Name: Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a purificar proteínas de massa molecular elevada em Streptococcus mutans usando PCR e cromatografia de afinidade. Este método eficiente evita reações enzimáticas complexas e pode ser adaptado para outras espécies bacterianas.

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Este trabalho foi apoiado pela sociedade japonesa para a promoção da ciência (JSPS) (números de subvenção 16K15860 e 19K10471 para T. M., 17K12032 a M. I., e 18K09926 a N. H.) e a Fundação de ciência e tecnologia da SECOM (SECOM) (número de subvenção 2018.09.10 n º 1).

Nota: Geração de S. mutans ∆gtfc, em que toda a região codificadora do gene gtfc é substituída por SPCr, deve ser completada antes da realização desses protocolos. Consulte o artigo publicado para obter detalhes sobre a geração5.
1. projeto da primeira demão
<ol><li>
Prepare primers para a construção de S. mutans his-gtfc. Nota: As sequências de primer utilizadas neste protocolo são mostradas na tabela 1. Método de PCR de fusão em duas etapas para a geração de S. mutans his-gtfc é esquematicamente ilustrado na Figura 2.<ol>
<li>Primers de design(gtfc-Reverse e SPCr-Forward) para a fixação de sua seqüência de codificação de Tags, interpor entre o gene gtfc e o SPCr (Figura 2a).<ol>
<li>Inclua o vinculador GS e sua sequência de codificação de tag em ambos os primers Gtfc-Reverse e SPCr-Forward, nos quais 24 bases nas regiões 5 ' são complementares entre si. Nota: a seqüência do aminoácido do vinculador GS e sua Tag (Gly-Gly-Gly-Gly-ser-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-</li>
			<li>Projete um primer gtfc-forward para direcionar o gene gtfc no genoma de S. mutans WT > 1 KB a jusante do gene e o SPCr-Reverse primer para atingir a região de flanqueamento a jusante do SPCr no S. mutans ∆gtfc. Ajuste a temperatura dederretimento 8 (Tm) dos primers gtfc-Forward e SPCr-reverso para combinar com as temperaturas de derretimento do gtfc-reverso e do SPCr- primers Forward, respectivamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Projete primers aninhados (aninhados-Forward e Nested-reverso) para o segundo PCR (Figura 2b).</li>
		<li>Primers do projeto (Gtfc-para diante e colônia-reverso) específicos para o ADN genomic do transformante (Figura 2C; os primers são usados para a PCR da colônia). Nota: Os amplicões straddle a beira entre gtfc e SPCr. O primer Gtfc-Forward pode ser aplicado como primer dianteiro.</li>
		<li>Projete primers (up-Forward e para baixo-reverso) para a confirmação final da geração de S. mutans his-gtfc (Figura 2C; o produto do PCR amplificado pelos primers é usado para arranjar em seqüência do ADN).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. extração de DNA genômica de S. mutans
Nota: Cada cepa de S. mutans deve ser cultivada em meio de infusão de coração cerebral (BHI) a 37 ° c em condições anaeróbias. As cepas mutantes de s. mutans ∆Gtfc e s. mutans his-gtfc são cultivadas em BHI suplementado com 100 μg/ml de Spectinomicina.
<ol><li>Streak s. Mutans WT e s. mutans ∆gtfc separadamente para cada uma das placas de agar BHI. Incubar-os durante a noite a 37 ° c.</li>
	<li>Escolha colônias únicas de s. Mutans WT ou s. mutans ∆gtfc usando um palito esterilizado e inoculado em 1,5 ml de caldo BHI. Incubar-os durante a noite a 37 ° c. Nota: As colônias podem ser usadas como fonte de DNA de modelo para a primeira PCR (etapa 3,1).</li>
	<li>Transfira 1 mL de cada cultura bacteriana para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a cultura por 1 minuto em 15.000 x g.</li>
	<li>Retire o sobrenadante e adicione 1 mL do tampão Tris-EDTA (pH 8,0) para suspender o pellet celular.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão durante 1 min a 15.000 x g. Retire o sobrenadante. Ressuscitem o pellet celular em 50 μL de tampão Tris-EDTA (pH 8,0).</li>
	<li>Aqueça a suspensão usando uma incubadora do bloco por 5 minutos em 95 ° c. Centrifugar a suspensão durante 5 min a 15.000 x g.</li>
	<li>Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (o sobrenadante servirá como DNA de modelo para a primeira PCR).</li>
</ol>3. amplificação do PCR
Nota: A tabela 1, tabela 2e tabela 3 resumem os primers, reagentes e ciclos de amplificação de PCR, respectivamente.
<ol><li>Realize a primeira PCR utilizando o genoma s . Mutans WT e s. mutans ∆gtfc como modelos de PCR. Amplificar as regiões abrigando a parte a jusante do gene Gtfc e aqueles que abriam o SPCr usando os primers descritos na etapa 1.1.1.2 (Figura 2a).</li>
	<li>Electrophorese cada produto do PCR no gel do agarose de 1%. Extirpar os fragmentos de DNA desejados de aproximadamente 1.000 BP e 2.000 BP. purifique os fragmentos dos géis usando o método de extração de gel baseado em membrana de sílica. Nota: Os procedimentos básicos para o PCR9, a electroforese10do gel do ADN, e a purificação11 do ADN são detalhados em outra parte.</li>
	<li>Realize uma segunda PCR utilizando os produtos da primeira PCR (aproximadamente equimolar) como modelos de PCR com os primers aninhados-Forward e Nested-reverso (Figura 2b).</li>
	<li>Electrophorese um décimo da mistura do PCR no gel do agarose. Confirme a geração do amplicon apropriado de aproximadamente 3.000 BP.</li>
	<li>
Precipitate o produto restante do PCR. Nota: a purificação do produto do PCR não é necessária, porque os amplicões não específicos gerados pelo segundo PCR não interferem com o recombination homous.<ol>
<li>Adicionar água nuclease-livre à mistura de PCR e trazer o volume total para 100 μL, seguido por 0,1 volume (10 μL) de 3 M de acetato de sódio (pH 5,2) e 2,5 volumes (250 μL) de etanol absoluto. Misture e guarde a mistura durante 10 min à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Centrifugue a amostra durante 20 min a 15.000 x g a 4 ° c. Descarte o sobrenadante. Adicione 1 mL de 70% de etanol para lavar o pellet de DNA.</li>
		<li>Centrifugue a amostra durante 5 min a 15.000 x g a 4 ° c. Descarte o sobrenadante. Secar ao ar e dissolver o pellet de DNA com 10 μL de água sem nuclease.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. transformação celular
<ol><li>Prepare o WT s. Mutans competente para introduzir o segundo produto de PCR seguindo os passos descritos na publicação anterior5. Armazene as células a-80 ° c. Nota: Para este experimento, as células de s. Mutans WT já foram preservadas em-80 ° c para gerar s. mutans ∆gtfc.</li>
	<li>Misturar 5 μL do segundo produto de PCR concentrado para a alíquota de 50 μL de células de gelo-frias competentes congeladas anteriormente. Adicione a mistura em cubos de electroporação. Dê um único pulso elétrico (1,8 quilovolts, 2,5 ms, 600 Ω, 10 μF) às pilhas usando o instrumento do Electroporation.</li>
	<li>Ressuscitem as células em 500 μL de caldo BHI. Imediatamente, espalhe 10 – 100 μL da suspensão para as placas de agar BHI contendo Spectinomicina. Incubar as placas por 2 – 6 dias a 37 ° c até que as colônias tenham crescido suficientemente para serem colhidas.</li>
</ol>5. verificação darecombinação e do armazenamento de Gome
<ol><li>Realize PCR de colônia, usando primers gtfC-Forward e Colony-Reverse para a tela para a recombinação. Electrophorese cada produto do PCR da colônia em um gel do agarose. Confirme o fragmento de DNA de aproximadamente 1.500 BP.</li>
	<li>Escolha uma das colônias positivas usando um palito esterilizado e subcultura as células durante a noite em 2 mL de caldo BHI contendo Spectinomicina.</li>
	<li>Misture 0,8 mL de cultura bacteriana com 0,8 mL de glicerol de 50% estéril e estoque a-80 ° c ou-20 ° c.</li>
	<li>Transfira os restantes 1 mL de suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Repita os passos 2.3 – 2.7 para extrair o DNA genómico das células.</li>
	<li>Execute o PCR usando os primers up-Forward e down-Reverse e o ADN genomic como um molde. Repita o passo 3,2 para purificar o produto de ADN amplificado dos géis.</li>
	<li>Determine a seqüência do ADN do amplicon purified pelo sequenciamento do ADN. Nota: Certifique-se de confirmar a geração de S. mutans his-gtfc por sequenciamento de DNA.</li>
</ol>6. purificação de polyhistidine-Tagged GTF-SI
<ol><li>Streak S. mutans his-gtfc em uma placa de agar BHI contendo Spectinomicina. Incubar-os durante a noite a 37 ° c.</li>
	<li>Pegue uma única colônia usando um palito esterilizado e células de subcultura em 3 mL de caldo BHI. Incubar durante a noite a 37 ° c.</li>
	<li>Prepare dois frascos cônicos com 1 L de caldo BHI sem Spectinomicina. Inocular 1 mL da suspensão da cultura durante a noite em 1 L do caldo BHI. Incubar durante a noite a 37 ° c.</li>
	<li>Concentrado de proteínas do sobrenadante de cultura por precipitação de sulfato de amônio. Nota: extrato de corpos celulares se uma proteína alvo é intracelular. Os procedimentos básicos para a precipitação do sulfato do amónio são detalhados em outra parte12.<ol>
<li>Centrifugue a suspensão da cultura bacteriana durante 20 min a 10.000 x g a 4 ° c. Recupere o sobrenadante de cultura em uma taça de vidro de 3 litros.</li>
		<li>Adicionar 1.122 g de sulfato de amônio a 2 L do sobrenadante (80% de saturação) com agitação vigorosa utilizando um agitador magnético. Deixe o precipitado formar por 4 h ou mais a 4 ° c com agitação. Nota: a formação do precipitado pode ser continuada durante a noite.</li>
		<li>Centrifugue a solução precipitada com sulfato de amónio a 15.000 x g durante 20 min a 4 ° c. Decantar o sobrenadante.</li>
		<li>Colete o precipitado com uma espátula e transfira para uma taça de vidro de 200 mL. Ressuscita os pellets em 35 mL de tampão de ligação (50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 5 mm imidazol, pH 8,0).</li>
		<li>Dialyze a suspensão de encontro a 2.500 mL do tampão de ligação usando uma tubulação regenerada da diálise da celulose, em 4 ° c, com agitação. Substitua a solução de diálise após 2 h e continue a diálise durante a noite.</li>
		<li>Substitua novamente a solução de diálise. Continuar a Dialize para um adicional de 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugue a suspensão Dialítica a 20.000 x g durante 10 min a 4 ° c. Filtre o sobrenadante através de um filtro de membrana usando equipamento de filtração por sucção. Transfira o filtrado para um balão de 75 cm2 .</li>
	<li>Fractionate o GTF-SI polyhistidine-etiquetado da suspensão filtrada pela cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC).
	<ol>
<li>Transfira 2 mL da pasta de resina IMAC com carga de Ni (aproximadamente 1 mL de resina) para uma coluna cromatográfica cuja saída é montada em um tubo de silicone. Remova a solução de armazenamento pelo fluxo de gravidade. Atenção: Não deixe a resina secar ao longo do IMAC.</li>
		<li>Adicionar 3 mL de água destilada na coluna para lavar a resina. Adicionar 5 mL do tampão de ligação para equilibrar a resina.</li>
		<li>Desligue o fluxo com um galo pitada Hoffmann. Adicione 5 mL da suspensão filtrada da etapa 6,5 para fazer a pasta.</li>
		<li>Adicione toda a pasta à suspensão filtrada restante. Agitar suavemente a mistura durante 30 min a 4 ° c.</li>
		<li>Coloque a mistura de volta na coluna. Retire a suspensão pelo fluxo de gravidade. Lave a resina IMAC com 20 mL de tampão de ligação. Nota: Ajuste a vazão para aproximadamente 2 mL/min com um pau de pinça Hoffmann em todo o IMAC subsequente.</li>
		<li>Elute o GTF-SI de recombinação com 20 mL do amortecedor da eluição (50 milímetro NaH2po4, 300 milímetro NaCl, 500 milímetros imidazole, pH 8,0). Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. O eluato deve ser conservado a 4 ° c. A resina IMAC pode ser reutilizada. Consulte as instruções para a resina IMAC.</li>
	</ol></li>
	<li>Substitua o tampão de eluição pelo tampão de armazenamento (tampão fosfato de 50 mM, pH 6,5) e concentre a solução de GTF-SI recombinante em aproximadamente 1 mL utilizando uma unidade de ultrafiltração centrífuga. Armazene a solução de GTF-SI recombinante a 4 ° c. Nota: Confirme a purificação polyhistidine-etiquetada de GTF-si usando SDS-PAGE13 e western blotting14 empregando um anticorpo monoclonal antipolihistidina peroxidase-conjugated do rábano. Adição de CHAPS (concentração final, 0,1%) ao eluente pode ser exigido para evitar a adsorção não específica à unidade, dependendo da proteína do alvo.</li>
</ol>7. restauração funcional por GTF-SI recombinante
<ol><li>Raia cada s. Mutans tensão em uma placa de agar BHI individualmente. Incubar as placas durante a noite a 37 ° c.</li>
	<li>Usando um palito esterilizado, pegue uma única colônia para inocular em 2 mL de caldo BHI. Incubar durante a noite a 37 ° c.</li>
	<li>Use 20 μL da cultura overnight de S. mutans ∆gtfc para inocular 2 ml de caldo BHI contendo 1% de sacarose sem antibióticos em um tubo de ensaio de vidro. Adicione o GTF-SI ou um volume equivalente do veículo à cultura S. mutans ∆gtfc , e cultura as células com o tubo colocado em uma posição inclinada durante a noite. Nota: Esterilize a solução de GTF-si com um filtro estéril da seringa e determine a concentração da proteína usando um ensaio ácido ácido da proteína15 antes de usar.</li>
	<li>Agitar as suspensões de cultura com um misturador de vórtice para 10 s. decantar as suspensões. Lave os tubos de ensaio com uma quantidade suficiente de água destilada.</li>
	<li>Manchar os biofilmes na parede do tubo com 1 mL de 0,25% de azul brilhante de Coomassie (CBB).</li>
	<li>Decantar a solução de coloração após 1 min. Lave os tubos de ensaio com uma quantidade suficiente de água destilada. Ar-seque os tubos de ensaio.</li>
</ol>

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+3rd+Edition%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
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<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
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<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O projeto de primers é o passo mais crítico do protocolo. As sequências dos primers gtfc-Reverse e SPCr-Forward foram automaticamente determinadas com base nas sequências da região final de 3 ′ do gtfc e da região final de 5 ′ do SPCr. Cada primer inclui 24 bases complementares que codificam um vinculador GS e uma sequência de codificação his-tag em suas 5 ' regiões. O rompimento das seqüências reguladoras nativas situadas nas regiões flanqueando ascendentes pode ...

A análise de um gene ' a função de s envolve geralmente a comparação de traços fenotípicos de estirpes do selvagem-tipo às tensões em que o gene do interesse foi interrompido. Uma vez que a estirpe de gene-disrupted é produzida, a adição exógena do produto do gene permite a restauração funcional.
O método mais comum para a obtenção de produtos gênicos purificados necessários para os ensaios subsequentes de restauração é a realização de expressão heteróloga em Escherichia coli1. No entanto, a expressão de proteínas de membrana ou proteínas de alta massa molecular é muitas vezes difícil usando este sistema1. Nestes casos, a proteína alvo é geralmente isolada das células que sintetiza nativamente a proteína através de uma série complexa de etapas, o que pode levar à perda do produto genético. Para superar estas edições, um procedimento simples foi desenvolvido para a purificação do produto do gene que segue um método2do rompimento do gene, método de emenda PCR-baseado do ADN3 (PCR designado da fusão da dois-etapa), e Electroporation para genético transformação em Streptococcus mutans. A adição de uma etiqueta do polyhistidine (His-tag) ao C-Terminus do produto do gene facilita sua purificação pela cromatografia de afinidade imobilizada do metal (IMAC).
Para isolar a estirpe his-tag-expressando, o ADN genomic inteiro do gene do interesse (neste seu-Tag-expressando a tensão gene-disrupted) é substituído com um gene antibiótico-resistente do marcador. O procedimento para gerar o seu-Tag-expressando strainis quase idêntico àquele para gerar uma tensão gene-interrompida como descrita previamente4,5. Conseqüentemente, os métodos para o rompimento do gene e o isolamento do produto do gene devem ser executados como experimentos seriais para a análise funcional.
No presente trabalho, uma seqüência de codificação de polihistidina é anexada à extremidade 3 ′ do gene Gtfc (GenBank Locus tag SMU_1005), codificando glucosyltransferase-si (GTF-si) em S. mutans6. Em seguida, foram realizados estudos de expressão em espécie estreptocócica. Conseguir a expressão heterólogo de gtfc por E. coli é difícil, provável por causa da massa molecular elevada de GTF-si. Esta estirpe chama-se S. mutans his-gtfc. Uma ilustração esquemática que descreve a organização da gaveta do gene da resistência de gtfc e de espectinomicina (SPCr)7 loci em Wild-Type s. mutans (s. mutans WT) e seus derivados é mostrado em Figura 1. O GTF-SI é uma proteína secretora que contribui para o desenvolvimento do biofilme dental cariogênico6. a presença de sacarose, um biofilme aderente é observado em uma superfície de vidro liso na estirpe de WT s. mutans , mas não na estirpe de s. mutans gtfc-disrupted (s. mutans Δgtfc)2,5 . A formação de biofilme é restaurada em S. mutans Δgtfc após adição exógena do GTF-si recombinante. A cepa, S. mutans his-gtfc, é então usada para produzir o GTF-si recombinante.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Nippon Genetics</td><td>NE-AG02</td><td>Para eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Sistema de cultura anaeróbica</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal Anti-His-Tag</td><td>MBL</td><td>D291-7</td> Kit de ensaio de proteína BCA <td>conjugado com HRP</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>Medição da concentração</td></tr> <tr><td>de proteínaCaldo de infusão cérebro-coração</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Meio de cultura bacteriana</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Para coloração de biofilme</td></tr><tr><td>Unidade de ultrafiltração centrífuga</td><td>Sartorius</td><td>VS2032</td><td>Substituição de tampão e concentração de proteínas</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Kubota</td><td>7780II</td><td></td></tr><tr><td>Coluna cromatográfica</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>Para</td></tr><tr><td>a braçadeira de membrana de diálise</td><td>IMAC Fisher marca</td><td>21-153-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de diálise</td><td>Como um</td><td>2-316-06</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerase</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>Sequenciamento de DNA polimerase de alta fidelidade</td></tr><tr><td></td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL substrato</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5060</td><td>Para western blotting</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M pH 8,0)</td><td>Wako</td><td>311-90075</td><td>Preparação de tampão Tris-EDTA</td></tr><tr><td>Cubeta de eletroporação</td><td>Bio-Rad</td><td>1652086</td><td>0,2 cm de folga</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Solução EtBr</td><td>Nippon Gene</td><td>315-90051</td><td>Para eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>Cortador de banda de gel</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Gel kit de extração</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>Extração de DNA de gel de agarose</td></tr><tr><td>Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>29083461</td><td>Para SDS-PAGE e western blotting</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Wako</td><td>095-00015</td><td>Tampão de ligação e preparação do tampão de eluição</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Nippon Medical & Instrumentos Químicos</td><td>EZ-022</td><td>Configuração de temperatura: 4 &graus; </td></tr><tr><td>C Incubadora</td><td>Nippon Medical & Instrumentos Químicos</td><td>LH-100-RDS Configuração de</td><td>temperatura: 37 &graus; C</td></tr><tr><td>Filtro de membrana</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td>0.2 &micro; </td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td> de diâmetro <td>m Kubota</td><td>3740</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Preparação de tampão de ligação e tampão de eluição</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>192-02815</td><td>Preparação de tampão de ligação e tampão de eluição</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>Preparação de tampão de ligação e tampão de eluição</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Wako</td><td>015-06737</td><td>Precipitação de sulfato de amônio</td></tr><tr><td>Resina carregada com Ni</td><td>Bio-Rad</td><td>1560133</td><td>Para IMAC</td></tr><tr><td>Primers de PCR</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Proteína personalizada</td><td></td></tr><tr><td>padrão</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0381</td><td>Para SDS-PAGE e western blotting</td></tr><tr><td>Aparelho de filtração de solvente</td><td>As One</td><td>FH-1G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomicina</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibióticos; use a 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Filtro de seringa estéril</td><td>Merckmillipore</td><td>SLGV004SL</td><td>0,22 &micro; m de diâmetro</td></tr><tr><td>Streptococus mutans &#916; gtfC</td><td>Cepa de estoque no laboratório.</td><td></td><td>gtfC substituído por spcr</td></tr><tr><td>Streptococus mutans Cepa de estoque UA159</td><td>no laboratório.</td><td></td><td>S. mutans ATCC 700610, estirpe selvagem</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Para desenvolvimento de biofilme</td></tr><tr><td>TAE (50 &vezes)</td><td>Nippon Gene</td><td>313-90035</td><td>Para eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8,0)</td> <td>Wako</td><td>314-90065</td><td>Tris-EDTA preparação de tampão</td></tr></tbody></table>

purificação de uma proteína de massa molecular elevada em streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

O elucidation da função de um gene envolve tipicamente a comparação de traços fenotípicos de estirpes e de tensões do selvagem-tipo em que o gene do interesse foi interrompido. A perda da função que segue o rompimento do gene é restaurada subseqüentemente pela adição exógena do produto do gene interrompido. Isso ajuda a determinar a função do gene. Um método descrito anteriormente envolve a geração de uma cepa de Streptococcus mutans com ruptura de gene gtfc . Aqui, um método não exigente é descrito para purificar o produto do gene Gtfc da estirpe de S. mutans recém-gerada após o rompimento do gene. Envolve a adição de uma seqüência da polyhistidine-Coding na extremidade 3 do ′ do gene do interesse, que permite a purificação simples do produto do gene usando a cromatografia de afinidade imobilizada do metal. Não são necessárias reações enzimáticas para além da PCR para a modificação genética neste método. A restauração do produto genético por adição exógena após o rompimento genético é um método eficiente para determinar a função gênica, que também pode ser adaptada a diferentes espécies.

A Figura 3 mostra o tamanho de cada amplicon a partir da primeira PCR (Figura 3a) e da segunda PCR (Figura 3B). O tamanho de cada amplicon correspondeu ao tamanho previsto, conforme descrito na tabela 1. A figura 4a mostra S. as colônias de mutans transformadas com o segundo produto do PCR e chapearam nas placas do agar de BHI que contêm o spect...

Descrito aqui é um método simples para a purificação de um produto genético em Streptococcus mutans. Esta técnica pode ser vantajosa na purificação de proteínas, especialmente proteínas de membrana e proteínas de massa molecular elevada, podendo ser utilizada com várias outras espécies bacterianas.

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da microbiologia, como, como um produto genético difícil de expressar em E.Coli purifica. As principais vantagens dessa técnica são que nenhuma reação enzimática, além do PCR, é o portador, e aplicações comuns para purificação de proteínas podem ser usadas. Embora este método possa fornecer uma visão sobre a purificação de proteínas em estreptococos mutans, também pode ser um informado para outras espécies de microbiota.Demonstrando o procedimento será o Dr.Mamiko Yamashita, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Após o projeto de primer e extração genômica de DNA de estreptococo mutans, realize o primeiro PCR usando o estreptococo mutans do tipo selvagem e o genoma de estreptococos rompidos como os modelos PCR. Amplie as regiões que abrigam a parte a jusante do gene gtfC e aquelas que abrigam o gene de resistência à especttinomicina usando o gtfC-forward preparado e o primer reverso e o primer spc r-forward e reverso.Em seguida, eletroforese cada produto PCR em gel de 1%agarose. Use um cortador de banda de gel para extirpa os fragmentos de DNA desejados de aproximadamente 1.000 pares de base e 2.000 pares de base do gel em tubos de microcentrifuuge. Adicione 500 microliters de tampão solubilizador em cada tubo e incuba-os por 10 minutos a 56 graus Celsius para dissolver as fatias de gel.Purifique os fragmentos usando o método de extração de gel à base de membrana de sílica. Execute um segundo PCR usando os produtos do primeiro PCR como modelos PCR com os primers aninhados e invertidos aninhados. Quando o segundo produto PCR não pode ser confirmado por eletroforese, outro par de primer aninhado deve ser projetado.eletroforese cinco microlitres da mistura PCR no gel de agarose. Confirme a geração do amplicon apropriado de aproximadamente 3.000 pares de base pela imagem de coloração de gel de brometo de ethidium e prossiga de acordo com o manuscrito. Agora, misture cinco microliters do segundo produto PCR concentrado ao aloquot de 50 microliteres de células de estreptococos de frio e frio e competente, congeladas anteriormente.Adicione a mistura em uma cuvette de eletroporação e coloque a cuvette na câmara de cuvette do aparelho de eletroporação. Dê um único pulso elétrico de 1,8 quilovolts, 600 ohms e 10 microfarádis por 2,5 milissegundos para as células. Adicione 500 microliters de caldo de infusão cérebro-coração na cuvette.Espalhe imediatamente de 10 a 100 microlitadores da suspensão em placas de infusão cérebro-coração contendo espectincina. Incubar as placas por dois a seis dias a 37 graus Celsius até que as colônias tenham crescido o suficiente para serem recolhidas. Após a geração de estreptococo mutans sequência de codificação de polihistidina incorporada tensão e inoculação durante a noite sem espectinomicina de acordo com o manuscrito, centrífuga a suspensão da cultura bacteriana por 20 minutos a 10.000 vezes g a quatro graus Celsius.Transfira a cultura supernante para um copo de vidro de três litros. Para concentrar as proteínas da cultura supernasteante, coloque o supernanato de dois litros em um agitador magnético e comece a mexer vigorosamente. Adicione 1.122 gramas de sulfato de amônio e deixe que o precipitado se forme com agitação vigorosa a quatro graus Celsius durante um período de quatro horas ou durante a noite. Próximo.centrífugas a solução precipitada de sulfato de amônio a 15.000 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Decantar o supernatante. Com uma espátula, pegue o precipitado e transfira-o para um copo de vidro de 200 mililitros.Resuspenda as pelotas em 35 mililitros de tampão de ligação. Em seguida, transfira cada um aproximadamente 25 mililitros da suspensão para um tubo de diálise de celulose regenerada. Coloque a tubulação de diálise em 2,5 litros do amortecedor de ligação em um agitador a quatro graus Celsius para dilisar a suspensão.Substitua a solução de diálise após duas horas e continue a diálise durante a noite. Em seguida, transfira a suspensão dialisada da tubulação para tubos de centrífuga e coloque os tubos na centrífuga a 20.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Com o equipamento de filtragem da seção, despeje o supernascer sobre um filtro de membrana de 0,2 micrômetro para filtrar.Transfira o filtrado para um frasco de 75 mililitros. Para fracionar o gtfSI marcado por polihistidina da suspensão filtrada, primeiro prepare uma cromatografia de afinidade metálica imobilizada. Depois de equilibrar a resina de acordo com o manuscrito, feche o pau de beliscar Hoffman.Adicione cinco mililitros da suspensão filtrada na coluna para fazer um chorume. Em seguida, transfira todo o chorume para a suspensão filtrada restante e gire a mistura suavemente por 30 minutos a quatro graus Celsius. Coloque a mistura de volta na coluna.Abra o pau de beliscar Hoffman para remover a suspensão pelo fluxo de gravidade. Lave a resina IMAC com 20 mililitros de tampão de ligação e, em seguida, elute 20 mililitros de tampão de elução para obter o gtfSI recombinante. Depois disso, carregue o eluato em um tubo de ultra filtração centrífugas e centrifugar a solução a 2.000 vezes g por um a cinco minutos para concentrar a solução.Esvazie o recipiente de filtragem e adicione 15 mililitros de tampão de armazenamento no tubo. Centrifugar a amostra novamente e repetir o processo duas vezes adicionais. A solução gtfSI recombinante está finalmente concentrada em aproximadamente um mililitro.Transfira o concentrado para um tubo de microcentrifuagem e armazene a quatro graus Celsius. Continue com o protocolo de restauração funcional restante. Neste protocolo, a eletroforese do gel agarose mostra que o tamanho de cada amplicon do primeiro PCR e do segundo PCR correspondia ao tamanho previsto.As colônias de estreptococos mutans foram transformadas com o segundo produto PCR e banhadas nas placas de infusão cérebro-coração que continham espectinicina. Os produtos de PCR colônia executados no gel de agarose mostram que cada amplicon era do tamanho previsto. A proteína purificada com cromatografia de afinidade metálica imobilizada foi observada como uma única banda pela SDS-PAGE.A mancha ocidental, executada usando o anticorpo anti-polihistidina, confirmou que a banda observada era a proteína esperada com marca de polihistidina de 160 kilodaltons. A capacidade de formação de biofilme derivado da sacarose só foi vista com estreptococo mutans do tipo selvagem e estreptococo mutans His-gtfC, que formou um biofilme aderente na parede do tubo na presença de 1% de sacarose. Isso não foi observado em estreptococos mutans delta gtfC.No entanto, a adição de 25 microgramas do gtfSI recombinante restaurou a capacidade de formação de biofilme aderente em estreptococo mutans delta gtfC. Uma vez que o sucesso deste método depende da segunda amplificação pcr, o segundo produto PCR deve ser confirmado por eletroforese. Já a proteína do tipo histidina obtida por este método também está se reunindo para ácidos funcionais, como interações proteína-proteína.Após seu desenvolvimento, essa técnica, em combinação com a disrupção genética, abriu caminho para pesquisadores do campo da microbiologia explorarem a função genética.

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Fonte: Murata, T., et al. Purificação de uma proteína de alta massa molecular em Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para a purificação de uma proteína marcada com poli-histidina secretada por Streptococcus mutans.

Um procedimento para a purificação de uma proteína marcada com poli-histidina de Streptococcus mutans

A abordagem bioquímica é descrita a identificação in vivo de interacções proteína-proteína (PPI), de proteínas de membrana. O método combina a proteína de ligação cruzada, de purificação por afinidade e espectrometria de massa, e é adaptável para quase qualquer tipo de célula ou organismo. Com esta abordagem, embora a identificação de IPP transientes torna-se possível.

Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana In Vivo

É descrito um método para a purificação eficiente de proteínas de fusão duplo-Strep-marcados e os seus complexos específicos de estreptavidina modificada (Strep-Tactin) resina covalentemente reticulado com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). O método tem as vantagens de alta velocidade, uma boa recuperação da proteína alvo e de elevada pureza, e é compatível com a análise subsequente por espectrometria de massa.

Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

Polipeptídeos Elastina-like são biopolímeros de estímulo-responsivo com aplicações que vão desde a purificação da proteína recombinante para a entrega da droga. Este protocolo descreve a purificação e caracterização de polipeptídeos elastina semelhantes e suas fusões de péptido ou proteína a partir de Escherichia coli utilizando o seu comportamento crítico de transição de fase inferior temperatura da solução como uma alternativa simples, a cromatografia.

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

A prolina-prolina endopeptidase-1 (PPEP-1) é uma metaloprotease secretada e um alvo promissor do patógeno humano Clostridium difficile. Aqui descrevemos todos os métodos necessários para a produção e determinação da estrutura desta proteína.

Produção, cristalização e determinação da estrutura de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD

Este protocolo descreve um método da purificação para a proteína obrigatória tag-livre de recombinação do cálcio S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos para ensaios humanos da estimulação do monocyte.

Purificação do S100A12 humano e seus Oligomers íon-induzidos para a estimulação imune da pilha

Este artigo descreve uma metodologia para superexpressar Nsp15 recombinante, uma nuclease tóxica, em um sistema de expressão C41 (DE3), seguido de purificação da proteína marcada utilizando cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas tóxicas desafiadoras.

Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli

Este protocolo descreve um método rápido e reprodutível de extração e precipitação à base de solvente orgânico para purificar polipeptídeos semelhantes a elastina (ELP) de Escherichia coli, oferecendo uma alternativa potencialmente escalável aos métodos convencionais de purificação de ELP.

Purificação eficiente de polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs) de E. coli usando um método de extração e precipitação à base de solvente orgânico

Aprenda a purificar proteínas de massa molecular elevada em Streptococcus mutans usando PCR e cromatografia de afinidade. Este método eficiente evita reações enzimáticas complexas e pode ser adaptado para outras espécies bacterianas.

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

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