Deteção de parasitos extravascular do Trypanosoma pela aspiração fina da agulha

A citologia de aspiração de agulha fina é uma técnica barata, simples, rápida e minimamente invasiva que usamos para coletar trypanosomos de lesões palpáveis em órgãos em camundongos vivos. Dado que a aspiração da agulha fina é um procedimento não terminal, permite a amostragem repetida no mesmo animal ao longo do tempo. Se esses achados puderem ser traduzidos para o gado, esse método será muito útil para os veterinários diagnosticarem triplosomiase em bovinos em uma fazenda.

Demonstrando o procedimento de coloração de manchas será Ana Margarida Santos, tecnóloga assistente do meu laboratório. Para começar, confirme a anestesia com o método de beliscar o dedo do dedo do dedo. Quando o reflexo da retração da perna estiver ausente, posicione o rato na recência dorsal.

Empalidece cuidadosamente os testículos para determinar o tamanho e a distância da pele sobrelada e, em seguida, contê-lo entre o índice e o dedo médio ou entre o dedo indicador e o polegar. Para imobilizar ainda mais o alvo, estique a pele sobrelada firmemente e limpe a superfície com lenços umedecidos. Em seguida, insira a ponta da agulha de uma agulha de calibre 23 conectada a uma seringa de cinco mililitros no alvo certificando-se de que o êmbolo está no estado de descanso.

Para aplicar a sucção, retraia o êmbolo da seringa na marca de três a quatro milímetros de duas a três vezes. Para aumentar a probabilidade de obter uma amostra representativa e de direcionar estruturas menores como a epidídis, redirecione a agulha dentro do órgão em linha reta ou ao longo de várias tangentes diferentes. Solte a sucção e retire a agulha.

A agulha só pode ser removida depois que a pressão negativa for liberada soltando o êmbolo. Caso contrário, o aspirador é sugado para dentro da seringa e é irrecuperável. Aplique pressão com uma esponja de gaze estéril no local da punção para controlar qualquer sangramento.

Desconecte a seringa da agulha e encha-a com ar. Reconecte a agulha, coloque a ponta da agulha bem perto ou mesmo no slide e ejete suavemente o conteúdo da agulha sobre o slide. Para garantir a reprodução da amostragem, realize pelo menos uma aspiração adicional por órgão e animal.

Depois de reverter a anestesia com uma injeção subcutânea de 200 microlitres de um miligrama por quilo Atipamezole em soro fisiológico, devolva os animais à sua gaiola para recuperação. Usando a mão nondominante, pegue o slide que tem a gota de aspirado beliscando a extremidade fosca entre o polegar e o dedo indicador. Usando a mão dominante, pegue um slide de espalhador limpo e coloque-o suavemente borda limpa através do segundo slide apenas na parte superior da gota em um ângulo de aproximadamente 30 graus.

Para obter uma película fina, deslize o slide para a frente com um movimento contínuo e constante leve. Descanse o slide e deixe a secagem completa e rápida do material. Rotule a borda fosco do escorregador com um lápis.

Para o protocolo de coloração giemsa, conserte manchas secas de ar imergindo os slides em um frasco de Coplin contendo 100% de metanol por cinco minutos. Em seguida, transfira os slides para um frasco Coplin contendo solução 20% Giemsa e água destilada por 30 minutos. Enxágüe as lâminas na água da torneira e dab com papel de tecido para secar completamente.

Ao segurar o slide horizontalmente, aplique várias gotas de meio de montagem não diagante na mancha. Coloque a borda de um vidro de cobertura sobre o slide, baixe-a e pressione suavemente para remover quaisquer bolhas de ar. Para imunocitoquímica, fixar manchas secas de ar em 100% de metanol à temperatura ambiente por 10 minutos.

Lave o slide por cinco minutos em um frasco coplin com 1X PBS repetindo esta etapa três vezes usando pbs 1X fresco todas as vezes. Depois de remover os slides do frasco coplin, limpe o excesso de tampão sem tocar na mancha e desenhe uma linha ao redor da mancha com uma caneta repelente de água. Enquanto segura o slide horizontalmente, aplique 150 microliters de solução de anticorpos primários diluídos para cada mancha e incubar por uma hora à temperatura ambiente.

Após a incubação, lave os slides por cinco minutos em um frasco de Coplin com 1X PBS repetindo esta etapa três vezes usando PBS 1X fresco todas as vezes. Enquanto segura o slide horizontalmente, aplique 150 microliters de rabanete comercialmente disponível no sistema de visualização da DAB em cada mancha e, em seguida, incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Lave os slides novamente três vezes durante cinco minutos em PBS.

Em seguida, contra-manchar imergindo os slides em um frasco Coplin contendo hematoxilina Harris por 10 segundos. Enxágüe na água da torneira e dab com papel para secar completamente. Ao segurar o slide horizontalmente, aplique várias gotas de meio de montagem não diagante na mancha.

Coloque a borda de um vidro de cobertura sobre o slide, baixe-a e pressione suavemente para remover quaisquer bolhas de ar. Uma mancha de boa qualidade foi caracterizada por uma monocamada de células com boa densidade e características morfológicas preservadas permitindo a identificação de seu tecido de origem e proporção relativa entre si. Além disso, os parasitas eram eficientemente imunossuidentes, identificáveis e contáveis.

Os resultados de aspiração de agulha fina ruim ou negativa podem ser devido a pouco material e, portanto, sob representação da massa ou órgão. Também pode ser devido a muito material em um único slide fazendo manchas excessivamente grossas e prejudicando a avaliação citológica. O chamado artefato esmagado acontece devido a muita força sendo aplicada ao fazer a mancha sair para células rompidas resultando em muitos núcleos nus e listras de DNA.

Quando não há força suficiente durante a preparação da mancha, as células não desagregam resultando em uma camada estratificada que impede a avaliação das características morfológicas das células. Comparação da citopatologia da aspiração da agulha fina com a histopatologia, a citopatologia teve a vantagem de uma morfologia celular melhor preservada e melhor avaliação das proporções relativas e da contagem das células. A imunocitoquímica é mais simples, rápida e fácil de otimizar do que a imunohistoquímica.

Para aspiração fina da agulha, sempre garanta uma boa imobilização do animal, estabilização dos órgãos ou massa a ser aspirada, e uma aplicação e liberação coordenada de vácuo. Em seguida, para manchas de alta qualidade, espalhe-se imediatamente após o material ter sido colocado sobre o vidro e seja suave sobre a força aplicada para fazer a mancha para evitar artefatos esmagados por células. Além da microscopia de rotina e imunocitologia, este material também pode ser usado para microscopia eletrônica, análise bioquímica, citometria de fluxo, biologia molecular, ou mesmo para ensaios in vitro.

Essa técnica nos permitiu demonstrar que a aspiração de agulha fina pode ser usada para diagnosticar e estudar doenças em animais experimentais. Conseguimos diagnosticar o tropismo dos parasitas do Trypanosoma nos órgãos reprodutivos masculinos externos e também caracterizar essa doença ao longo da infecção.