Name: Destaques da coleção JoVE Methods: interações proteína-proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Explore métodos avançados para estudar interações proteína-proteína em biologia molecular. Esta coleção apresenta técnicas experimentais essenciais para investigar complexos proteicos celulares.

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Os autores reconhecem as bolsas NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) e Alberta Prion Research Institute/Alberta Innovates Bio Solutions (201600018) concedidas a M.O.

<ol><li>Jin, L., Wang, W., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein-protein+interaction+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Targeting protein-protein interaction by small molecules.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 435-456 (2014).</li>
<li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cellular+protein-protein+interactions%3A+Technological+strategies+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. 38 (1), 79-111 (2019).</li>
<li>Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Cyclin-dependent+Kinase+1+Specific+Phosphorylation+Sites+by+an+In+Vitro+Kinase+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+Assay+Using+Endogenous+Nuclear+Proteins+from+Cells+Cultured+Under+Hypoxic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration-free+Vitro+of+Protein+Homo-oligomerization+Using+Commercial+Instrumentation+and+Free%2C+Open+Source+Brightness+Analysis+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calibration-free Vitro of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58157(2018).</li>
<li>Luzarowski, M., Wojciechowska, I., Skirycz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2+in+1%3A+One-step+Affinity+Purification+for+the+Parallel+Analysis+of+Protein-Protein+and+Protein-Metabolite+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57720(2018).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Heterodimerization+of+Protein+Isoforms+Using+an+Situ+Ligation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an Situ Ligation Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57755(2018).</li>
<li>Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Interactions+of+Globular+and+Filamentous+Proteins+by+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+%28NMR%29+and+Microscale+Thermophoresis+%28MST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST).</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58537(2018).</li>
<li>Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Macromolecules+in+Solution+using+Small+Angle+X-Ray+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58538(2018).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li>
<li>Lundberg, E., Borner, G. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomics%3A+a+powerful+discovery+tool+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As interações proteína-proteína (IBPs) são fundamentais para a geração de efeitos biológicos. Muitos estão intimamente ligados à doença e são cada vez mais reconhecidos como alvos importantes para a ação do medicamento1. Numerosas técnicas estão disponíveis para estudar essas interações proteicas, algumas das quais são discutidas nesta coleção ou em outros artigos do JoVE. Cada técnica tem seus próprios méritos e limitações2; no entanto, não existe uma técnica perfeita para todos os IBPs devido à enorme diversidade dessas interações que ocorrem em diferentes compartimentos subcelulares, com uma ampla gama de afinidades (picomolar a milimolar) e podem ser apenas transitórias por natureza.
Os ensaios de quinase in vitro são uma abordagem indireta para estudar IBPs que podem ser usados para analisar como as quinases desempenham seu papel funcional de transferir um grupo fosfato do ATP para um substrato. Cui et al.3 usam essa técnica, juntamente com digestão tríptica e espectrometria de massas, para identificar os sítios de fosforilação específicos da quinase-1 dependente de ciclina em um fragmento da proteína F do centrômero humano (CENEP-F). Para verificação funcional de novos locais de fosforilação, os autores usam um ensaio de ligação, combinando CENP-F contendo uma mutação fosfomimética e carioferina α, um receptor de transporte nuclear, fornecendo assim validação cruzada.
A coimunoprecipitação é um método amplamente utilizado para estudar IBPs no qual um anticorpo é usado para capturar um alvo específico junto com quaisquer outras moléculas de proteína associadas a ele. Zheng e colegas4 aplicam essa técnica para estudar fatores induzíveis por hipóxia (HIFs) que funcionam como heterodímeros compostos por uma subunidade de α regulada por oxigênio e uma subunidade de β expressa constitutivamente, também conhecida como ARNT3. Uma observação interessante sobre seu protocolo é que as células são induzidas e colhidas em condições hipóxicas, e as proteínas endógenas das frações nucleares são então coimunoprecipitadas. Como observam os autores, uma limitação do método é que ele não pode determinar se os IBPs são diretos ou indiretos.
Nolan et al.5 apresentam um protocolo para a medição do número de moléculas e seu brilho em imagens de microscopia de fluorescência 'Number and Brightness' (N&B), que pode ser aplicado para detectar a homo-oligomerização de proteínas. A técnica pode ser usada in vitro e in vivo e foi aplicada para quantificar com precisão o estado oligomérico de FKBP12F36V marcados com mVenus antes e depois da adição de um medicamento dimerizante. Os autores discutem os méritos da técnica em relação às tecnologias relacionadas e destacam a importância de corrigir o branqueamento e as flutuações de intensidade a longo prazo. Microscópios confocais equipados com detectores digitais facilitam a quantificação, mas o N&B também é possível com detectores analógicos.
A purificação por afinidade de complexos multiproteicos, juntamente com a identificação de seus componentes, tem sido uma técnica amplamente utilizada para o entendimento das funções de tais proteínas complexadas. No protocolo de Luzarowski et al.6, essa técnica é levada um passo adiante ao caracterizar simultaneamente os IBPs e as interações proteína-metabólito (PMIs) em células vegetais transgênicas de Arabidopsis. As quinases de difosfato de nucleosídeos marcadas são purificadas por afinidade pelo procedimento de marcação de purificação por afinidade em tandem (TAP) com proteínas capturadas e pequenas moléculas sendo posteriormente identificadas por espectrometria de massa. A singularidade deste protocolo é a capacidade de identificar ligantes hidrofóbicos e hidrofílicos; é um protocolo de extração três em um que permite que tanto os PPIs quanto os PMIs sejam estudados e aplica purificação de afinidade ao plantio de células.
O ensaio de ligação de proximidade tem a vantagem de ser usado para detectar interações entre proteínas endógenas em células e tecidos. Karchugina e Chernoff7 usam a técnica para mostrar a presença de heterodímeros das quinases MST1 e MST2 em células humanas de Schwann (HSCs) e células renais embrionárias humanas (HEK-293). Seu artigo tem várias dicas valiosas sobre como executar a técnica com sucesso. São necessários anticorpos primários apropriados criados em diferentes espécies contra cada proteína em interação e, como a especificidade e a sensibilidade dos anticorpos são fundamentais, as concentrações de anticorpos devem ser ajustadas com precisão. Os autores acharam as lâminas de câmara de vidro convenientes para analisar várias linhagens celulares e combinações de anticorpos, mas observaram que é imperativo remover toda a inserção de silicone entre os poços para evitar diferenças na distância confocal durante a microscopia. Além disso, vários controles positivos e negativos são usados para validar os resultados.
A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é um ensaio sensível que pode ser usado para fornecer resolução em nível atômico e informações quantitativas sobre interações proteicas e interações proteína-ligante. Winkelaar e colegas8 usam a técnica para estudar a interação de duas proteínas (vimentina e envoplaquina) encontradas em desmossomos, estruturas celulares envolvidas na adesão célula a célula que são tipicamente encontradas em tecidos que sofrem intenso estresse mecânico. Os autores usam um domínio de vimentina marcado com 15N e adquirem um espectro 2D usando correlação quântica única heteronuclear (HSQC). Na presença de um domínio da envoplakin, observa-se alargamento extenso da linha e desaparecimento do pico, consistente com a interação proteica. Os autores investigam ainda a base da interação usando mutagênese e termoforese em microescala (MST) para fornecer informações quantitativas.
O espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) é uma técnica que pode ser usada para fornecer informações sobre o tamanho e as conformações de uma macromolécula em solução e gerar um envelope molecular de grandes complexos de múltiplos domínios ou proteínas em baixa resolução. No protocolo de Mrozowich et al.9, a técnica é utilizada para gerar uma estrutura de baixa resolução de nidogênio-1 e laminina γ-1 em complexo. A técnica pode ser de interesse para pesquisadores que estudam PPIs em proteínas grandes com múltiplos domínios globulares que são muito grandes para espectroscopia de RMN e são difíceis de cristalizar para cristalografia de raios-X.
Estima-se que existam cerca de 650.000 interações no interactoma humano10 - o suficiente para manter os pesquisadores da área ocupados por algum tempo. Um desenvolvimento recente, possibilitado por avanços em microscopia, espectrometria de massa e aprendizado de máquina, é a proteômica espacial que pode fornecer uma grande visão nessa área no futuro11. Esta coleção de métodos de PPI ajudará os pesquisadores a enfrentar esse importante desafio, evitando possíveis armadilhas.

destaques da coleção jove methods: interações proteína-proteína

JoVE Methods Collection Highlights: Protein-Protein Interactions

Destaques da coleção JoVE Methods: interações proteína-proteína

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Explore métodos avançados para estudar interações proteína-proteína em biologia molecular. Esta coleção apresenta técnicas experimentais essenciais para investigar complexos proteicos celulares.

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