Name: Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda a isolar células mononucleares da lâmina própria do cólon murino usando Collagenase E. Este método permite imunofenotipagem de populações imunes intestinais para estudo de doenças inflamatórias.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios #1K08HL088260 e #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) e pela Fundação Batchelor para pesquisa Pediátrica (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Os camundongos C57BL/6 e BALB/c utilizados neste estudo foram criados em nossas instalações ou fornecidos por Jackson Labs ou Taconic.

Todos os estudos foram conduzidos protocolos de pesquisa de roedores revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da faculdade de medicina da Universidade de Miami Miller, que atende aos padrões veterinários estabelecidos pela associação americana para laboratório de Zootecnia (AALAS).
1. preparação de soluções
<ol><li>
Conforme descrito na tabela 1, prepare o buffer de cólon, mídia de separação de densidade baseada em sílica 100%, mídia de separação de densidade baseada em sílica 66%, mídia de separação de densidade baseada em sílica 44%, tampão de digestão de Collagenase E e tampão FACS.
	<ol>
<li>Prepare o tampão dos dois pontos o dia antes do procedimento e armazene durante a noite em 4 ° c.</li>
		<li>Prepare 100% de separação de sílica-based densidade Media no dia anterior ao procedimento e armazenado durante a noite a 4 ° c, colocando à temperatura ambiente a manhã do procedimento a descongelar.</li>
		<li>Prepare 66% e 44% meios de separação à base de sílica na parte da manhã do isolamento, usando a temperatura ambiente 100% sílica-based densidade meios de separação e buffer de cólon.</li>
		<li>Meça a quantidade apropriada de Collagenase e de Clostridium histolyticum-derivado e armazene em-20 ° c durante a noite antes do procedimento. Na manhã seguinte, dissolver no volume adequado de cólon buffer para derivar Collagenase digestão buffer. Para todas as incubações com tampão da digestão de Collagenase no dia do procedimento, aqueça previamente as soluções a 37 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a totalidade das etapas do protocolo, mantenha uma centrífuga a 20 ° c e a velocidade de rotação de 859 x g, com freios inativados (0 desaceleração) para centrifugação de gradiente. Definir outro a 4 ° c e velocidade de rotação de 859 x g, com a desaceleração padrão, para as etapas de lavagem.</li>
</ol>2. colhendo o cólon
<ol><li>Eutanizar o rato via CO2 asfixia seguida pelo método confirmatório aprovado pela aalac.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma posição supina e pulverize a pele com 70% de etanol. Usando grandes tesouras do tecido, faça uma incisão vertical do midline e exponha o peritoneum intacto.</li>
	<li>Usando tesouras finas da dissecção, abra o peritoneum. Use fórceps para mover o intestino delgado para um lado e expor o cólon descendente. Puxe ligeiramente para cima no cólon descendente para expor maximamente a porção retal do cólon. Corte o reto distal profundamente na pelve e dissecar e remover todo o cólon como uma unidade, do reto distal ao tampão cecal.</li>
	<li>Transfira os dois pontos em 20 mL de tampão de cólon refrigerado em um tubo de polipropileno 50 mL.</li>
</ol>3. limpando o cólon
<ol><li>Coloc os dois pontos em uma toalha de papel umedecida e extraia o tamborete contínuo aplicando a pressão suave à parede das entranhas com a extremidade sem corte das tesouras ou do fórceps.</li>
	<li>Coloque os dois pontos em uma placa de Petri e lave o intestino com 10 mL de tampão de cólon resfriado usando uma seringa de 10 mL com agulha de preenchimento sem corte de 18 G.</li>
	<li>Transfira os dois pontos para um buffer de cólon umedecido toalha de papel e retire o mesenteria e gordura com a extremidade afiada da tesoura.</li>
	<li>Coloc os dois pontos em um prato de Petri enchido com 5-10 mL refrigerou o amortecedor dos dois pontos que agitam manualmente para lavar o Sumário relativo ao cólon restante. Repita 2-3 vezes.</li>
	<li>Corte os dois pontos longitudinalmente de sua extremidade rectal mais muscular aos dois pontos proximal (gerando uma única parte aberta retangular dos dois pontos) em um prato de Petri enchido com o amortecedor refrigerado fresco dos dois pontos. Descarte a mídia existente e reabasteça com buffer Colon limpo e refrigerado.</li>
	<li>Lave o intestino 3 vezes, agitando-o vigorosamente na placa de Petri e substituindo o 5-10 mL de tampão de cólon refrigerado depois com cada lavagem.</li>
	<li>Coloque o tecido do cólon retangular em uma toalha de papel umedecida com Colon buffer e cortá-la cortando-a horizontalmente e, em seguida, em pequenos fragmentos (3 mm x 3 mm seções).</li>
	<li>Colete os fragmentos de cólon cuidadosamente usando fórceps fino em 20 mL resfriado Colon buffer em um tubo de polipropileno 50 mL cônico.
</li>
	<li>Lave os fragmentos do cólon 3 vezes, cada lavagem em 20 mL de tampão de cólon, agitando vigorosamente o tubo para 30 s. entre cada agitação, permita que os fragmentos do tecido se instalem à parte inferior do tubo. O decant ou o vácuo aspiram o sobrenadante ao impedir a perda do fragmento do tecido no processo da aspiração entre cada lavagem. Nota: Não há necessidade de mudar o tubo após cada lavagem.</li>
</ol>4. digestão da Collagenase 1
<ol><li>Adicione 20 mL do tampão de digestão de Collagenase aos fragmentos de cólon lavado no tubo cônico de polipropileno 50 mL.</li>
	<li>Coloque o tubo fechado de 50 mL a 37 ° c em um agitador orbital incubado com a taxa de rotação ajustada em 2 x g por 60 min. Assegure-se de que os fragmentos de tecido estejam em movimento constante durante a agitação; se necessário, aumente a taxa de rotação incrementalmente para garantir que nenhum fragmento de tecido se estabeleça na parte inferior do tubo.</li>
</ol>5. Prepare gradientes de mídia de separação à base de sílica
<ol><li>Prepare 66% e 44% de mídia de separação de densidade baseada em sílica, usando 100% de mídia de separação de densidade baseada em sílica a 20 ° c (temperatura ambiente) e buffer de cólon.</li>
	<li>Despeje 5 mL de 66% de meios de separação de densidade à base de sílica em cada um dos 3 tubos de polipropileno separados de 15 mL. Prepare 3 tubos por dois pontos. Isso forma a base de densidade mais alta do procedimento de isolamento de gradiente, na qual a mídia de separação de menor densidade será mergulhada para criar o gradiente de separação.</li>
	<li>Conservar a 20 ° c até à utilização.</li>
</ol>6. coleção de sobrenadante da digestão 1
<ol><li>Colete apenas o sobrenadante usando uma pipeta sorológica de 25 mL e filtre o sobrenadante através de um filtro de célula de tecido de filtração de poros de 40 μm colocado em um tubo cônico de polipropileno 50 mL limpo, após a conclusão da digestão de Collagenase 1. Tenha cuidado para não aspirar quaisquer fragmentos de tecido existentes. Nota: Guarde os fragmentos de tecido visíveis restantes no tubo. Estes serão submetidos a segunda digestão da colagenase (passo 8).</li>
</ol>7. têmpera Collagenase digestão tampão
<ol><li>Encha o tubo de polipropileno 50 mL completamente com o tampão de cólon refrigerado. Nota: A Collagenase está ativa a 37 ° c; assim, o tampão refrigerado inactiva esta enzima.</li>
	<li>Centrifugue o tubo a 4 ° c a 800 x g durante 5 min.<ol>
<li>Descarte o sobrenadante via aspiração a vácuo. Lave as células com 25 mL de tampão de cólon fresco e Centrifugue a 800 x g durante 5 min.</li>
		<li>Ressuscitem a pelota em menos de 1 mL de tampão de cólon fresco refrigerado.</li>
		<li>Coloque o tubo cônico de polipropileno 50 mL no gelo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. digestão 2 de Collagenase
<ol><li>Repita a etapa 4 (digestão 1) com os fragmentos restantes do tecido retidos da etapa 6,1.</li>
</ol>9. desagregação tecidual após digestão 2
<ol><li>Lave os fragmentos de tecido vigorosamente para frente e para trás entre o tubo e uma seringa de 10 mL através de uma agulha de extremidade sem corte de 18 G.</li>
	<li>Repita este flush para um mínimo de 7-8 passagens completas, continuando até que nenhum fragmento de tecido bruto ou detritos sejam visíveis.</li>
</ol>10. filtrar células
<ol><li>Passe a suspensão de desagregação tecidual através de um filtro de célula de tecido de filtração de poros de 40 μm em um tubo de polipropileno 50 mL limpo.</li>
	<li>Lave o filtro de célula de tecido de filtração com 10 mL de tampão de cólon refrigerado para recuperar todas as células enreadas no filtros.</li>
</ol>11. têmpera Collagenase digestão
<ol><li>Encha o tubo cônico de polipropileno 50 mL para a jante com tampão de cólon refrigerado. Nota: A temperatura do tampão dos dois pontos é crítica para assegurar a têmpera da atividade do colagenase.</li>
	<li>Girar a 4 ° c e 800 x g por 5 min.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante via aspiração a vácuo.</li>
	<li>Lave com resuspensão em 25 mL de tampão cólon fresco refrigerado, seguido de centrifugação a 4 ° c, 800 x g por 5 min.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante via aspiração a vácuo.</li>
	<li>Agrupe a pelota ressuscipended da digestão 1 de Collagenase (etapa 7) a seu tubo correspondente da etapa 11,4.</li>
	<li>Repetir o passo 11,4 (lavagem e centrifugação).</li>
</ol>12. separação sílica-baseada da separação dos media do inclinação da densidade
Nota: Execute as etapas 12-18 o mais rapidamente possível, para assegurar a têmpera rápida da atividade do colagenase.
<ol><li>Após a etapa 11,7, ressuscite cada pellet em 24 mL de total de 44% de separação de sílica-based densidade Media por cólon.</li>
	<li>Mergulhe lentamente 8 mL da mídia da etapa 12,1 em cada um dos três tubos preparados na etapa 5,2 (contendo 66% de mídia de separação de densidade baseada em sílica), usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Mantenha um fluxo constante e lento dos meios de separação da densidade de 44% ao mergulhar o inclinação a fim evitar a interrupção da relação.</li>
	<li>Balance cuidadosamente todos os tubos dentro das caçambas de centrifugação usando uma balança ou balança.</li>
	<li>Gire os tubos 20 min a 859 x g em uma centrífuga sem freio a 20 ° c. Permita que os rotores venham terminar o descanso antes de remover os tubos, tomando o cuidado para não interromper as pilhas na relação do inclinação.</li>
</ol>13. colete células mononucleares da interface de gradiente
<ol><li>Visualize a interface de gradiente (perto da marca de 5 mL), onde normalmente uma faixa branca grossa de 1-2 mm (contendo MNC) está presente. Nota: Um pode ou não pode ver uma faixa branca. Entretanto, o MNC estará nesta relação e deve nuvem a claridade da relação do inclinação.</li>
	<li>Aspirar a vácuo e descartar o Top 7 mL do gradiente superior para permitir o acesso mais fácil pipeta para a interface.</li>
	<li>Usando a sucção manual contínua e o movimento de giro constante do pulso, colete a camada de relação das pilhas em um tubo cónico do polypropylene 50 mL limpo. Colete até que a interface entre os 2 gradientes é clara e corpos (clara de células).</li>
	<li>Encha o tubo de recolha com 50 mL de tampão FACS refrigerado. Girar a 4 ° c, 800 x g por 5 min.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante através de aspiração a vácuo e suspender o pellet em 1 mL de FACS buffer.</li>
	<li>Conte as células em um hemocitômetro em uma diluição 1:2 usando métodos apropriados de exclusão de células mortas.</li>
	<li>Proceder à coloração de FACS ou outros ensaios com MNC Colônico recém-isolado.</li>
</ol>

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<li>van der Heijden, P. j, Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo Visual descreve métodos bem tolerados para a isolação de pilhas mononucleares Colônica que incluem linfócitos do própria do lamina (LPL). Dado que este protocolo foi otimizado na avaliação de modelos graves de colite pós-transplante de camundongo, onde citocinas inflamatórias e lesão tecidual se prestam à má viabilidade da MNC recuperada, prevemos que esses métodos podem ser traduzidos para outros aplicações que exigem a análise fenotípica do MNC relativo ao cólon. Estes incluem, mas, não estão limitados a...

Embora o trato gastrointestinal (GI) é principalmente dedicado ao processamento e reabsorção de nutrientes de alimentos, o trato gastrointestinal também mantém papéis centrais na integridade dos sistemas vasculares, linfáticos e nervosos e de numerosos outros órgãos através seu sistema imunológico mucoso e submucoso1. O sistema imunológico Gi tem um papel influente na saúde gastrointestinal e sistêmica, devido à sua exposição constante a antígenos estrangeiros de alimentos, bactérias comensais ou agentes invasores1,2. Assim, o sistema imunológico gastrointestinal deve manter um equilíbrio delicado no qual tolera antígenos não patogênicos enquanto respondesse apropriadamente aos antígenos patogênicos1,2. Quando o equilíbrio de tolerância e defesa é interrompido, a desregulação imune localizada ou sistêmica e a inflamação podem ocorrer resultando em uma infinidade de doenças1,2,3.
O intestino abriga pelo menos 70% de todas as células linfóides no corpo4. A maioria de interações imunológicas preliminares envolvem pelo menos uma de três estações imunes no intestino: 1) Peyer ' remendos de s, 2) linfócitos intraepithelial (IEL) e 3) linfócitos do própria do lamina (LPL). Cada uma delas é composta por uma complexa rede interconectada de células imunes que respondem rapidamente aos desafios imunes normais no intestino5. Restrita ao estroma acima da musculatura Mucosae, a lâmina própria vagamente estruturada é o tecido conjuntivo da mucosa intestinal e inclui andaimes para o villus, a vasculatura, drenagem linfática e sistema nervoso mucoso, bem como muitos inatos e subconjuntos imunes adaptativos6,7,8,9. As LPL são compostas por células T CD4+ e CD8+ em uma proporção aproximada de 2:1, células plasmáticas e células de linhagem mielóide, incluindo células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e macrófagos6.
Há um interesse crescente em compreender o desregulação imune e a inflamação do intestino como pertence aos vários Estados da doença. Tais condições como a doença de Crohn e colite ulcerosa todos manifestam diferentes níveis de inflamação do cólon10,11,12. Adicionalmente, os pacientes com desordens malignos ou não-malignos da medula ou do sistema imune que se submetem a uma transplantação allogeneic da medula (Allo-BMT) podem desenvolver várias formas da colite que incluem 1) toxicidade direta dos regimes condicionantes antes de BMT,2) infecções causadas por imunossupressão após BMT e 3) doença do enxerto versus hospedeiro (DECH) impulsionada por células T do tipo doador reagindo a antígenos de Allo nos tecidos após o BMT13,14,15. Todas essas complicações pós-BMT resultam em alterações significativas no ambiente imunológico dos intestinos16,17,18. O método proposto permite uma avaliação confiável do acúmulo de células imunes no cólon do camundongo e, quando aplicado aos receptores murinos após a TMO, facilita um ensaio eficiente de células imunes de doadores e receptores envolvidas na tolerância ao transplante19 ,20. Causas adicionais de inflamação intestinal incluem malignidades, alergias alimentares, ou perturbação do microbioma intestinal. Este protocolo permite o acesso de pilhas mononucleares do intestino do cólon e, com modificações, aos leucócito do intestino pequeno em alguns destes modelos murino pré-clínicos.
Uma pesquisa PubMed usando os termos de pesquisa "intestino e célula imune e isolamento" revela mais de 200 publicações descrevendo métodos para a digestão do intestino delgado para extrair células imunes. Entretanto, uma busca similar da literatura para dois pontos não rende nenhuns protocolos bem delineados que especificam a isolação de pilhas imunes dos dois pontos. Isto pode ser porque o cólon tem mais camadas musculares e intersticiais, tornando-o mais difícil de digerir completamente do que o intestino delgado. Diferentemente dos protocolos existentes, este protocolo utiliza especificamente a Collagenase E de Clostridium histolyticum sem outras colagenases bacterianas (Collagenase D/Collagenase I). Nós demonstramos que, usando este protocolo, a digestão do tecido relativo ao cólon pode ser conseguida ao preservar a qualidade de pilhas imunes mononucleares isoladas do intestino (MNC) sem a adição de reagentes antiaglutonantes tais como o versenate do sódio (EDTA), Dispase II, e desoxirribonuclease i (DNase i)21,22,23. Este protocolo é aperfeiçoado para permitir a extração robusta reprodutível de MNC viável do cólon murino para uns estudos dirigidos mais adicionais e deve emprestar-se ao estudo da imunologia do cólon ou (com modificações) o intestine pequeno24, a 25.

<table><tbody><tr><td>60 mm Petri DIsh</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>BW17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta Sorológica Descartável</td><td>Corning</td><td>4100</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubos</td> <td>Cônicos Não EstéreisTruLine</td><td>TR2002</td><td></td></tr><tr><td>18 G Agulha Romba</td><td>Becton Dickinson</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipeta Sorológica Descartável</td><td>Corning</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m tamanho de poro Filtro de células</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tube</td><td>Corning</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A4503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fixação</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Colagenase E de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M Estéril Solução</td><td>Amresco</td><td>E177-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td><td>SV30014.03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GE Healthcare-HyClone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare-Life Sciences</td><td>1708901</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium</td><td>Corning</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sódio</td><td>VWR Ciências da Vida Amresco</td><td>97064-646</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando collagenase e

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

O intestino é a casa para o maior número de células imunes no corpo. A exposição da polícia intestinal de pequenos e grandes sistemas imunológicos a antígenos exógenos e modulam respostas a potentes estímulos imunológicos derivados microbialmente. Por esta razão, o intestino é um local principal alvo de desregulação imune e inflamação em muitas doenças, incluindo mas, não limitado a doenças inflamatórias intestinais, como a doença de Crohn e colite ulcerosa, doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) após o osso transplante de medula óssea (TMO) e muitas condições alérgicas e infecciosas. Os modelos murinos de inflamação e colite gastrintestinal são fortemente utilizados para estudar as complicações do GI e para otimizar as estratégias de prevenção e tratamento pré-clinicamente. Os dados recolhidos destes modelos através da isolação e da análise fenotípica de pilhas imunes do intestino são críticos para uma compreensão imune mais adicional que possa ser aplicada para amenizar desordens inflamatórios gastrintestinais e sistemáticas. Este relatório descreve um protocolo altamente eficaz para a isolação de pilhas mononucleares (MNC) dos dois pontos usando uma relação sílica-baseada misturada do inclinação da densidade. Este método isola revisivelmente um número significativo de leucócito viáveis ao minimizar contaminando restos, permitindo o fenótipo imune subseqüente pela citometria do fluxo ou pelos outros métodos.

Ao trabalhar com modelos de doença de cólon murino, é útil ser capaz de quantificar e avaliar qualitativamente, entre os MNC do cólon, múltiplos subconjuntos de células imunes envolvidas no processo inflamatório. A suspensão de uma única célula de MNC obtida através da aplicação deste protocolo facilita a caracterização fenotípica de forma robusta e reprodutível. Como prova de princípio para a aplicação deste método de isolamento diversas configurações experimentais, foi obtida a MNC Colô...

O objetivo deste protocolo é isolar as células mononucleares que residem na lâmina própria do cólon por digestão enzimática do tecido usando Collagenase. Este protocolo permite a isolação eficiente de pilhas mononucleares tendo por resultado uma única suspensão da pilha que por sua vez possa ser usada para immunophenotyping robusto.

Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

O isolamento na análise fenotípica das células imunes do intestino usando este protocolo tem se mostrado aplicável à compreensão de GI e distúrbios inflamatórios sistêmicos. Este método isola um número significativo de células mononucleares viáveis minimizando detritos contaminantes permitindo fenotipagem imunológica subsequente pela Atomistry de Fleur ou outros métodos. Como o intestino é um dos principais alvos de inflamação em muitas doenças, esse protocolo pode ser útil para o estudo de populações imunes intestinais em modelos de camundongos de câncer, alergia, transplante e autoimunidade.Para otimizar o rendimento e a eficiência deste protocolo, recomenda-se que as principais soluções e materiais sejam preparados com antecedência, como observado. Depois de eutanásia do mouse e fazer uma incisão vertical midline, use uma tesoura de dissecção fina para abrir o peritônio. Usando fórceps, mova o intestino delgado para um lado e exponha o cólon descendente.Puxe ligeiramente para cima sobre o cólon descendente para expor ao máximo a porção reta do cólon. Em seguida, corte o reto distal profundo na pélvis e disseque todo o cólon como uma unidade do reto distal até a tampa cecal. Prim

isolation-lamina-propria-mononuclear-cells-from-murine-colon-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de...

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células mononucleares de lâmina própria do tecido colônico murino por digestão enzimática usando colagenase E e separação de gradiente de mídia de separação de densidade à base de sílica. As células mononucleares isoladas podem ser usadas para análise subsequente a jusante.

Isolamento de células mononucleares da lâmina própria: uma técnica de centrifugação por gradiente de densidade à base de sílica para obter células mononucleares do cólon murino

O miofibroblastos é uma célula estromal influente do tracto gastrointestinal, que regula os processos fisiológicos importantes em estados normais e de doença. Descrevemos uma técnica que permite o isolamento de miofibroblastos primários de rato e tanto o tecido do cólon humano, o que pode ser utilizado para experimentação in vitro.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

Aqui descrevemos um método simples para o isolamento de células epiteliais epiteliais do cólon murino espacialmente distintas das células subjacentes à base da cripta.

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

O protocolo descrito aqui utiliza uma abordagem photolabeling em camundongos recém-nascidos para identificar especificamente as células do sistema imunológico que emigram do cólon para sites extra intestinais. Esta estratégia será útil para estudar interações do anfitrião-microbiome no início da vida.

Na Vivo Photolabeling de células no cólon para avaliar o potencial migratória das células hematopoiéticas em camundongos Neonatais

Aqui, apresentamos um protocolo para a cultura humana enteroid ou monocamadas de colonoid que têm a função de barreira intacta para estudar interações de epitélio-microbiota de acolhimento a nível celular e bioquímico.

Colonoid humana monocamadas para estudar interações entre epitélio Intestinal do hospedeiro, comensais e patógenos

Neste estudo, nós descrevemos um procedimento detalhado da fibrose intestinal TNBS-negociada, que exibe a patofisiologia comparável à fibrose de Crohn. Nós igualmente discutimos esta aproximação à luz do rapamicina facilitamos efeitos inibitórios na fibrose intestinal.

Visão mecanicista do desenvolvimento da fibrose intestinal mediada por TNBS e avaliação dos efeitos inibitórios da rapamicina

Neste protocolo, descrevemos como gerar monótolais de cólon epitelial primário murina diretamente de criptas intestinais. Fornecemos abordagens experimentais para gerar monocamadas confluentes em filtros permeáveis, monocamadas confluentes para cura de feridas de risco e estudos bioquímicos, e monocamadas esparsas e confluentes para análise de imunofluorescência.

Geração de Monócamas Epiteliais de Cólon Primário Murine de Criptas Intestinais

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Apresentamos aqui um protocolo para isolar o mesênquima intestinal murino, incluindo telócitos. Estes podem ser usados para várias aplicações, tais como co-cultura com camundongos ou organoides derivados de humanos, para apoiar o crescimento e refletir melhor a situação no tecido original.

Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos

Aprenda a isolar células mononucleares da lâmina própria do cólon murino usando Collagenase E. Este método permite imunofenotipagem de populações imunes intestinais para estudo de doenças inflamatórias.

Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E

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