Name: Purificação de plaquetas de sangue de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Aprenda a purificar plaquetas de sangue de rato usando gradiente de iohexol e centrifugação. Este método permite análise por citometria de fluxo e microscopia para estudar biologia plaquetária.

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Este trabalho foi apoiado por um financiamento de start-up de Cincinnati Children ' s Research Foundation e uma Universidade de Cincinnati Grant Pilot translational para M.N. Gostaríamos de agradecer o Cincinnati Children ' s Hospital pesquisa fluxo cytometry núcleo para seus serviços.

A coleta de sangue do rato deve ser conduzida com o cuidado animal institucional apropriado e aprovação do Comitê do uso.
Nota: O protocolo de purificação plaquetária é descrito em um diagrama de fluxo na Figura 1.
1. coleta de sangue
<ol><li>Adicionar 25 μL de 3,2% de citrato de sódio (pH 7,2) como anticoagulante e 0,4 mM de Gly-pro-ARG-pro (GPRP) num tubo de polipropileno.</li>
	<li>
Colete aproximadamente 200 μL de sangue do mouse C57BL/6 usando sangramento retro-orbital. Nota: o sangue pode ser coletado de qualquer tipo de estirpe do rato independentemente da idade ou sexo.<ol>
<li>Utilize 2 mL de isoflurano em qualquer tipo de câmara para anestesiar o rato. Nota: A profundidade da anestesia é verificada por sinais de respiração aumentada e diminuição do movimento. O rato não deve responder ao movimento da câmara de anestesia, ou a ser manuseado. Se o rato é responsivo ao movimento ou à manipulação, a seguir exige mais tempo para manter-se na câmara da anestesia.</li>
		<li>1.2.2 Abra a pálpebra direita ou esquerda do mouse e insira um tubo capilar de 7,5 cm (0,12 cm de diâmetro) no plexo vascular do olho.</li>
		<li>Gire o tubo capilar uma meia volta ao aplicar a pressão ao tubo capilar para quebrar os vasos e iniciar o fluxo sanguíneo. Segure o animal de cabeça para baixo sobre o frasco de coleta para ser preenchido por ação capilar.</li>
		<li>Uma vez que o volume de sangue apropriado é coletado, retire o tubo capilar e feche o olho aplicando a pressão suave para 30 s na pálpebra com gaze. Uma vez que o sangramento é interrompido, retorne o mouse para sua gaiola e monitor de sangramento.</li>
		<li>Verific os olhos para o traumatismo 1-2 dias após o sangramento retro-orbital. Retire qualquer rato do estudo mostrando sinais de trauma significativo para o olho, como resultado do procedimento e eutanizar. Nota: O rato não deve sofrer qualquer tipo de tratamento que possa inibir as plaquetas durante pelo menos duas semanas antes da recolha de sangue. A amostra de sangue deve ser usada para a purificação da plaqueta dentro de uma hora de sangrar o rato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificação de plaquetas
Nota: A purificação da plaqueta deve ser realizada à temperatura ambiente para evitar a sua degradação. Certifique-se de que a temperatura dos reagentes e dos instrumentos está entre 18 a 22 ° c. Para evitar a degradação plaquetária, a pipetagem rápida e a agitação vigorosa devem ser evitadas durante o procedimento.
<ol><li>Adicionar 600 μL de meio de gradiente iohexol (12% de iohexol em pó em 0,85% de cloreto de sódio, 5 mM de tricina, pH 7,2)11 em um tubo de 1,5 ml.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de amostra de sangue lentamente no lado do tubo na parte superior do meio de gradiente com uma ponta de pipeta de furo largo para que o sangue e o meio de iohexol não se misturem (Figura 2a).</li>
	<li>Centrifugue a amostra que contém o tubo em 400 x g por 20 min a 20 ° c em um rotor de balde oscilante com aceleração lenta e desaceleração.</li>
	<li>Colete a maior parte da camada rica em plaquetas e uma pequena fração de camada pobre em plaquetas (total de 300 a 400 μL) usando uma ponta de pipeta de furo largo sem perturbar as camadas de RBC e WBC (Figura 2b). Transfira a amostra de plaquetas para um novo tubo. Nota: Se a contagem de plaquetas for menor no sangue ou se for utilizado um volume menor de sangue, a camada rica em plaquetas e a camada pobre em plaquetas podem ser vistas como uma única camada.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de PBS à amostra de plaquetas, misturar invertendo e centrifugar a 800 x g durante 10 min a 20 ° c num rotor de balde oscilante. Elimine a solução completamente e adicione 200 μL de PBS para suspender as plaquetas com pipetagem ligeira. Nota: Esta etapa é opcional, pois remove o gradiente médio e as proteínas plasmáticas e aumenta a sensibilidade das plaquetas aos agonistas, como a trombina. Desde que as centrífugas diferentes têm programas diferentes, a aceleração/desaceleração lentas podem ser determinadas lendo o manual do usuário do centrifugador.</li>
	<li>Transfira 30 μL desta amostra para um novo tubo para contar as plaquetas. As plaquetas restantes podem ser usadas para ensaios bioquímicos e fisiológicos, como Ativação plaquetária, agregação, liberação de grânulos, etc.</li>
	<li>Para o RNA ou a extração da proteína, centrifugue a amostra da plaqueta em 800 x g por 10 minutos para pellet as plaquetas. Descarte o sobrenadante completamente sem perturbar o pellet. Adicione o volume desejado de RNA ou tampão de lise de proteína para lyse as plaquetas.</li>
</ol>3. contando as plaquetas
<ol><li>Contar todas as células sanguíneas sem diluição e plaquetas purificadas (diluídas de 2 a 5 vezes com PBS) utilizando um analisador automatizado de células. Use 30 a 50 μL de amostras para contagem.</li>
	<li>Calcule o número total de plaquetas multiplicando pelo volume da amostra.</li>
	<li>Calcule a percentagem de rendimento/recuperação de plaquetas purificadas.</li>
	<li>Contar o RBC e WBC na amostra de plaquetas purificada (diluído 50 a 100 vezes com PBS) com um hemocitômetro e microscópio.</li>
</ol>4. Ativação plaquetária
<ol><li>Em um tubo, adicione 1 a 2 milhões plaquetas purificadas em até 100 μL de tampão de coloração (PBS com 2% de soro bovino fetal, FBS).</li>
	<li>Para o número múltiplo de amostras, faça uma mistura mestra de anticorpos com 1 μL (0,5 mg/mL) do seguinte: PE-Cy7 rato anti-rato TER 119, PE rato CD45, FITC rato anti-rato CD41, e APC rato anti-rato/humano CD62P (P-Selectin) para detectar RBC, WBC, plaquetas, e plaquetas ativadas, respetivamente. Adicione a mistura mestra aos tubos para manchar as pilhas. Não adicione trombina.</li>
	<li>Em outro tubo, adicione 1 a 2 milhões de plaquetas purificadas em até 100 μL de tampão de coloração e peptídeo de 0,4 mM GPRP. Adicionar trombina para ativar as plaquetas e manchar as células seguintes passo 4,2. Nota: GPRP deve ser adicionado à amostra antes de adicionar trombina para evitar a formação de agregados ou coágulos através da ativação plaquetária. A concentração de trombina deve ser otimizada para obter boa ativação de plaquetas. Após a ativação plaquetária, contagens de eventos são diminuídas durante a aquisição de amostras por citometria de fluxo.</li>
	<li>Como um controle positivo, adicionar 1 μL de sangue total em até 100 μL de tampão de coloração em um tubo e 0,4 mM peptídeo GPRP. Adicionar trombina para ativar as plaquetas. Como controlo negativo, adicione 1 μL de sangue total em até 100 μL de tampão de coloração. Não adicione trombina na amostra de controle negativo. Manchar as células seguintes passo 4,2.</li>
	<li>Para controle de isotipo de citometria de fluxo, rótulo 5 tubos com não manchado, PE-Cy7, PE, FITC e APC. Adicionar 100 μL de tampão de coloração, 1 μL de sangue e 1 μL do respectivo anticorpo aos tubos rotulados para manchar as células.</li>
	<li>Incubar amostras para manchar por 30 min em temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Lave as amostras adicionando 1 mL de tampão de coloração a cada tubo. Centrifugue a 800 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Descarte o tampão de coloração com cuidado sem desalojar o pellet.</li>
	<li>Adicionar 300 μL de tampão de coloração a cada tubo, misturar suavemente e transferir para um tubo FACS. Armazene as amostras manchadas no escuro até que sejam analisadas com um citometro de fluxo.</li>
</ol>5. análises de citometria de fluxo de plaquetas
<ol><li>
Criar um novo experimento e gerar log Forward Scatter versus log Side dispersão de pontos e atribuir portões para Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (plaquetas) e CD62P APC (plaquetas ativadas) populações de acordo com a estratégia de gating escolhida para o experiência no software FACS DIVA.
	<ol>
<li>Abra a hierarquia de população escolhendo Mostrar hierarquia de população na guia populações . Edite a hierarquia populacional verificando a estratégia de gating e renomeando corretamente as portas.</li>
		<li>Abra a exibição de estatísticas escolhendo criar exibição de estatísticas. Edite a exibição de estatísticas de acordo com as preferências do usuário clicando com o botão direito na exibição de estatísticas e selecionando Editar exibição de estatísticas.</li>
		<li>Escolha uma cor para cada portão que aprimore o aspecto visual do layout clicando duas vezes na caixa correspondente à população.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na janela do Citometro , clique na guia parâmetros e ajuste as tensões para parâmetros para visualizar a população de interesse nas parcelas.</li>
	<li>Ajuste as tensões para cada um dos parâmetros para que a população negativa possa ser distinguida da população positiva. Antes de gravar as amostras para o controlo de compensação, verifique se os controlos positivos com uma única mancha estão em escala (certifique-se de que os picos positivos são visíveis e não demasiado distantes para a direita). Nota: Se os picos positivos estão fora de escala, as tensões devem ser ajustadas para ver as populações positivas.</li>
	<li>Registre as células manchadas de cor única para controles de compensação (sem manchas, PE-Cy7, PE, FITC e APC).</li>
	<li>Se as portas de controle positivo não estiverem configuradas corretamente, ajuste-as alterando as tensões.</li>
	<li>Vá para experimento &Gt; configuração de remuneração &Gt; calcular compensação. Escolha aplicar somente na janela resultante.</li>
	<li>Alterne para a planilha global clicando no botão de alternância na parte superior, à esquerda da janela da planilha.</li>
	<li>Carregar a amostra de controle positivo e adquirir células suficientes para ajustar a compensação e as portas.</li>
	<li>Carregue a amostra novamente e verifique se cada parcela mostra a população de células esperada com base no anticorpo manchado de fluorocromo. Adquira e registre 100.000 eventos para amostras de sangue total e 10.000 eventos para plaquetas purificadas. Carregue as amostras uma a uma até que a aquisição seja concluída.</li>
	<li>Analise os dados de citometria de fluxo com o software com parcelas e portões apropriados (Figura 3)</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram conflito de interesse.

Comumente, as plaquetas são isoladas por centrifugação de baixa velocidade que produz plasma rico em plaquetas que contém um número significativo de células sanguíneas, detritos celulares e proteínas plasmáticas que podem interferir com os ensaios e necessidades bioquímicas e fisiológicas purificação mais adicional21. Portanto, é importante usar um método rápido e simples que pode produzir plaquetas puras sem grandes contaminantes. O protocolo aqui apresentado descreve a purificação de plaquetas d...

As plaquetas são um componente do sangue que funciona como um iniciador de coagulação do sangue em resposta a danos no vaso sanguíneo. Eles se reúnem no local da lesão para ligar a parede do vaso1. As plaquetas são fragmentos de anucleato de citoplasma derivados dos megacariócitos da medula óssea a influência da Trombopoietina e entram na circulação2. Eles são considerados metabolicamente ativos e capazes de detectar o ambiente extracelular ativando cascatas de sinalização intracelular que resultam em espalhamento de plaquetas, agregação e formação de plugue hemostático1,3. Além de hemostasia/trombose e cicatrização de feridas4, as plaquetas desempenham um papel importante nas respostas inflamatórias hospedeiras, angiogênese e metastatis3,5,6,7, o 8.
As plaquetas são purificadas do sangue para estudar as suas propriedades bioquímicas e fisiológicas, que devem ser livres de outros componentes sanguíneos. Desde que os glóbulos vermelhos (RBC) e glóbulos brancos (WBC) contêm significativamente mais RNA e proteínas do que as plaquetas9,10, a presença de mesmo um pequeno número destas células pode interferir com a análise transcriptômicos e proteômica de RNA e proteínas derivadas de plaquetas. Nós encontramos que as plaqueta purified ativaram com o anticorpo da ligação da trombina tal como o anti-GPIIb/IIIa (JON/A) e o anti-P-Selectin mais eficientemente do que plaquetas de sangue inteiras.
Uma vez que as plaquetas são frágeis, é importante tratar as amostras o mais suavemente possível. Se as plaquetas forem ativadas, elas liberam o conteúdo do grânulo e, em última análise, degradam. Portanto, para manter as propriedades funcionais das plaquetas intactas, é importante manter a quiescência plaquetária durante o isolamento. Vários protocolos descreveram o isolamento de plaquetas de humanos, cães, ratos e primatas não humanos por vários métodos1,10,11,12. Alguns dos métodos requerem várias etapas como a coleta de plasma rico em plaquetas por centrifugação, filtração por coluna de separação, seleção negativa de plaquetas com RBC-e anticorpo específico para WBC conjugado com grânulos magnéticos, e assim por diante, que são consome muito tempo e pode degradar as plaquetas e o seu conteúdo.
Ford e seus colegas descreveram a purificação da plaqueta do sangue humano usando o meio do iohexol11. Este método utiliza um volume semelhante de amostra de sangue e meio durante a purificação. Uma vez que os seres humanos produzem um maior volume de sangue, é relativamente fácil de purificar as plaquetas.
O iohexol é um meio inerte de gradiente de densidade universal que é livremente solúvel em água e utilizado no fracionamento de ácidos nucleicos, proteínas, polissacarídeos e nucleoproteínas13,14. Tem baixa osmolaridade e é não-tóxico, tornando-se assim um meio ideal para a purificação de células vivas intactas11. É um meio não particulado; Conseqüentemente, a distribuição das pilhas em um inclinação pode ser determinada usando o Hemocytometer, o cytometer do fluxo, ou o Espectrofotômetro. Não interfere com a maioria da reação enzimática ou química das células ou fragmentos celulares após a diluição.
O rato serve como um modelo animal importante para muitas doenças humanas15,16, 17,18. Há alguns artigos publicados que descrevem a purificação de plaquetas de camundongo19,20. No entanto, o mouse produz um volume relativamente menor de sangue, o que torna difícil para purificar as plaquetas. Se o mesmo pequeno volume de meio de gradiente e amostras de sangue é usado, a camada plaquetária não pode ser claramente separada da camada de RBC-WBC após a centrifugação. Neste artigo, nós descrevemos um método rápido e simples da purificação da plaqueta do rato com o meio do inclinação do iohexol do três-dobra mais relativo ao volume da amostra de sangue e à centrifugação de baixa velocidade. Também ativamos as plaquetas purificadas com trombina e investimos sua qualidade com citometria de fluxo e microscopia.

<table><tbody><tr><td>APC rato anti-camundongo/humano CD62P (P-selectina)</td><td>Thermoscientific</td><td>17-0626-82 Marcador de</td><td>ativação de plaquetas</td></tr><tr><td>Tubo Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-166</td><td>Tubo para centifuge</td></tr><tr><td>FACS DIVA software</td><td>BD Biosciences</td><td>Item não catalogado</td><td>Análise de plaquetas e</td></tr><tr><td>tubo FACS</td> de sangue total <td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>Tubos para fluxo citomtério</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Ingrediente para tampão de coloração</td></tr><tr><td>FITC rato anti-camundongo CD41</td><td>BD Biosciences</td><td>553848</td><td>Marcador de plaquetas</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td>Item não catalogado</td><td>Análise de plaquetas e sangue total</td></tr><tr><td>Software FlowJo</td><td>FlowJo, Inc.</td><td>Item não catalogado</td><td>Análise de plaquetas e sangue total</td></tr><tr><td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td><td>EMD Millipore</td><td>03-34-0001</td><td>Previne a formação de coágulos plaquetários</td></tr><tr><td>Hematócrito Tubo capilar</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362566</td><td>Tubo capilar de coleta de sangue</td></tr><tr><td>Hemavet</td><td>Drew Scientific</td><td>Item não catalogado Analisador de</td><td>células sanguíneas</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Hausser Câmara de</td><td>contagem de células</td>Scientific <td>3100</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Uso para anestesiar microscópio de camundongo</td></tr><tr><td>(Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Item não catalogado</td><td>Monitoramento e contagem de células</td></tr><tr><td>Nycodenz (Histodenz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td>Gradiente médio</td></tr><tr><td>PE rato anti-rato CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>561087</td><td>marcador WBC</td></tr><tr><td>PE-Cy7 rato anti-rato TER 119</td><td>BD Biosciences</td><td>557853</td><td>marcador RBC</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta 200 &micro; L, de diâmetro largo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-1A</td><td>Transferência de amostras de sangue e plaquetas</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta 1000 &micro; L, furo largo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-2C</td><td>Transferência de amostras de sangue e plaquetas</td></tr><tr><td>Fosfato buffured salino (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>Tampão para lavagem e diluição</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Soro fisiológico</td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-688-26</td><td>Anticoagulante</td></tr><tr><td>Tampão de coloração</td><td>Interno</td><td>Item não catalogado</td><td>Tampão de lavagem e diluição</td></tr><tr><td>Água estéril</td><td>Interno</td><td>Item não catalogado</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>Centrífuga de rotor de balde oscilante</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Enzyme Research Laboratoty</td><td>HT 1002a</td><td>Agonista de ativação plaquetária</td></tr><tr><td>Tricina</td><td>Tampão Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td>para meio Nycodenz</td></tr></tbody></table>

purificação de plaquetas de sangue de rato

Purification of Platelets from Mouse Blood

As plaquetas são purificadas de sangue total para estudar as suas propriedades funcionais, que devem estar livres de glóbulos vermelhos (RBC), glóbulos brancos (WBC) e proteínas plasmáticas. Nós descrevemos aqui a purificação das plaquetas do sangue do rato usando o meio do inclinação Three-Fold mais iohexol relativo ao volume e à centrifugação da amostra de sangue em um rotor balançando da cubeta em 400 x g por 20 minutos em 20 ° c. A recuperação/rendimento das plaquetas purificadas foi de 18,2-38,5%, e as plaquetas purificadas encontravam-se em estado de repouso, o que não continha nenhum número significativo de RBC e WBC. As plaquetas purificadas tratadas com trombina apresentaram até 93% de ativação, indicando sua viabilidade. Nós confirmamos que as plaqueta purified são suficientemente puras usando a avaliação cytometric e microscópica do fluxo. Estas plaquetas podem ser usadas para a expressão gênica, ativação, liberação de grânulos, agregação e ensaios de aderência. Este método pode ser usado para a purificação de plaquetas do sangue de outras espécies também.

O resumo da purificação plaquetária é descrito em um diagrama de fluxo (Figura 1). As etapas incluem a coleção do sangue do rato usando o sangramento retro-orbital na presença de um anticoagulante, adição da amostra de sangue no meio do inclinação do iohexol, centrifugação em um rotor balançando da cubeta em 400 x g por 20 minutos em 20 ° c. A qualidade das plaquetas purificadas foi avaliada com microscopia e citometria de fluxo após coloração com anticorpo para detecção de células ...

Aqui, o sangue do rato foi coletado na presença de um anticoagulante. As plaquetas foram purificadas por meio de gradiente iohexol utilizando centrifugação de baixa velocidade. As plaquetas foram ativadas com trombina para investigar se eram viáveis. A qualidade das plaquetas purificadas foi analisada por citometria de fluxo e microscopia.

Purificação de plaquetas de sangue de rato

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

As plaquetas devem estar livres de células sanguíneas e proteínas ao estudar suas propriedades bioquímicas e fisiológicas. Por isso, desenvolvemos um protocolo para purificar plaquetas do sangue do rato. Esta técnica pode purificar plaquetas usando centrífugo de gradiente iohexol de média e baixa velocidade, resultando em uma clara separação de plaquetas de outros componentes sanguíneos.Para purificar as plaquetas, use uma ponta de pipeta larga para a camada 200 microliters de sangue inteiro recém-colhido lentamente ao lado de um tubo de 1,5 mililitro em 600 microliters de meio gradiente iohexol sem misturar. Após a centrifugação em um rotor de balde balançando para isolar as plaquetas, use uma nova ponta de pipeta larga para coletar a maior parte da camada rica em plaquetas e uma pequena fração da camada pobre plaqueta sem aspirar a célula sanguínea branca ou a camada de glóbulos vermelhos. Adicione a amostra plaqueta a um novo tubo e adicione um mililitro de PBS às plaquetas.Misture as plaquetas por inversão antes de realizar outra centrifugação. Em seguida, resuspenja a pelota em 200 microliters de PBS com tubulação leve. Para ativação plaquetária, transfira de uma a duas vezes 10 para as seis plaquetas para um novo tubo contendo 100 microliters de tampão de coloração.Adicione uma a duas vezes 10 às seis plaquetas a um tubo diferente contendo 100 microliters de tampão de coloração complementados com peptídeo GPRP de 0,4 mililitro. Adicione trombina ao tubo com o peptídeo GPRP para ativar as plaquetas e adicione o coquetel de anticorpos de interesse a ambos os tubos. Como um controle positivo, adicione um microliter de sangue inteiro em até 100 microliters de tampão de coloração em um tubo contendo peptídeo GPRP de 0,4 milimiliar, e adicione trombina para ativar essas plaquetas.Como controle negativo, adicione um microliter de sangue inteiro em até 100 microliters de tampão de coloração. Em seguida, manche ambos os tubos de controle com o coquetel de anticorpos. Após 30 minutos em temperatura ambiente no escuro, lave as amostras com um mililitro de tampão de coloração fresco por tubo.Resuspenja as pelotas em 300 microliters de tampão de coloração fresco. Em seguida, transfira as amostras de células para tubos individuais de análise de citometria de fluxo protegidos da luz. Para analisar as plaquetas por citometria de fluxo, crie um novo experimento e gere dispersão logarítmica para frente versus parcelas de pontos de dispersão lateral logarítmica.Depois de ajustar as tensões conforme necessário, registo as células manchadas de cor única para os controles de compensação. Agora execute a amostra de controle positivo para adquirir células suficientes para ajustar a compensação e os portões. Em seguida, adquira e registe 100.000 eventos para cada amostra de sangue inteira, e analise os dados de citometria de fluxo usando as parcelas e portões apropriados.Se o sangue for adicionado ao meio lentamente, o meio gradiente iohexol e a amostra de sangue formarão duas camadas separadas no tubo. Após a centrifugação, a camada superior, cor de palha, contém o plasma, mas sem células sanguíneas intactas. A segunda camada, esbranquiçada e rica em plaquetas contém a maioria das plaquetas.A terceira camada transparente é a camada pobre em plaquetas e está diretamente acima dos glóbulos vermelhos e da pelota de glóbulos brancos. O sangue inteiro exibe populações distintas de glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas em uma dispersão logarítmica para frente versus parcela de pontos de dispersão lateral. As plaquetas purificadas, no entanto, demonstram uma população distinta com um número insignificante de glóbulos vermelhos ou brancos.Amostras de sangue inteiro contêm glóbulos vermelhos ter119 positivos e populações de glóbulos brancos cd45 positivos que estão quase ausentes em amostras de plaquetas purificadas. Plaquetas purificadas não tratadas expressam quase nenhum marcador de ativação confirmando seu estado de descanso, enquanto plaquetas tratadas com trombina purificadas normalmente demonstram uma expressão de 71% P-selectin. A avaliação microscópica de amostras de plaquetas purificadas não tratadas não revela nenhuma agregação plaqueta.Após a ativação com trombina, no entanto, as plaquetas demonstram uma agregação robusta, confirmando ainda mais sua viabilidade após a purificação como demonstrado. Coloque a amostra de sangue cuidadosamente no meio do iohexol, e ao coletar as plaquetas, certifique-se de aspirar cuidadosamente para não coletar as camadas de glóbulos vermelhos e de glóbulos brancos para uma purificação de plaquetas bem sucedida. Este método também pode ser usado para purificação de plaquetas de outras espécies.As plaquetas purificadas podem ser usadas para estudos de expressão genética, ativação, agregação, liberação de grânulos e adesão.

purification-of-platelets-from-mouse-blood

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica para a diferenciação de megacariócitos e a formação de plaquetas. As células-tronco progenitoras hematopoiéticas - isoladas do sangue do cordão umbilical humano - diferenciam-se em megacariócitos maduros na presença de trombopoietina. Os megacariócitos maduros produzem extensões citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dão origem a plaquetas individuais.

Um método in vitro para a diferenciação de megacariócitos e formação de plaquetas

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para purificação de plaquetas de sangue total murino e sua subsequente ativação com o agonista plaquetário trombina. Quando analisadas com citometria de fluxo, as plaquetas purificadas em repouso são caracterizadas com base na expressão de seu marcador de superfície celular CD41, enquanto as plaquetas ativadas purificadas co-expressam os marcadores de superfície CD41 e CD62P.

Purificação e ativação de plaquetas do sangue total murino

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de neutrófilos citotóxicos de alta densidade e neutrófilos de baixa densidade do sangue de um camundongo portador de tumor por centrifugação descontínua com gradiente de sacarose.

Isolamento de neutrófilos citotóxicos de sangue de camundongo portador de tumor

Leucócitos e plaquetas do sangue pode ser usado como um marcador de saúde bioenergética geral de um indivíduo e assim têm potencial para controlar processos patológicos e o impacto de tratamentos. Aqui nós descrevemos um método para isolar e medir a função mitocondrial e do burst oxidativo nestas células.

Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

Uma população altamente pura de megacariócitos pode ser Obtida de cordão hemoderivados CD34+ células. Um método para CD34+ diferenciação de isolamento e megacariócito célula está descrita aqui.

Megacariócito diferenciação e formação de plaquetas de humanos cabo hemoderivados CD34 células+

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Apresentado aqui é um protocolo para anexar peptídeo CD47 (pepCD47) a stents metálicos usando química polifosfosfonato. A funcionalidade dos stents metálicos utilizando pepCD47 impede o apego e ativação de células inflamatórias, melhorando assim sua biocompatibilidade.

Mitigação do apego de células transmitidas sanguíneas a implantes metálicos através da imobilização de peptídeos derivados do CD47

Este método descreve a purificação por citometria de fluxo de MEP e MKp de fêmures, tíbias e ossos pélvicos.

Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

Este protocolo descreve em detalhes todas as etapas envolvidas na obtenção de progenitores hematopoiéticos derivados de leucofilter e sua diferenciação in vitro e maturação em megacaiócitos portadores de proplatelet que são capazes de liberar plaquetas no meio da cultura. Este procedimento é útil para uma análise aprofundada dos mecanismos celulares e moleculares que controlam a megacaripoiese.

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Diferenciação e Formação de Plaquetas

A formação de plaquetas pró-coagulantes tem sido correlacionada com um risco aumentado de trombose. Apresenta-se aqui um protocolo preciso para isolar plaquetas lavadas do sangue humano, destinado a quantificar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas, que são características distintivas das plaquetas pró-coagulantes.

Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

O metabolismo plaquetário é de interesse, particularmente no que se refere ao papel da hiper e hipoatividade plaquetária no sangramento e distúrbios trombóticos. O isolamento de plaquetas do plasma é necessário para alguns ensaios metabólicos; Apresentamos aqui um método para isolamento de metabólitos intracelulares de plaquetas lavadas.

Preparação de plaquetas humanas lavadas para estudos quantitativos de fluxo metabólico

Aprenda a purificar plaquetas de sangue de rato usando gradiente de iohexol e centrifugação. Este método permite análise por citometria de fluxo e microscopia para estudar biologia plaquetária.

Purificação de plaquetas de sangue de rato

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