Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

A imunoprecipitação é uma técnica muito poderosa para isolar e purificar uma proteína alvo. Em condições suaves, proteínas, reguladores ou substratos podem ser co-imunoprecipitados. Uma nova rede de interação pode então ser descoberta.

A atividade da proteína imunoprecipitada também pode ser avaliada. Em particular, a atividade de uma quinase pode ser testada em diferentes substratos pela rotulagem P32-ATP. No entanto, a atividade de inibidores visando uma quinase envolvida em uma doença pode ser avaliada.

Eles podem constituir compostos de chumbo para desenvolver novas drogas. Este método pode ser estendido de mamíferos para levedura ou bactérias. Esta técnica não é tão difícil.

Para pontos-chave:certifique-se de ter um controle negativo para ter certeza de que a interação detectada é específica e escolha cuidadosamente as condições de lise para manter as interações e a atividade. Pequenos detalhes e gestos são importantes para garantir o sucesso dessa técnica, e nunca são descritos em materiais e métodos de artigos. Demonstrando o procedimento estará Fabienne Godin, técnica do nosso laboratório.

Depois que as células forem preparadas na sala de cultura celular dentro do armário de biossegurança, use uma pipeta de 10 mililitros para remover a mídia das placas e descartá-la em um frasco de resíduos dedicado com alvejante. Em seguida, adicione 10 mililitros de DMEM complementados frescos, e coloque as placas de volta em uma incubadora a 37 graus Celsius. Para preparar a mistura de transfecção, em um tubo de 15 mililitros, adicione 450 microliters de 10 milimoslars solução de cloridrato tris em pH 7.5, complementado com um milimil EDTA e 50 microliters de 2,5 solução de cloreto de cálcio molar.

Misture por inversão. No tubo, adicione um volume correspondente a 10 microgramas de DNA de plasma, amplificado por um kit midiprep de DNA, e diluído com o tampão de elução deste kit, e cuja concentração foi determinada. Inverta o tubo para misturar.

Em seguida, com agitação suave em um misturador de vórtice, adicione lentamente 500 microliters de concentrado salino 2X tamponado BES, gota a gota no tubo. Mova-o com muito cuidado, para não perturbar a formação complexa entre DNA e fosfato de cálcio. Incubar por pelo menos 15 minutos, ou até 45 minutos, em temperatura ambiente.

Agora, transfira a placa para transfectar da incubadora para o gabinete de segurança. Adicione os complexos de DNA preparados caindo por gota sobre as células por toda a superfície da placa. Incubar por 24 a 72 horas na incubadora a 37 graus Celsius.

Para evitar a degradação da proteína, prepare o tampão de lise no gelo, levando em consideração quatro mililitros de tampão de lise para cada placa transfetada. Pegue a placa com células transfeinadas da incubadora. Remova a mídia e descarte-a em uma garrafa de resíduos de alvejante dedicada.

Para lavar as células, adicione três mililitros de PBS frios na lateral da placa gota a gota, para evitar o descolamento de células transfetadas. E gire suavemente a placa para espalhar o tampão por toda a superfície. Incline a placa para remover o PBS e descarte-o na garrafa de lixo.

Repita a lavagem mais uma vez. Coloque a placa no gelo. No final, remova cuidadosamente o resto do PBS.

Em seguida, adicione 500 microliters de tampão de lise fria às células lavadas transfeinadas. Espalhe por toda a superfície da placa. Incubar por 10 minutos no gelo.

De tempos em tempos, espalhe novamente o tampão por toda a superfície da placa. Depois disso, use uma espátula celular para raspar as células da superfície e colecioná-las em um tubo de microcentrifuuge. Centrífuga por 10 minutos a 10.000 vezes G e 4 graus Celsius.

Colete o lisato supernacido em um novo tubo de microcentrifuuagem e colete uma alíquota de 50 microliter desta fração para outro novo tubo de microcentrifuuge. Esta alíquota será usada para verificar se as proteínas transfeinadas estão bem expressas. Descarte a pelota no lixo.

Primeiro, resuspenque suavemente a solução de estoque de contas agarose, juntamente com o anticorpo apropriado. Corte o fim de uma ponta de 200 microliter para fazer uma abertura de um a dois milímetros. Conecte a ponta a uma micropipette e elasenhe 40 microliters da solução, permitindo que as contas entrem na ponta.

Pipeta as contas para cima e para baixo várias vezes para saturar a ponta para garantir o volume correto das contas e transferir as contas para um tubo de microcentrifuuge. Adicione 500 microliters de tampão TNET, misture por inversão e centrífuga por dois minutos a 1.000 vezes G e quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o supernatante e adicione 500 microliters de tampão TNET.

Incubar em uma roda giratória por pelo menos uma hora a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugar o tubo por dois minutos a 1.000 vezes G e quatro graus Celsius e lavar as contas duas vezes com 500 microliters de tampão de lise invertendo e centrifugando. Após a lavagem, transfira o total de frações coletadas anteriormente para o tubo e incubar em uma roda rotativa a quatro graus Celsius por duas a quatro horas.

Agora, centrífugue o tubo contendo as contas imunoprecipitadas por dois minutos a 1.000 vezes G e quatro graus Celsius. Lave as contas cinco vezes com 500 microliters de tampão de lise invertendo e centrifugando. Ao lavar as contas, tome cuidado para não chegar muito perto das contas enquanto remove o supernaspe.

Caso contrário, as contas serão aspiradas e no final do experimento, não restará mais contas. Para elução, primeira centrífuga por dois minutos a 1.000 vezes G e quatro graus Celsius. Use uma micropipette de um mililitro para remover cuidadosamente o supernatante.

Em seguida, com uma seringa Hamilton equipada com uma agulha cimentada, remova as últimas gotas do supernante para evitar aspiração das contas. Em seguida, adicione 40 microliters de tampão 4X Laemmli. Homogeneize-se tocando suavemente o tubo.

Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, centrífuga por cinco minutos a 10.000 vezes G e temperatura ambiente. Com uma seringa Hamilton, transfira o elunato supernante para um novo tubo de microcentrífuga.

Armazene a menos 80 graus Celsius. As células HEK-293 foram transfectadas com LIMK 2-1 não grampeados ou uma das isoformas com etiquetas HA de LIMK 2. LIMK 2-1 é bem expresso nas diferentes condições.

O anticorpo Anti LIMK 2-1 não reconhece isoforms LIMK 2a e LIMK 2b, e é específico, pois seu sinal diminui quando as células são transfeinadas com RNA LIMK2 pequena interferindo, em comparação com o controle de pequenos RNAs interferentes. Em várias linhas de células humanas, LIMK 2-1 parecia ser expresso em HEK-293 e HeLa, mas não em C6. Foram utilizados experimentos de co-imunidade para avaliar a interação do LIMK2-1 com o ROCK de quinase a montante. Cada uma das diferentes proteínas codificadas pelos vetores transfeinados foram bem expressas.

Os três isóformes de LIMK2, bem como larp6, foram eficientemente imunoprecipitados. Nos eluatos, o ROCK foi detectado e, assim, coimmunoprecipitado com os três isóformes de LIMK2, mas não com larp6. A interação detectada é então específica.

Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 foi testado para sua atividade de quinase através da rotulagem ATP gama P32. LIMK 2-1 não fosforilato cofilin, enquanto que fez proteína básica de mielina fosforilato, ou MBP. LIMK 2-1 é eficientemente imunoprecipitado neste teste.

É fundamental ter controle negativo ao realizar a imunoprecipitação para ter certeza de que a interação é específica. A composição de um tampão de lise deve ser cuidadosamente configurada para preservar a interação e a atividade. Após a imunoprecipitação, a atividade de quinase pode ser avaliada para contar diferentes substratos.

A mutação pode ser facilmente introduzida e pode desvendar o papel de resíduos específicos. Estudos funcionais também podem ser realizados para entender o papel fisiológico das novas interações destacadas. As células devem ser cultivadas em uma sala de cultura dedicada dentro de um armário de biossegurança.

P32 ATP tem que ser manuseado com cautela específica. Escudo para proteger contra radiação, contador Geiger, coleta específica de resíduos, crachás pessoais de mama e dedos para detectar exposição radioativa e dicas de filtro.