nuclear em corpos de Cajal. Este método permite rastrear moléculas de RNA em células vivas e identificar sequências essenciais para o transporte correto.

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Este trabalho foi apoiado pela Czech Science Foundation (18-10035S), o programa nacional de sustentabilidade I (LO1419), apoio institucional (RVO68378050), o Fundo Europeu de desenvolvimento regional (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) e a agência de subvenção da Universidade de Charles (GAUK 134516). Nós reconhecemos mais a facilidade do núcleo da microscopia de luz, IMG CAS, Praga, República Checa (apoiado por concessões (Czech-BioImaging-LM2015062).

1. preparação de snRNAs para microinjection
<ol><li>Prepare um molde do ADN que contem a versão full-length ou truncada/Mutated de snRNA pelo PCR usando uma seguinte configuração do PCR: 98 ° c para 60 s, 98 ° c para 15 s, 68 ° c para 30 s, 72 ° c para 1 minuto, 98 ° c para 15 s para 35x e 72 ° c por 5 min.</li>
	<li>O primer dianteiro deve conter uma sequência de promotor para a transcrição in vitro apenas a montante do primeiro nucleotídeo transcrito. Amplify a seqüência de snRNA U2 usando o primer dianteiro que contem o promotor T7 e o primer reverso, que termina com o último nucleotide transcrito (veja a tabela de materiais para detalhes).</li>
	<li>Sintetizar snRNA usando um kit para síntese de RNA curto (ver tabela de materiais para detalhes) contendo T7 RNA polimerase. Adicionar 1 mm ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimetilguanosina Cap analógico (m32, 2, 7g (5 ') PPP (5 ') G), 1 ml de um inibidor de RNA e 500-700 ng do modelo de DNA para a mistura de reação e incubar a 37 ° c durante</li>
	<li>Adicionar 1 μL (2U) de DNase na reacção e incubar por 15 min adicionais a 37 ° c.</li>
	<li>Isole o snRNA pela extração ácida do fenol/clorofórmio. Retire a fase superior da água e adicione 1/10 do volume original de 3 M de acetato de sódio (pH = 5,2), 3 μL de glicogênio para melhor visualização da pelota e 2,5 volumes de 100% de etanol. Incubar durante 1 h a-80 ° c, centrifugador por 10 min a 14.000 x g e 4 ° c.</li>
	<li>Lave a pelota com 70% de etanol e dissolva em 12 μL de água sem nuclease. O rendimento usual do RNA era ao redor 600 ng/mL. Conservar a-80 ° c.</li>
	<li>Monitore a integridade de snRNAs transcritas in vitro por electrophoreses do gel do agarose.</li>
	<li>Antes da microinjecção, diluir o RNA para a concentração final 200 ng/mL em água contendo 10 μg/μL de Dextran-TRITC 70 kDa.</li>
</ol>2. células
<ol><li>Antes do uso, trate os COVERSLIP com 1 M HCl para 1 h, lave-o completamente na água destilada e armazene-o em 100% etanol. O tratamento ácido promove a adesão das pilhas para impedir a casca da pilha durante ou após a injeção. Para facilitar a identificação de células injetadas, use uma lamínula com uma grade.</li>
	<li>Semente HeLa ou outras células aderentes 1 dia antes da microinjecção em 12 mm COVERSLIP (n º 1 ou n º 1,5) para atingir 50% confluência no momento da microinjecção.</li>
</ol>3. injeção
Nota: As células de HeLa foram microinjetadas no meio de águia modificada de Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-glicose contendo fenol vermelho e antibióticos). A injeção foi feita usando um injector e um micromanipulador equipado com a agulha estéril (veja a tabela de materiais para detalhes). Todo o sistema microscópico/micromanipulador foi pré-aquecido a 37 ° c por pelo menos 4 h para evitar a flutuação de partes individuais do microscópio e do microinjetor.
<ol><li>Coloque o prato de Petri (30 mm) contendo 2 mL de meios de cultura com a lamínula no meio no suporte do microscópio. Carregar 3 μL de mistura de snRNA na agulha utilizando um microloader. Instale a agulha no suporte do microinjector em 45 ° com respeito à superfície do prato de Petri.</li>
	<li>Para encontrar a agulha, use um objetivo de longa distância de 10x. Primeiramente, ajuste a velocidade grosseira no injector e abaixe a agulha até que toque o meio de cultura. Usando os binóculos microscópio, encontrar o ponto luminoso, que é o lugar onde a agulha toca o meio de cultura.</li>
	<li>Mude a velocidade para multa e abaixe mais a agulha ao olhar no microscópio até que a ponta da agulha esteja observada. Mova a agulha no meio do campo visual e mude para um objetivo de longa distância de 40x.</li>
	<li>Depois de alterar o objetivo, selecione a célula e mova a agulha acima desta célula. Defina as pressões e o tempo para o contato da célula (consulte Dicas e solução de problemas em discussão).</li>
	<li>Mova a agulha para baixo na célula e, em seguida, defina o limite inferior no micromanipulador. Tenha cuidado para não mover a agulha abaixo da célula.</li>
	<li>Depois de definir o limite inferior, mova a agulha para trás acima da célula e pressione o botão de injeção no joystick do injector. A agulha se move automaticamente dentro da célula para o local onde o limite é definido e injeta a mistura de RNA.</li>
	<li>Para terminar, empurre o menu do botão no injector e retire a agulha do suporte. Em seguida, desconecte o tubo do injector antes de desligar o injector e o micromanipulador.</li>
</ol>4. fixação e coloração de células
<ol><li>Após a microinjecção, devolva as células a uma incubadora de CO2 e incubar a 37 ° c durante 1 h.</li>
	<li>Após a incubação, enxágüe as células três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente, correção por 20 min com paraformaldeído a 4% em tubos de 0,1 M pH 6,9 e lave três vezes com a temperatura ambiente PBS. Se apenas a localização de snRNA for analisada, enxague brevemente as células em água e monte em um meio de montagem com DAPI.</li>
	<li>Em caso de localização de proteínas adicionais, permeabilize as células com 0,5% Triton-X100 em PBS por 5 min à temperatura ambiente. Após três enxaguatórios com PBS, incubar as células com anticorpos primários e secundários e após lavagens finais em PBS e breve enxágüe em água, montagem em um meio de montagem com DAPI.</li>
</ol>5. microscopia
<ol><li>Se não imaged imediatamente após a montagem, armazene as corrediças em 4 ° c até a imagem latente.</li>
	<li>Adquira imagens usando um sistema microscópico high-end da fluorescência equipado com um objetivo da imersão (60X ou 100x/1.4 NA).</li>
	<li>Uma vez que as células microinjetadas são identificadas, coletar uma pilha de 20 seções z com 200 nm z passos por amostra e sujeitos a desvolução matemática. Projeções máximas ou pilhas z individuais foram então apresentadas.</li>
	<li>Para quantificar o sinal fluorescente, desenhe região de interesse (ROI) em torno de um corpo de Cajal identificado por imunomarcação de coilina. Meça a intensidade do sinal snRNA no ROI definido pela coilina. Em seguida determine a intensidade da fluorescência de snRNA no ROI coloc aleatòria no Nucleoplasm e calcule a relação do sinal do RNA no corpo e no Nucleoplasm de Cajal.</li>
</ol>

<ol><li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li>
<li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li>
<li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+bodies%3A+news+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curentr+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li>
<li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li>
<li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li>
<li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs%3A+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li>
<li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5%27-to-3%27+exonucleolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li>
<li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+U4%2FU6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado para determinar as seqüências importantes para a localização de snRNA em corpos nucleares de Cajal. Devido à preparação rápida e rather simples de RNAs etiquetado (preparação do molde do ADN pelo PCR seguido pela transcrição in vitro) o método oferece a análise eficaz de como as várias seqüências contribuem à localização do RNA. Em tempo relativamente curto, pudemos analisar dez diferentes exclusões ou substituições do snRNA U2 (referência5</sup...

A emenda do RNA é uma das etapas cruciais na expressão de Gene, que é catalisada por um grande complexo do ribonucleoprotein chamado o spliceosome. No total, mais de 150 proteínas e 5 RNAs nucleares pequenas (snrnas) são integrados no spliceossoma em estágios diferentes da via de emenda. U1, U2, U4, U5 e U6 snRNAs estão participando na emenda dos principais introns GU-AG. Estes snrnas juntam-se ao spliceossoma como partículas nucleares pequenas pré-formadas do ribonucleoprotein (snRNPs) que contêm snRNA, sete proteínas do SM associadas com o snRNA (ou proteínas de like-SM, que associam com o snRNA U6) e 1-12 proteínas específicas para cada snRNP.
A montagem de snRNPs envolve estágios citoplasmáticos e nucleares. O snRNA recentemente transcrito é exportado para o citoplasma onde adquire um anel montado a partir de sete proteínas SM. O anel SM, subsequentemente, serve como um sinal para snRNA re-importação de volta para o núcleo. SnRNAs defeituosos que não conseguem associar com proteínas SM são retidos no citoplasma1. Os snRNPs recém-importados aparecem pela primeira vez no corpo de Cajal, onde eles atendem às proteínas específicas de snRNP e terminam sua maturação (revisada na referência2,3). Nós mostramos recentemente que a inibição de etapas finais da maturação conduz ao sequestro de snRNPs imaturos em corpos de Cajal4,5. Nós propusemos um modelo onde a maturação final de snRNP esteja o controle de qualidade que monitora a adição de proteínas snRNP-específicas e a formação de snRNPs ativo. Entretanto, os detalhes moleculars de como as pilhas distinguem entre as partículas imaturas maduras e aberrantes corretamente montadas permanecem indescritível.
Para determinar as sequências de snRNA que são essenciais para o direcionamento e acúmulo de snrnas em corpos nucleares de Cajal, decidimos empregar microinjeção de snrnas rotulados com cDNAs. A microinjeção foi um método de escolha porque: 1) não requer uma tag de seqüência adicional para distinguir snRNAs sintéticos formam suas contrapartes endógenas que é especialmente importante para RNAs curtas com pouco espaço para inserção de seqüência de Tags extra; 2) permite a análise de sequências que são importantes para a biogênese. Por exemplo, a sequência SM é essencial para o conjunto do anel SM e re-importar para o núcleo6. Quando snRNAs são expressos na célula, snRNAs faltando a seqüência SM são degradadas no citoplasma e não atingem o núcleo e corpos Cajal7. Entretanto, snrnas sem a seqüência do SM pode diretamente ser injetado no núcleo e assim um papel potencial da seqüência do SM na localização do corpo de Cajal assayed.
Aqui, nós descrevemos em detalhe um método do microinjection que nós aplicamos para determinar as seqüências de snRNA necessárias para alvejar snRNAs no corpo5de Cajal. Nós mostramos que os locais obrigatórios do SM e do SMN são junto necessário e suficiente localizar não somente snRNAs mas vários RNAs não-codificando curtos no corpo de Cajal. Com base na microinjeção, bem como outras evidências, propusemos que o anel SM montado no local de ligação SM é o sinal de localização do corpo Cajal.

<table><tbody><tr><td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td><td>ThermoFisher</td><td>C11403</td><td>Concentração de estoque 1 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium - alta glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>Contendo 4.5 g&frasl; L D-glicose, vermelho de fenol e antibióticos</td></tr><tr><td>FemtoJet express Injetor</td><td>Eppendorf</td><td>5247000013</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td>Agulha de microinjeção de 0,5 &micro; m interno e 0,7 &micro; m diâmetro externo</td></tr><tr><td>Fluoromont G com DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>Concentração de estoque 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro gradeadas</td><td>Ibidi</td><td>10817</td><td>Lamínulas com grade, sem experiência direta com elas</td></tr><tr><td>InjectMan NI 2 Micromanipulador</td><td>Eppendorf</td><td>5181000017</td><td></td></tr><tr><td>m3-2,2,7G(5')ppp(5')G análogo de tampa trimetilada</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-853-1</td><td>Concentração de estoque 40 mM</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Kit de Transcrição</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de Cobertura de Microscópio 12 mm, No. 1</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>111520</td><td>Para trabalho de rotina</td></tr><tr><td>Óculos de Cobertura de Microscópio 12 mm, No. 1.5</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>117520</td><td>Para alta imagens de resolução</td></tr><tr><td>Microscópio DeltaVision</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Para aquisição de imagens</td></tr><tr><td>Microscópio DMI6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Para microinjeção</td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído a 32% Grau EM</td><td>EMS</td><td>15714</td><td>Dissolvido em TUBOS até a concentração final 4%</td></tr><tr><td>Fenol:Clorofórmio 5:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Primers para amplificação de U2: Forward: 5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Reverse: 5&agudo; TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>T7 sequência do promotor em itálico</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>BioLab</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>Concentração de estoque 40 mM</td></tr><tr><td>Isotiocianato de tetrametilrodamina Dextran 65-85</td><td>kDa Sigma-Aldrich</td><td>T1162</td><td>Dissolvido em água, concentração de estoque 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Serva</td><td>37240</td><td>Dissolvido em água, concentração de estoque 10%</td></tr></tbody></table>

análise da localização de snrna spliceosomal em células hela humanas usando microinjeção

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

A biogênese de snRNAs spliceosomal é um processo complexo envolvendo ambas as fases nuclear e citoplasmática e o último passo ocorre em um compartimento nuclear chamado corpo de Cajal. No entanto, as sequências que direcionam a localização de snRNA para esta estrutura subnuclear não foram conhecidas até recentemente. Para determinar seqüências importantes para a acumulação de snrnas em corpos de Cajal, nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado seguido por sua localização dentro das pilhas. Primeiramente, nós preparamos mutantes do apagamento de snRNA, moldes sintetizados do ADN para in vitro a transcrição e transcrito snRNAs na presença de UTP acoplado com Alexa488. Os snRNAs rotulados foram misturados com 70 kDa-Dextran conjugados com TRITC, e microinjetado no núcleo ou no citoplasma de células HeLa humanas. As células foram incubadas por 1 h e fixadas e a coilina do marcador do corpo de Cajal foi visualizada por imunofluorescência indireta, enquanto snRNAs e Dextran, que serve como marcador de injeção nuclear ou citoplasmática, foram observados diretamente com um microscópio de fluorescência. Este método permite o teste eficiente e rápido de como as várias seqüências influenciam a localização do RNA dentro das pilhas. Aqui, mostramos a importância da sequência de ligação SM para uma localização eficiente de snRNAs no corpo de Cajal.

Para monitorar a localização de snRNA e o papel do local obrigatório do SM na segmentação do corpo de Cajal, nós preparamos um molde do ADN que contem o promotor T7 e o snRNA U2 completo ou o snRNA U2 que faltam os sete nucleotídeos (auuuuug) que formam o local obrigatório do SM. os snRNAs foram transcritos in vitro, isolados e misturados com Dextran-70kDa acoplado ao TRITC. Nós injetado a mistura que contem in vitro o snRNA transcrito no núcleo ou no citoplasma de pilhas de Hela.
Foi mostrado...

A biogênese de snRNAs spliceosomal é um processo complexo envolvendo vários compartimentos celulares. Aqui, nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado a fim monitorar seu transporte dentro da pilha.

Análise da localização de snRNA Spliceosomal em células HeLa humanas usando microinjeção

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Aqui aplicamos microinjeção de RNAs fluorescentes para detectar sequências de RNA que são essenciais para a localização de RNAs nucleares curtas em estruturas nucleares chamadas corpos de Cajal. Esta técnica tem duas grandes vantagens. Primeiro, pode ser aplicado para RNAs curtas que são de outra forma difíceis de rotular e rastrear.E segundo, permite a triagem rápida de diferentes sequências e testes de seu papel na localização do RNA. Um dia antes da microinjeção, a semente HeLa ou outras células aderentes em coberturas de 12 milímetros para atingir 50% de confluência no momento da microinjeção. Para começar, coloque um coverlip preparado no centro de uma placa de Petri, adicione células e dois milímetros de mídia cultural.No dia seguinte, coloque a placa de Petri preenchida em um palco de microscópio. Usando um microcarregador, carregue três microlitadores da mistura de snRNA na agulha e instale a agulha no suporte do microinjetor em um ângulo de 45 graus em relação à superfície da placa de Petri. Use um objetivo de longa distância de 10X para encontrar a agulha.Primeiro, coloque a velocidade grosseira no injetor e baixe a agulha até que toque o meio de cultura. Usando os binóculos do microscópio, encontre o ponto brilhante que é o lugar onde a agulha toca o meio da cultura. Mude a velocidade para multar e baixar ainda mais a agulha enquanto olha para o microscópio até que a ponta da agulha seja observada.Mova a agulha no meio do campo visual e mude para um objetivo de longa distância de 40X. Depois disso, selecione a célula e mova a agulha acima da célula. Defina a pressão e o tempo para o contato celular.Mova a agulha para baixo na célula e, em seguida, definir o limite inferior do micromanipulador. Definir o limite inferior é a parte mais crítica do protocolo. Como a superfície do deslizamento não é perfeita e como cada célula é diferente, você terá que definir o limite inferior várias vezes durante a sessão de injeção.Em seguida, mova a agulha para trás acima da célula e pressione o botão de injeção no joystick do injetor. A agulha se moverá automaticamente dentro da célula para o local onde o limite é definido para injetar a mistura de RNA. Para finalizar, pressione o botão do menu no injetor e remova a agulha do suporte.Em seguida, desconecte o tubo do injetor antes de desligar o injetor e o micromanípulo. Após a microinjeção, devolva as células a uma incubadora de dióxido de carbono e incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, enxágue as células três vezes com PBS à temperatura ambiente.Fixar as células por 20 minutos com 4% de paraformaldeído em tubos molares de 0,1 em pH 6.9. Em seguida, lave as células três vezes com PBS de temperatura ambiente. Se apenas a localização do snRNA for analisada, enxágue brevemente as células na água e monte em um meio de montagem com DAPI.Em caso de localização adicional da proteína, permeabilize as células com 0,5% Triton X-100 em PBS por cinco minutos em temperatura ambiente. Enxágüe as células três vezes com PBS e manche-as com os anticorpos primários e secundários apropriados, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, enxágue três vezes com PBS e enxágue uma vez na água.Depois disso, monte as células em um meio de montagem com DAPI. Quando estiver pronto para a imagem, use um sistema microscópico de fluorescência high-end equipado com um objetivo de imersão para adquirir as imagens. Uma vez identificadas as células microinjetadas, colete uma pilha de seções de 20 Z com 200 passos de nanômetros Z por amostra e sujeito a desconvolução matemática.Para quantificar o sinal fluorescente, primeiro abra a imagem de microscopia no ImageJ e divida os canais em janelas. Sincronizar janelas pela ferramenta de janela sincronizar. Em seguida, desenhe a região de interesse em torno de um corpo de Cajal identificado por imunossuagem de coilina.Meça a intensidade do sinal de snRNA no ROI definido pela coilina. Determine a intensidade da fluorescência de snRNA no ROI colocada aleatoriamente no nucleoplasma. Economize valores medidos e calcule a razão de sinal de RNA no corpo de Cajal e nucleoplasma.Neste estudo, snRNAs fluorescentes são microinjetadas para monitorar seu transporte dentro da célula. Para testar se o local do SM é importante para o acúmulo de corpo de Cajal, o snRNA que não tem o local de SM é microinjetado diretamente no núcleo. A injeção no citoplasma serve como controle enquanto o snRNA de comprimento total é microinjetado para servir como um controle positivo.Após a incubação, as células microinjetadas são fixadas e a coilina do marcador corporal de Cajal é visualizada por imunofluorescência indireta. O snRNA de comprimento completo acumulado em corpos de Cajal após injeções nucleares e citoplasmáticas. Em contraste, o snRNA sem o local de SM permaneceu no citoplasma após a microinjeção neste compartimento, enquanto a microinjeção nuclear de snRNA sem o local SM revela que a sequência de ligação SM é importante para a localização do corpo de Cajal, pois este snRNA permanece no núcleo, mas não se acumula em corpos de Cajal.Às vezes, a microinjeção em apenas um compartimento celular falha e o Dextran 70 kilodalton pode ser encontrado tanto no núcleo quanto no citoplasma. Essas células são descartadas de análises posteriores. Apesar do fato de que os snRNAs fluorescentes rotulados são armazenados a 80 graus Celsius negativos antes da injeção, a degradação do RNA pode ocorrer.O snRNA degradado injetado no citoplasma não é transportado para o núcleo e permanece localizado no citoplasma. Tal snRNA deve ser descartado e novo snRNA deve ser sintetizado. É importante ajustar corretamente a injeção e compensar as pressões para o tipo de célula.E como dito antes, definir o limite inferior correto para injeção celular é essencial para uma boa microinjeção. Lembre-se que o fenol-clorofórmio usado durante o isolamento do RNA é perigoso e que a agulha de microinjeção é um objeto afiado. Tenha cuidado ao manusear esses materiais.

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Neurociência

Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e...

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Aqui nós descrevemos um ensaio que utiliza o poder da microinjeção juntamente com...

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

A hibridização in situ (ISH) de RNA permite a visualização de RNAs em células e tecidos. Aqui, mostramos como a combinação de RNAscope ISH com imuno-histoquímica ou corantes histológicos pode ser usada com sucesso para detectar mRNAs localizados em axônios em seções de cérebros de camundongos e humanos.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Aqui, descrevemos um em situ ensaio de hibridização que permite detecção sensível e específica de sequências tão curtas quanto 50 nucleótidos com single-nucleotide resolução a nível de célula única. O ensaio, que pode ser executado manualmente ou automaticamente, pode habilitar a visualização de variantes da tala, sequências curtas e mutações dentro do contexto de tecido.

Visualização de variantes genéticas, metas de curtas e mutações pontuais no contexto morfológico do tecido com um ensaio de RNA In Situ da hibridação

Este protocolo descreve as etapas necessárias para gerar um modelo de sistema em que a transcrição de um gene endógeno de interesse pode ser condicionalmente controlada em animais vivos ou células usando reforçada ALC repressor e/ou sistemas de ativador de tet .

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Para reproducibly contar os números dos mRNAs em oócitos individuais, fluorescência única molécula de RNA in situ hibridação (RNA-FISH) foi otimizada para células não-aderentes. Oócitos foram coletados, hibridizados com sondas específicas transcrição e quantificados usando um software de quantificação de imagem.

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Este protocolo apresenta uma ferramenta rápida e útil para avaliar o papel de uma proteína com função não caracterizada na regulação alternativa de emenda após o tratamento quimioterápico.

Usando a ferramenta E1A Minigene para estudar alterações de emenda mRNA

Este protocolo descreve um ensaio de repórter minigene para monitorar o impacto de mutações de 5'-splices no splicing e desenvolve snRNA supressor U1 para o resgate da inibição de emenda induzida por mutação. As construções de snRNA do repórter e supressor U1 são expressas em células HeLa, e o splicing é analisado por extensão de primer ou RT-PCR.

Um ensaio celular baseado em repórter para monitorar a eficiência do splicing

Este protocolo descreve a preparação detalhada e de baixa entrada da amostra para sequenciamento de núcleo único, incluindo a dissecção de gânglios cervicais e estelares superiores do rato, dissociação celular, criopreservação, isolamento do núcleo e bar codificação de hashtag.

Isolamento de núcleo de baixa entrada e multiplexing com anticorpos de código de barras de ganglia simpatizante do rato para sequenciamento de RNA de núcleo único

Aprenda a técnica de microinjeção de snRNAs marcados com fluorescência em células HeLa para estudar a localização nuclear em corpos de Cajal. Este método permite rastrear moléculas de RNA em células vivas e identificar sequências essenciais para o transporte correto.

Análise da localização de snRNA Spliceosomal em células HeLa humanas usando microinjeção

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