Name: In vivo localização de imunofluorescência para avaliação de anticorpo terapêutico e diagnóstico biodistribuição em pesquisa de câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda o método IVIL para avaliar a biodistribuição de anticorpos terapêuticos e diagnósticos em modelos de câncer em tempo real. Esta técnica permite visualizar o comportamento dos anticorpos em animais vivos, superando as limitações dos métodos ex vivo convencionais.

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Agradecemos ao Dr. Andrew Olson (serviço de microscopia de neurociência de Stanford) para discussões e uso de equipamentos. Agradecemos ao Dr. Juergen K. willmann pela sua orientação. Este estudo foi apoiado pela concessão de NIH R21EB022214 (KEW), pela concessão do treinamento de NIH R25CA118681 (KEW), e pelo NIH K99EB023279 (KEW). O serviço de microscopia de neurociência de Stanford foi apoiado pela NIH NS069375.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo painel administrativo institucional de cuidados com animais de laboratório (APLAC) da Universidade de Stanford.
1. modelo transgênico do rato do desenvolvimento do cancro da mama
<ol><li>Observe os camundongos do modelo de câncer desejado para o crescimento tumoral apropriado por meio de palpação ou medição de paquímetro antes de prosseguir. Nota: o modelo murino transgênico de desenvolvimento do câncer de mama (FVB/N-TG (MMTV-PyMT) 634Mul/J) (MMTV-PyMT) foi utilizado. Estes animais desenvolvem espontaneamente carcinomas de mama invasivos entre 6 e 12 semanas de idade em cada glândula mamária20. As glândulas mamária normais foram usadas como controles dos littermates transgene-negativos, idade-combinados.</li>
</ol>2. injeção intravenosa de agentes de anticorpos específicos e não específicos
<ol><li>Purify o coelho anti-rato B7-H3 e anticorpos do controle do isotipo do coelho IgG em uma coluna de dessalinização (por exemplo, PD-10) para remover conservantes e amortecedores de armazenamento depois das instruções do fabricante. Nota: alguns anticorpos podem necessitar A purificação mais adicional com o protocolo baseado21das contas do agarose da proteína-A.</li>
	<li>Dosagens alíquotas de 33 μg de cada conjugado de anticorpos em tubos de microcentrífuga individuais. Nota: dosagem do agente administrado pode variar dependendo da aplicação e coincide com as dosagens em que o conjugado de anticorpos é usado rotineiramente. A concentração das soluções de anticorpos é necessária se o volume for superior a 100 μL para a segurança dos animais.</li>
	<li>No ponto de tempo desejado antes da colheita do tecido, aqui 96 h, anestesiar o tumor que carrega o animal com o isoflurano de 2% que flui no oxigênio em 2 L/min, e coloc em um estágio aquecido de 37 ° c. Faça uma pitada do dedo do pé para certificar-se que o nível apropriado de anesthsia estêve alcangado antes do procedimento.</li>
	<li>Para se preparar para a inoculação da veia cauda das soluções de anticorpos, desinfete a cauda do animal limpando três vezes com uma limpeza de álcool. Dilatar as veias da cauda por aquecimento com uma almofada de calor para aproximadamente 30 s. Evite aquecer todo o animal. Limpe a cauda mais uma vez com uma limpeza de álcool depois de remover a almofada de calor.</li>
	<li>Usando um cateter da veia da cauda 27G, introduza a agulha da borboleta em uma das duas veias laterais da cauda e fixe-a com cuidado a cauda com a agulha introduzida ao estágio com uma parte de fita cirúrgica. Nota: o refluxo de sangue visível no cateter indica a localização correcta da agulha na veia da cauda.</li>
	<li>Lave o cateter com 25 μL de soro fisiológico tamponado com tampão fosfato (PBS) e, em seguida, injete a solução de anticorpos no cateter utilizando seringas de insulina. Lave o cateter mais uma vez com 25 μL de PBS estéril.</li>
	<li>Retire a agulha da cauda e aplique pressão para parar qualquer sangramento.</li>
	<li>Desligue a anestesia e observe o animal até que esteja totalmente acordado para qualquer sinal de angústia.</li>
</ol>3. coleta e preparação de tecidos-alvo do tumor
<ol><li>No ponto de tempo desejado, humanamente eutanizar o animal de acordo com o procedimento institucional aceitável, aqui, por inalação gradual de 100% CO2 de um tanque de gás comprimido com uma taxa de fluxo de deslocamento de câmara de 10-30% volume/min. Nota: algumas aplicações da técnica do ivil exigem a eutanásia pela perfusão cardíaca com PBS para remover livremente o anticorpo19,22de circulação.</li>
	<li>Após a confirmação da eutanásia humana através da cessação do movimento respiratório e cardíaco, falta de resposta pitada de dedo do pé, e envelhecimento de membranas mucosas, tecidos de tumor de consumo usando tesouras cirúrgicas e fórceps como segue:<ol>
<li>Coloque o mouse na posição supina e agarrando apenas a camada externa da pele entre o conjunto de glândulas mamárias mais próximas à cauda (5th) com fórceps, fazer uma pequena incisão com um par de tesouras cirúrgicas.</li>
		<li>Introduza a tesoura fechada no corte e abra lentamente a ponta para separar cuidadosamente a pele da membrana da parede abdominal subjacente mantendo-a intacta.</li>
		<li>Faça uma incisão vertical até o abdômen, continuando a separar a pele da membrana interna. Entre as glândulas mamárias 3RD e 4, faça um corte horizontal em todo o abdômen para permitir a retração da pele e visualização dasglândulas mamárias . Nota: os tumores e as glândulas mammary são situados superficialmente a pele.</li>
		<li>Agarrando cada tumor ou glândula normal com fórceps, corte com cuidado afastado a pele unida usando tesouras cirúrgicas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloc tecidos extirpados em moldes da base descartáveis do tecido, pré e enchido com o meio de incorporação ideal da temperatura de corte (OCT) e congele os moldes rapidamente pela colocação no gelo seco. A fim de estudar a entrega fora do alvo, o consumo de outros tecidos ou órgãos de interesse(por exemplo, o fígado ou pulmões). Nota: para pausar o protocolo neste ponto, armazene blocos congelados do tecido em-80 ° c até que esteja pronto para prosseguir.</li>
	<li>Usando um criostat, seção de blocos de tecido congelado a 10 μm de espessura e colocar seções adjacentes em slides de vidro de aderência pré-rotulados. Observação: para pausar o protocolo neste ponto, armazene slides em-80 ° c até que esteja pronto para prosseguir.</li>
</ol>4. protocolo de coloração ex vivo
Nota: para a comparação quantitativa entre as imagens de microscopia de fluorescência, todas as lâminas são manchadas ao mesmo tempo com as mesmas soluções preparadas.
<ol><li>Enxágüe slides de tecido congelado com temperatura ambiente PBS por 5 min para remover OCT.</li>
	<li>Demarcar secções de tecido com uma caneta de barreira hidrofóbica para reduzir o volume de soluções necessárias durante a coloração. Nota: tenha cuidado para não permitir que a caneta funcione sobre as amostras de tecido, pois pode remover o tecido do slide ou evitar a coloração adequada na porção do tecido afetado. Não permita que as secções de tecido se deshidratem a qualquer momento.</li>
	<li>Fixar as secções de tecido com solução de paraformaldeído a 4% durante 5 min.</li>
	<li>Enxágüe slides em PBS por 5 min.</li>
	<li>Seções de tecido permeabilizar com 0,5% Triton-X 100 em PBS por 15 min.</li>
	<li>Enxágüe slides em PBS por 5 min.</li>
	<li>Bloqueie os tecidos com 3% p/v de albumina sérica bovina (BSA) e 5% v/v de soro de cabra, ambos em PBS (solução de bloqueio) por 1 h à temperatura ambiente. Nota: Combine o soro da solução de obstrução ao animal secundário do anfitrião do anticorpo.</li>
	<li>Enxágüe slides em PBS por 5 min.</li>
	<li>Incubar as seções com anticorpos primários de manutenção de registros como desejado, possivelmente um nuclear comum (por exemplo, DAPI), vascular (por exemplo, CD31), ou marcador citoplasmático (por exemplo, actina). Aqui, rato CD31 (marcador vascular) em uma diluição 1:100 foi usado de acordo com as instruções do fabricante na solução de bloqueio durante a noite a 4 ° c protegida da desidratação em uma bandeja deslizante. Nota: Não adicione anticorpos primários ou conjugadas de anticorpos adicionais. O conjugado que foi injetado e permitiu acumular-se nos tecidos in vivo atuam como o anticorpo primário.</li>
	<li>Enxágüe slides em PBS por 5 min três vezes, mudando o PBS cada vez.</li>
	<li>Incubar lâminas com anticorpos secundários para rotular anticorpos primários. Para esta aplicação, visualize o anticorpo anti-B7-H3 usando AlexaFluor-546 anticorpo anti-coelho de cabra conjugada (1:200 diluição, otimizado de acordo com as instruções do fabricante) e CD31 com AlexaFluor-488 cabra anti-Rat anticorpo secundário (1:200 diluição, otimizada de acordo com as instruções do fabricante) na solução de bloqueio, protegida da luz e desidratação em uma bandeja de slides, por 1 h à temperatura ambiente. Nota: os anticorpos secundários são do mesmo animal hospedeiro, mas correspondem à afinidade dos anticorpos secundários às espécies hospedeiras do respectivo anticorpo primário. Os slides são protegidos da luz a partir deste ponto em diante.</li>
	<li>Enxágüe slides em PBS por 5 min três vezes, mudando o PBS cada vez.</li>
	<li>Aplique uma gota do meio de montagem no centro da fatia do tecido e coloc com cuidado um lamela que evita o aprisionamento de bolhas de ar.</li>
	<li>Sele as bordas da lamínula com verniz de unha claro e deixe secar. Observação: para pausar o protocolo por até uma semana neste momento, armazene slides em-20 ° c até que esteja pronto para prosseguir.</li>
</ol>5. imagem de microscopia confocal e análise quantitativa de imagens
Nota: a preparação dos parâmetros de microscópio e imagem confocal dependerá do sistema confocal utilizado. O microscópio usado aqui foi comprado comercialmente (por exemplo, sistema de meta Zeiss LSM 510) e o software de aquisição associado foi usado (por exemplo, Zen 2009). Entretanto, muitas destas etapas aplicar-se-ão a todo o microscópio confocal e supõem o conhecimento básico da microscopia confocal.
<ol><li>Depois que o sistema for ligado e aquecido, selecione o objetivo desejado; aqui foi utilizado um objetivo de 20x (abertura numérica = 0,8).</li>
	<li>Carregar um slide de controle positivo, lamela para baixo, para permitir a definição da otimização para o sinal mais brilhante. Imagem latente no canal vermelho, focalize o sistema na amostra no modo vivo da imagem latente.</li>
	<li>Para cada canal de laser usado, otimize a intensidade do laser, o ganho mestre, e o tamanho do furo de pino como segue:<ol>
<li>Mude para o modo contínuo para imagens.</li>
		<li>Otimize a intensidade do laser (que controla o poder do laser) e o ganho (Mestre) (que controla a tensão para o tubo do photomultiplicador) barras de corrediça ao monitorar o histograma da tabela de look up (LUT). Ajuste essas duas configurações até que o intervalo dinâmico do histograma seja preenchido sem saturar pixels. Observação: se a intensidade do laser for muito alta, o fotobranqueamento ocorrerá. Se o ganho (Mestre) for muito alto, a imagem se tornará barulhenta. Idealmente, o ganho (Mestre) estará no meio de sua escala.</li>
		<li>Ajuste o furo de pino a 1 unidade arejada (au), que dá a definição a mais elevada e a z-fatia a mais fina.</li>
		<li>Deslize a barra de deslocamento digital para minimizar o piso de ruído no histograma lut para um fundo preto verdadeiro. Nota: uma vez que as configurações de microscopia são otimizadas para cada canal de laser e objetivo, mantê-los constantes durante a sessão de imagem e para a imagem de todos os slides, para permitir a comparação quantitativa entre slides.</li>
	</ol></li>
	<li>Na guia modo de aquisição , em média, selecione o número desejado e a profundidade de bits. Clique no botão optimal para definir o tamanho ideal do pixel.</li>
	<li>Use o botão de aquisição de snap para coletar uma imagem de alta qualidade. Aqui, campos de visão aleatórios foram selecionados de dentro do tumor, mas outras áreas de interesse podem se aplicar para diferentes aplicações (vasos, margens tumorais, profundidade de penetração, etc.)</li>
	<li>Salve arquivos de imagem no formato usado pelo software confocal (aqui, ". LSM") para processamento e quantificação offline. Nota: se nem todos os slides são imaged durante a mesma sessão, salve as configurações e recarregá-los em visitas subsequentes, embora a reimagem do mesmo slide não é recomendado devido ao fotobranqueamento.</li>
	<li>Realize as medições quantitativas de intensidade de fluorescência. Abra Fiji (Fiji é apenas ImageJ software)19,23 e carregar um arquivo de imagem. LSM arrastando para a barra de status.</li>
	<li>Divida os dados do canal de cores. Vá para Image &Gt; Stacks &Gt; dividir canais.</li>
	<li>Pré-processar as imagens de fluorescência conforme necessário, ou seja, subtrair o sinal de fundo (processo &Gt; subtrair fundo) ou reduzir o ruído através de um método de filtragem.</li>
	<li>Segmente o canal de cor correspondente à proteína de referência (mancha vascular, nuclear, celular) definindo um limiar na intensidade do sinal (imagem &Gt; ajustar &Gt; limiar). Nota: o limiarização manual introduz a subjetividade na análise de imagem, conseqüentemente, usando um algoritmo de limiarização automatizado ou fazer referência a histogramas da imagem faz resultados da análise da imagem menos tendenciosos.</li>
	<li>Use esse limite para criar uma máscara binária (processo &Gt; binário &Gt; converter em máscara).</li>
	<li>Medir e rotular ROIs dentro da máscara (analisar &Gt; analisar partículas &Gt; verificar adicionar ao gerenciador > Ok).</li>
	<li>Aplique ROIs no canal de cores correspondente ao anticorpo de interesse (clique em imagem do canal, analisar &Gt; ferramentas &GT; ROI Manager &Gt; Measure). Isto aplicará a máscara ROIs à imagem do anticorpo e fornecerá medidas da imagem para seções da etiqueta na janela dos resultados. Salvar janela de resultados (arquivo &Gt; salvar).</li>
	<li>Calcule a estatística desejada de interesse, como a intensidade média de fluorescência, conforme descrito aqui24.</li>
	<li>Execute todas as etapas de processamento de forma idêntica a cada imagem dentro de um conjunto de slides. Crie uma macro para fazer isso automaticamente para lotes de imagem grande23.</li>
	<li>Para exibição de imagem somente após medições quantitativas, aplique ajustes qualitativos de imagem para otimizar a visualização de padrões de biodistribuição ajustando o mínimo, o máximo, o brilho e o contraste aos mesmos níveis em todos os slides (imagem &Gt; ajustar > Brilho/contraste).</li>
	<li>Converta o tipo de imagem (imagem &Gt; tipo &Gt; cor RGB) e salve arquivos em um tipo de imagem sem perdas, como. TIFF (arquivo > salvar como > TIFF...) para uso em apresentações e publicações.</li>
</ol>

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<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+reprograms+lymphatic+vessels+to+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
<li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Fluorescence+Immunohistochemistry%3A+Localization+of+Fluorescently+Labeled+Cetuximab+in+Squamous+Cell+Carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+resistance+to+immune+checkpoint+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors.</a> British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).</li>
<li>Rexer, B. N., Arteaga, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+acquired+resistance+to+HER2-targeted+therapies+in+HER2+gene-amplified+breast+cancer%3A+mechanisms+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications.</a> Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este método tem várias etapas críticas e requer possíveis modificações para garantir a implementação bem-sucedida. Primeiramente, a dosagem e o sincronismo da injeção intravenosa conjugada do anticorpo/anticorpo devem ser costurados à aplicação específica. Geralmente, as dosagens devem ser usadas que são consistentes com a forma como o conjugado de anticorpos normalmente será usado, ou seja, dosagens de correspondência do anticorpo terapêutico ou agente de contraste baseado em anticorpos. Também, o sincronismo da coleção...

Os anticorpos monoclonais (mAb) são grandes glicoproteínas (aproximadamente 150 kDa) da superfamília da imunoglobulina que são secretadas por pilhas de B e têm uma função preliminar no sistema imune para identificar e para inibir a função biológica de, ou a marca para destruição, bactérias ou agentes patogénicos virais, e pode reconhecer a expressão anormal da proteína em células cancerosas1. Os anticorpos podem ter uma afinidade extremamente elevada a seus resumos específicos para baixo às concentrações do femtomolar que fazem lhes ferramentas altamente prometedores na biomedicina2. Com o desenvolvimento da tecnologia de hibridoma por Milstein e Köhler (premiado com o prêmio Nobel em 1984), a produção de mAbs tornou-se possível3. Mais tarde, os mAbs humanos foram gerados usando a tecnologia de exibição de fago ou cepas de camundongo transgênico e revolucionaram seu uso como novas ferramentas de pesquisa e terapêutica4,5.
O câncer é uma questão de saúde mundial e uma das principais causas de morte, criando a necessidade de novas abordagens para prevenção, detecção e terapia6. Até o momento, os mAbs permitiram o desencarceramento do papel dos genes e de suas proteínas no tumorigênese e quando dirigidos de encontro aos Biomarkers do cancer, podem permitir a deteção e a caracterização do tumor para a estratificação paciente. Para a terapia do cancro, os mAbs anticorpos, os conjugados do anticorpo-droga, e os fragmentos menores do anticorpo estão sendo desenvolvidos como o Therapeutics, e para a entrega alvejada da droga para realçar a eficácia terapêutica7. Adicionalmente, os anticorpos servem para a segmentação do biomarcador de agentes de contraste para as modalidades da imagem latente molecular tais como a cirurgia fluorescência-guiada, a imagem latente fotoacústica (PA), a imagem latente molecular do ultra-som (e.u.), e a emissão clìnica usada do positrão (PET) ou tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT)8. Por fim, os anticorpos também podem ser usados como agentes teranosóticos possibilitando a estratificação dos pacientes e o monitoramento da resposta para terapias direcionadas9. Conseqüentemente, os mAbs novos estão começando a jogar um papel crítico na deteção, no diagnóstico, e no tratamento do cancro.
Apesar dos avanços críticos no desenvolvimento e na produção de mAbs novos e altamente específicos, as aplicações diagnósticas e terapêuticas podem ser tornadas ineficazes devido à complexidade do ambiente do tumor. As interações de anticorpos dependem do tipo de epítopo, ou seja, seé linear ou conformacional10. Além do reconhecimento de antígenos, os anticorpos precisam superar barreiras naturais, como paredes de vasos, membranas basais e o estroma tumoral para alcançar células-alvo expressando o antígeno. Os anticorpos interagem com o tecido não somente através do domínio da ligação do antígeno do fragmento variável (FAB) mas também através do fragmento cristalino constante (FC) que conduz mais às interações do fora-local11. A segmentação também é complicada pela expressão heterogênea de marcadores tumorais em todo o volume tumoral e heterogeneidade na vascularização tumoral e no sistema linfático12,13. Além, o microambiente do tumor é compor dos fibroblastos Cancer-associados que apoiam pilhas do tumor, pilhas imunes do tumor que suprimem reações imunes antitumorais, e o endotélio do tumor que suporta o transporte do oxigênio e dos nutrientes, todo que interferem na penetração, distribuição e disponibilidade de terapêuticas ou diagnósticos baseados em anticorpos. Globalmente, essas considerações podem limitar a eficácia terapêutica ou diagnóstica, reduzir a resposta ao tratamento e podem resultar em resistência tumoral.
Conseqüentemente, para o desenvolvimento de terapias e de diagnósticos anticorpo-baseados eficientes, é crucial avaliar a biodistribuição e a interação do conjugado anticorpo-baseado dentro do microambiente do tumor. Atualmente, em estudos pré-clínicos, a expressão de marcadores em modelos de pesquisa tumoral é analisada ex vivo pela coloração da imunofluorescência (IF) das secções tumorais14. A coloração padrão IF é realizada com anticorpos primários específicos de marcadores, que são então destacados por anticorpos secundários com rótulo fluorescentamente em fatias de tecido tumoral ex vivo que foram isoladas do animal. Esta técnica destaca a posição estática do marcador na altura da fixação do tecido e não fornece a introspecção em como a terapêutica ou o diagnóstico anticorpo-baseado podem distribuir ou interagir em circunstâncias fisiológicas. A imagem latente molecular por animal de estimação, SPECT, nós, e PA pode fornecer a informação sobre a distribuição anticorpo-conjugated do agente do contraste em modelos pré-clínicos vivos8,15. Como essas modalidades de imagem são não invasivas, estudos longitudinais podem ser realizados e dados sensíveis ao tempo podem ser coletados com um número mínimo de animais por grupo. Entretanto, estas aproximações moleculars não invasoras da imagem latente não são sensíveis bastante e não têm bastante definição para a localização da distribuição do anticorpo a nível celular. Adicionalmente, as características físicas e biológicas do anticorpo primário podem ser drasticamente alteradas pela conjugação de um agente de contraste16.
A fim de tomar as condições in vivo fisiológicas e patológicas em consideração de como a terapêutica baseada em anticorpos e diagnósticos interagem dentro do ambiente tumoral e para obter alta resolução celular e até mesmo distribuição subcelular perfis de anticorpos não conjugados, propomos uma abordagem IF, considerada in vivo immunofluorescence Localization (IVIL), na qual o anticorpo antígeno-específico é injetado intravenosamente in vivo. O anticorpo-baseado terapêutico ou diagnóstico, agindo como um anticorpo preliminar, circula em vasos sanguíneos funcionais e liga-se a sua proteína do alvo no ambiente altamente exato, vivo do tumor. Após a isolação de tumores in vivo-etiquetados com o anticorpo preliminar, um anticorpo secundário é usado para localizar conjugados acumulados e retidos do anticorpo. Esta aproximação é similar a uma aproximação previamente descrita da histologia de injetar anticorpos cDNAs etiquetados17. Embora aqui, o uso de anticorpos não conjugados evita uma mudança potencial nas características da biodistribuição induzidas pela modificação do anticorpo. Além disso, a aplicação ex vivo do anticorpo secundário fluorescente evita uma perda possível de sinal da fluorescência durante a coleção e o processamento do tecido e fornece a amplificação da intensidade do sinal da fluorescência. Nossa aproximação da rotulagem reflete in vivo a biodistribuição de drogas anticorpo-baseadas e de agentes alvejados e pode fornecer introspecções importantes para o desenvolvimento de agentes diagnósticos e terapêuticos novos.
Aqui, nós descrevemos duas aplicações do método de IVIL como aplicado em estudos precedentes que investigam a biodistribuição e a acessibilidade de agentes de contraste anticorpo-baseados para aproximações moleculares da imagem latente para a deteção do cancro da mama. Em primeiro lugar, a biodistribuição de um conjugado de corante infravermelho próximo (anticorpo anti-B7-H3 vinculado à tintura de fluorescência infravermelha próxima, verde de indocyanina, B7-H3-ICG) e o agente de controle isotipo (ISO-ICG) para fluorescência e fotoacústica molecular a imagem latente é explorada18. O método deste aplicativo é descrito no protocolo. Em seguida, os resultados da biodistribuição de um anticorpo conformacionalmente sensível a netrin-1, tipicamente não detectável com a imagem latente tradicional do se, usado com imagem latente molecular do ultra-som, são quantificados e apresentados nos resultados representativos19. Na conclusão deste papel do protocolo, os leitores devem sentir confortável adotar o método de IVIL para suas próprias aplicações de pesquisa anticorpo-baseadas.

<table><tbody><tr><td>Modelo Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002374</td><td>Fêmeas, 4-6 semanas de idade</td></tr><tr><td>Animal Handling Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G Catheter</td><td>VisualSonics</td><td>Por favor, ligue para encomendar</td><td>Kit de</td></tr> <tr><td>Canulação de Acesso à Veia da Cauda Vevo MicroMarkerToalhetes com Álcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246073</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de Gaze (4" x 4" 16 Ply)</td><td>Lâmpada de Calor Cardinal</td><td>Health 2913</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Morganville Scientific</td><td>&nbsp; HL0100</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein Saúde Animal</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Pomada Oftálmica</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0490117</td><td></td></tr><tr><td>Fita Cirúrgica</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Coleção de Tecidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Descartável Base Moldes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-556</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura de Corte Ótima (OCT) Média</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Cirúrgico London</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-488 cabra anti-rato IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-546 anti-coelho para cabras IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-594 anti-humano para cabras IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11014</td><td></td></tr><tr><td>Controle de Isotipo IgG Humano</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97043</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-netrin-1 humanizado&nbsp;</td><td>Netris Pharma</td><td></td><td>contact@netrispharma.com</td></tr><tr><td>Coelho anti-rato CD276 (B7-H3)</td> <td>Abcam</td><td>ab134161</td><td>EPNCIR122 Clone</td></tr><tr><td>Rato anti-rato CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>MEC 13.3 Clone</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Unha Transparente Polonês</td><td></td><td></td><td>Qualquer farmácia local</td></tr><tr><td>Indocianina Verde - NHS</td><td>Intrace Medical</td><td>ICG-NHS éster</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Montagem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TA-006-FM</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cabra Normal</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19135680</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Estéril Salino Tamponado (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Suprimentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesion Lâminas de Vidro</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de Vidro</td><td>Fisher Caneta</td> de Barreira Hidrofóbica Científica <td>12-544G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>22311</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de Coloração de Slides</td><td>VWR</td><td>87000-136</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>LOCI, UW-Madison.</td><td>Versão 4.0</td><td>https://fiji.sc/</td></tr></tbody></table>

in vivo localização de imunofluorescência para avaliação de anticorpo terapêutico e diagnóstico biodistribuição em pesquisa de câncer

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Os anticorpos monoclonais (mAbs) são ferramentas importantes na deteção, no diagnóstico, e no tratamento do cancro. São usados para desvendar o papel das proteínas no tumorigenesis, podem ser dirigidos aos biomarcadores do cancro permitindo a deteção e a caracterização do tumor, e podem ser usados para a terapia do cancro como mAbs ou os conjugados da anticorpo-droga para ativar pilhas do efetoras imune, para inibir vias de sinalização, ou matar diretamente as células que transportam o antígeno específico. Apesar dos avanços clínicos no desenvolvimento e na produção de mAbs novos e altamente específicos, as aplicações diagnósticas e terapêuticas podem ser prejudicadas pela complexidade e pela heterogeneidade do microambiente do tumor. Assim, para o desenvolvimento de terapias e diagnósticos eficientes baseados em anticorpos, é crucial avaliar a biodistribuição e a interação do conjugado anticorpo-baseado com o microambiente vivo do tumor. Aqui, nós descrevemos in vivo a localização da imunofluorescência (IVIL) como uma aproximação nova para estudar interações da terapêutica e do diagnóstico anticorpo-baseados nas circunstâncias fisiológicas e patológicas in vivo. Nesta técnica, um anticorpo antígeno-específico terapêutico ou diagnóstico é injetado intravenosamente in vivo e ex vivo localizado com um anticorpo secundário em tumores isolados. O IVIL, portanto, reflete a biodistribuição in vivo de medicamentos à base de anticorpos e agentes de segmentação. Duas aplicações do IVIL são descritas avaliando a biodistribuição e a acessibilidade de agentes de contraste anticorpo-baseados para a imagem latente molecular do cancro da mama. Este protocolo permitirá que os usuários futuros adaptem o método de IVIL para suas próprias aplicações de pesquisa anticorpo-baseadas.

O método de IVIL foi utilizado aqui para examinar a biodistribuição in vivo e a interação tecidual de B7-H3-ICG e ISO-ICG, permitindo que os agentes, após injeção intravenosa em um animal vivo, interajam com o tecido alvo por 96 h, e depois os tecidos são para atuar como os anticorpos primários durante a imunomarcação ex vivo. O método de IVIL também foi comparado com a coloração padrão ex vivo IF dos tecidos para o marcador B7-H3. As glândulas mamárias murinas normais não expressam o mar...

O método de localização de imunofluorescência in vivo (IVIL) pode ser usado para examinar a biodistribuição in vivo de anticorpos e conjugados de anticorpo para fins oncológicos em organismos vivos usando uma combinação de segmentação tumoral in vivo e imunocoloração ex vivo Métodos.

In vivo localização de imunofluorescência para avaliação de anticorpo terapêutico e diagnóstico biodistribuição em pesquisa de câncer

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Este protocolo de localização in vivo de imunofluorescência, ou IVIL, avalia a biodistribuição in vivo de anticorpos diagnósticos e terapêuticos ou agentes baseados em anticorpos para pesquisa, detecção e tratamento do câncer. Em contraste com a coloração imunofluorescente convencional onde a expressão celular de antígenos é revelada ex vivo, o método IVIL elucida como anticorpos e agentes à base de anticorpos se distribuem no animal vivo. Este vídeo ajudará a entender o fluxo de trabalho global do método IVIL.Ele mostra detalhes importantes para a reprodução bem sucedida do protocolo para outras aplicações e anticorpos. Observe os camundongos do modelo de câncer desejado para o crescimento adequado do tumor através da medição de palpação ou pinça antes de prosseguir. Purificar anticorpos de controle de isótipo de coelho anti-rato B7-H3 e coelho IgG em uma coluna de desalte para remover conservantes e buffers de armazenamento seguindo as instruções do fabricante.Dosagens de 33 microgramas de cada anticorpo conjugado em tubos de microcentrifuuagem individuais. Após a anestesia, conforme descrito no protocolo de texto, prepare-se para a inoculação da veia traseira das soluções de anticorpos. Desinfete a cauda do animal limpando três vezes com um lenço de álcool.Dilatar as veias da cauda aquecendo com uma almofada de calor por aproximadamente 30 segundos. Evite aquecer todo o animal. Usando um cateter de veias da cauda de calibre 27, insira a agulha borboleta em uma das duas veias laterais da cauda.Visualize o fluxo sanguíneo no cateter para garantir que a agulha esteja bem colocada para que as soluções entrem totalmente no animal versus sejam capturadas na cauda. Use um pedaço de fita cirúrgica para fixar cuidadosamente a cauda com a agulha inserida ao palco. Lave o cateter com 25 microlitadores de soro fisiológico estéril tamponado com fosfato.Em seguida, injete a solução de anticorpos no cateter usando seringas de insulina. Lave o cateter mais uma vez com 25 microliters de PBS estéreis. Retire a agulha da cauda e aplique pressão para parar qualquer sangramento.Realize a eutanásia humana do mouse, conforme descrito no protocolo de texto, e coloque o rato na posição supina. Use tesoura cirúrgica e fórceps para extirir tecidos tumorais. Use fórceps para agarrar apenas a camada externa da pele entre o conjunto de glândulas mamárias mais próximas da cauda, e faça uma pequena incisão com um par de tesouras cirúrgicas.Introduza a tesoura fechada no corte e abra lentamente a ponta para separar cuidadosamente a pele da membrana da parede abdominal subjacente, mantendo-a intacta. Faça uma incisão vertical no abdômen, continuando a separar a pele da membrana interna. Entre a terceira e quarta glândulas mamárias, faça um corte horizontal no abdômen para permitir a retração da pele e a visualização das glândulas mamárias.Agarrando cada tumor ou glândula normal com fórceps, corte cuidadosamente a pele presa usando uma tesoura cirúrgica. Coloque tecidos excisados em moldes de base descartáveis de tecido que são pré-rotulados e preenchidos com temperatura de corte ideal incorporando meio. Congele rapidamente os moldes por colocação em gelo seco.Para estudar a entrega fora do alvo, extirto outros tecidos ou órgãos de interesse. Usando um criostat, se sectionia blocos de tecido congelado com espessura de 10 mícrons e coloque seções adjacentes em lâminas de vidro de adesão pré-rotuladas. Enxágüe lâminas de tecido congelado com PBS de temperatura ambiente por cinco minutos para remover o meio de incorporação.Demarcar seções teciduais com caneta de barreira hidrofóbica para reduzir o volume de soluções necessárias durante a coloração. Fixar as seções teciduais com solução de paraformaldeído de 4% por cinco minutos. Depois de enxaguar os slides em PBS por cinco minutos, permeabilize seções teciduais com 0,5% Triton X-100 em PBS por 15 minutos.Enxágüe os slides novamente em PBS por cinco minutos. Bloqueie os tecidos com PBS contendo 3% de peso por volume de gógo bovino albumina e 5% de volume por volume de soro de cabra por uma hora à temperatura ambiente. Depois de enxaguar os slides em PBS por cinco minutos, incubar as seções com anticorpos primários que mantêm registros, como um marcador nuclear, vascular ou citoplasmista comum.Aqui, o CD31 anti-rato de rato é usado em uma diluição de um a 100 na solução de bloqueio. Os slides com anticorpo primário são deixados durante a noite a quatro graus Celsius, protegidos da desidratação em uma bandeja de slides. Após a incubação, enxágue os slides em PBS por cinco minutos três vezes.Mude o PBS cada vez. Incubar os slides com anticorpos secundários para rotular os anticorpos primários. Para esta aplicação, visualize o anticorpo anti-B7-H3 usando o anticorpo anti-coelho de cabra conjugado Alexa Fluor 546, e visualize CD31 com o anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 na solução de bloqueio.Proteja os slides da luz e desidratação em uma bandeja de slides durante uma hora em temperatura ambiente. Depois de enxaguar os slides em PBS como antes, aplique uma gota do meio de montagem no centro da fatia de tecido. Coloque cuidadosamente uma mancha de cobertura, evitando a armadilha de bolhas de ar.Sele as bordas da tampa com esmalte transparente e deixe secar. Proceder com imagens de microscopia confocal e análise quantitativa de imagem conforme descrito no protocolo de texto. Micrografias confocal representativas mostram a comparação de anticorpos B7-H3 específicos conjugados e isótipos não específicos de controle de anticorpos-ICG conjugados em glândulas mamárias murinas contendo tecidos normais ou carcinoma.As glândulas mamárias murinas normais de um animal injetou intravenosamente com Iso-ICG ou B7-H3-ICG e contra-manchadas com CD31 não mostram nenhuma coloração dos conjugados de anticorpos. Os tecidos normais mostraram-se não ter expressão de B7-H3 pela coloração padrão de imunofluorescência ex vivo. Em tumores mamários invasivos, b7-H3-ICG se liga fortemente à vasculatura, o primeiro ponto de contato in vivo, e depois é capaz de extravasar da vasculatura para manchar heterogeneamente o epitélio tumoral.Iso-ICG mostra acúmulo inespecífico dentro dos tecidos tumorais. A coloração imunofluorescente ex vivo padrão mostra expressão uniforme do marcador B7-H3 em células epiteliais e endoteliais. Micrografias confocal representativas mostram o método de localização da imunofluorescência in vivo para detectar expressão de netrin-1 ou expressão de controle isótipo em carcinoma murino e glândulas mamárias normais.A localização da imunofluorescência in vivo confirma o sinal epitelial para netrin-1 em tumores MMTV-PyMT, mas não em glândulas mamárias normais. Além disso, há um forte sinal netrin-1 nas células endoteliais em tumores mamários, como indicado pelo sinal amarelo colocalizado. O sinal é significativamente mais fraco nas glândulas mamárias normais.O método IVIL precisará ser otimizado em termos de dosagem de anticorpos, tempo de coleta de tecidos e diluição de anticorpos secundários para implementação bem-sucedida. O IVIL permite o direcionamento de epítopos conformais que não podem ser detectados usando a coloração padrão da imunofluorescência, que requer processamento tecidual. Além disso, órgãos saudáveis de camundongos portadores de tumores podem ser coletados para avaliar a entrega fora do alvo de anticorpos terapêuticos.Com o aumento do uso de terapêuticas baseadas em anticorpos e agentes de contraste na pesquisa e gerenciamento do câncer, o método IVIL é altamente aplicável à pesquisa e desenvolvimento farmacêutico. Pesquisadores em terapias contra o câncer, imagem molecular, inflamação e outras áreas podem descobrir que o método IVIL fornece informações úteis.

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Este vídeo demonstra uma técnica de localização por imunofluorescência in vivo (IVIL) para estudar a biodistribuição de anticorpos direcionados ao tumor em um modelo murino de câncer de mama. Após a injeção intravenosa de um anticorpo específico do tumor no camundongo, o tumor é isolado cirurgicamente e a localização do anticorpo dentro do tecido tumoral é confirmada por imunocoloração ex vivo.

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In vivo localização de imunofluorescência para avaliação de anticorpo terapêutico e diagnóstico biodistribuição em pesquisa de câncer (Vídeo) | JoVE Journal

In vivo localização de imunofluorescência para avaliação de anticorpo terapêutico e diagnóstico biodistribuição em pesquisa de câncer

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