Name: Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprenda a usar microscopia de fluorescência em células vivas para estudar a dinâmica nuclear em leveduras de fissão durante mitose e meiose. Este método não tóxico permite observar processos celulares em tempo real.

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Os autores gostariam de agradecer a Natalia la Fourcade e a Mon LaFerte por fazerem da preparação deste manuscrito um empreendimento mais agradável. Agradecimentos aos membros do laboratório de Forsburg que contribuíram à conclusão deste trabalho com suas introspecção, idéias do experimento, e sustentação moral. Este projeto foi apoiado por NIGMS R35 GM118109 para SLF.

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy%E2%80%93tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy–tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MD+%22DNA+Replication%22">DNA Replication</a>. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).</li>
<li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%E2%80%99s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+an+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859(2015).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li>
<li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li>
<li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li>
<li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+%28XPF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li>
<li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li>
<li>Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li>
<li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+methods+for+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li>
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<li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li>
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<li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1%E2%80%93Tea4%E2%80%93Pom1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580(2018).</li>
<li>Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).</li>
<li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A imagem latente da vivo-pilha durante o mitose e o meiose oferecem a oportunidade de examinar a dinâmica nuclear sem interromper substancialmente a fisiologia do fermento da fissão durante a aquisição de dados. No entanto, deve-se ter cautela para garantir que as células cresçam para as densidades desejadas livres de tensões ambientais; e para a meiose, que as células são imaged durante o tempo de diferenciação terminal e não muito cedo ou tarde. O excesso de aglomeração celular, fome e temperaturas de crescimento inadequado são fatores comuns que contribuem para observações irreprodutíveis. Além, durante a construção da tensão, é crucial testar que os Tag fluorescentes não interferem com as funções de genes do alvo nem afetam a aptidão total da pilha. A falha em inspecionar de perto os fenótipos de cepas que transportam marcadores fluorescentes pode resultar em resultados inconsistentes e incomparável em genótipos semelhantes.
Embora as almofadas do Agarose do microscópio sejam simples montar, podem igualmente levantar um obstáculo em obter dados valiosos da imagem latente. Criar almofadas do agarose é tão simples quanto coloc três corrediças do microscópio paralelas a se, dispensando o agarose derretido na corrediça média, e põr uma corrediça que transversos a parte superior das outras corrediças. É útil, entretanto, montar um instrumento do slide-Maker que permita modificações da largura para manufaturar almofadas resistentes, situação-específicas do agarose. Um slide-Maker simples que dá flexibilidade largura pad consiste em uma plataforma (pipeta pontas titular ou o banco), duas lâminas de microscópio, e fita de laboratório atuando como o mecanismo de ajuste de largura Pad (Figura 1a). A espessura exata da almofada dependerá das exigências do tempo da imagem latente, do tipo do agarose, da temperatura, do vedador do lamela, da taxa de evaporação, etc. Assim, é importante calibrar o sistema de imagem antes da aquisição de dados para aumentar a reprodutibilidade técnica e melhorar a qualidade da imagem de células ao vivo1,2,3. A superfície da almofada, a rigidez e a composição são essenciais durante a aquisição prolongada da imagem. O agarose tem a baixa fluorescência do fundo, pode facilmente ser moldado, e na concentração apropriada, resiste a deformação estrutural devido à evaporação. Além disso, combinando a mídia de levedura de fissão com agarose não compromete a qualidade da imagem e permite a observação prolongada de múltiplas mitoses e ciclos de meiose. Além disso, é importante evitar quaisquer bolhas de ar para microscopia de lapso de tempo. Dentro das almofadas do agarose dentro da amostra, os bolsos de ar expandem-se sobre o tempo, causando pilha-deslocando e interrompendo aviões focais. As células fornecidas são eficientemente distribuídas por rotação de lamínula, os pesquisadores podem seguir processos mitóticos em várias gerações e eventos meióticos da fusão nuclear à esporulação. Fazer e escolher o pad certo para experimentos de imagem leva tempo para dominar, mas uma vez alcançado, pode contribuir para observações de microscópio altamente informativo.
Como é o caso com outros métodos, a microscopia da viver-pilha não está livre das limitações técnicas. O uso de proteínas marcadas com fluorescently introduz limites para experimentos que limitam o escopo do que pode ser estudado. Foto-branqueamento e foto-toxicidade são problemas típicos de aquisição de imagem prolongada. Eles podem ser contraídos por não expor as células a comprimentos de onda curtos por muito tempo ou muito freqüentemente. Para experimentos envolvendo GFP, CFP, YFP, mRFP e DsRed, as proteínas fluorescentes típicas utilizadas na imagem de células ao vivo de levedura de fissão, é comum empregar 5-15% de luz de excitação e tempo de exposição de 100-500 ms para experimentos de rotina. Esses parâmetros mudam, no entanto, de acordo com os requisitos específicos do experimento do pesquisador. Além disso, as pilhas z compostas por 9-13 seções com espaçamento de 0,5 μm usando um objetivo de 60x são suficientes para resolver a espessura de uma célula de levedura de fissão. Além disso, é importante confirmar que os marcadores fluorescentes não interrompem o regulamento ou a função apropriada de proteínas do alvo ou geram phenotypes espurious. Assim, é aconselhável construir cepas contendo diferentes Tags fluorescentes e de afinidade para o mesmo gene alvo para corroborar observações por diferentes meios. Além disso, é da responsabilidade dos pesquisadores garantir que os parâmetros experimentais possam ser reproduzidos em experimentos e que os dados coletados estejam aptos para a análise a jusante1,3. Nenhuma tecnologia pode substituir a prática testada pelo tempo de validar meticulosamente sistemas experimentais por observação cuidadosa e exame rigoroso de linearidade na detecção de sinais fluorescentes.
Por fim, é crucial analisar dados de microscopia em formatos que não modifiquem imagens brutas. Fiji fornece excelentes ferramentas de documentação para acompanhar as medições de dados brutos e permite que os pesquisadores examinem diferentes parâmetros de células em uma única sessão. Estas características, bem como a sua riqueza de tutoriais on-line e extensa cobertura da literatura, fazem de Fiji uma importante ferramenta para medir, analisar e apresentar dados de imagens de células ao vivo que descrevem a dinâmica nuclear do fermento de fissão em mitose e meiose.

A microscopia da vivo-pilha permite que os investigadores examinem a dinâmica nuclear sem matar pilhas de levedura da fissão e elimina a necessidade para fixadores e manchas letais. É possível observar a estabilidade, o movimento, a localização, e o sincronismo de proteínas cDNAs etiquetadas que são envolvidas em eventos importantes tais como a replicação do cromossoma, o recombination, e a segregação, além do que a membrana e o cytoesquelético Movimentos. Mantendo a viabilidade celular e detecção de sinal não-tóxico, há intrusão fisiológica mínima. Quando executado corretamente, este método da microscopia pode reduzir os efeitos confundidores que se levantam da manipulação técnica prolongada ou da reactividade química espúrias. Além disso, durante um experimento, os pesquisadores podem fazer observações pertinentes dos Estados nutricionais e estressantes da fissão, eficiência proliferativa e status apoptótico que indicam parâmetros inadequados de imagem ou fisiologia celular anormal1 ,2,3.
A mitose e a meiose são caracterizadas pela divisão nuclear e celular. Na meiose, ao contrário da mitose, o conteúdo genético é reduzido para metade, pois as células-mãe dão origem a células filhas4. Porque a imagem latente da viver-pilha fornece uma dimensão temporal além do que a relação Spatial, o grande número de pilhas pode ser examinado no tempo real. A microscopia de células ao vivo permitiu que os pesquisadores examinassem a dinâmica da divisão nuclear usando Tags fluorescentes para histonas5, subunidades de coesão6, microtúbulos7, centrómeros8, cinetócoros9, componentes de o corpo do pólo do eixo (SPB)10, e aqueles do complexo do passageiro do CROMOSSOMA (CPC)11. Fora do instrumento da segregação do cromossoma, a imagem latente da vivo-pilha igualmente capturou o comportamento das proteínas necessárias, mas não envolvida diretamente na segregação do cromossoma. A função dessas proteínas tem demonstrado influenciar a replicação, a recombinação do cromossomo, o movimento nuclear e o apego cromossômico aos microtúbulos12,13,14. Essas observações contribuíram para uma melhor compreensão dos eventos celulares cujos componentes funcionais não foram amáveis ao exame bioquímico ou genético. Com novos avanços na tecnologia de microscopia, limitações como baixa resolução, fotobranqueamento, fototoxicidade e estabilidade de foco diminuirão, facilitando, assim, as melhores observações em tempo real da dinâmica nuclear mitótica e meiótica1, 2,3. A meiose é particularmente desafiadora, pois é uma via de diferenciação terminal que requer muita atenção ao tempo.
O objetivo deste protocolo é apresentar um método relativamente simples para examinar a dinâmica nuclear de levedura de fissão em tempo real em mitose e meiose. Para fazer isso, é necessário usar células que não foram expostas ao estresse ambiental, preparar almofadas de agarose que podem suportar imagens prolongadas, e montar células em densidades que facilitam a visualização da dinâmica de uma única célula. Além disso, este protocolo faz uso de células carregando proteínas fluorescentamente marcadas que servem como marcadores úteis para a cinética nuclear (Hht1-mRFP ou Hht1-GFP), segregação cromossômica (Sad1-DsRed), dinâmica do citoesqueleto (Atb2-mRFP), transcricional ativação em G1/S (Tos4-GFP), e estabilidade de coesão na meiose (Rec8-GFP). Este método também introduz marcadores nucleares e citosólicos adicionais (tabela I) que podem ser usados em diferentes combinações para abordar questões sobre processos celulares específicos. Além disso, ferramentas básicas de Fiji são destaques para ajudar os pesquisadores a processar imagens de células ao vivo e analisar diferentes tipos de dados. A força desta abordagem decorre do uso de observações em tempo real de dinâmica protéica, timing e estabilidade para descrever processos que são integrais para a correta execução de mitose e meiose.

<table><tbody><tr><td>Lente objetiva apocromática plana 60x</td><td>Olympus</td><td>AMEP4694</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A-8751</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>7558B</td><td>IB4917-10 kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>Dançarina do Ventre rotador</td><td>Stovall</td><td>US Patente # 4.702.610</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B-4501</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B-6768-5kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20,Sigma</td><td></td> <td>C3306-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C-0759</td><td></td></tr><tr><td>Convolve Plug-in de software 3D</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap HQ CCD camera</td><td>Roper</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H20,END</td><td></td> <td>CX-2185-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência de deconvolução DeltaVision</td><td>GE Healthcare/Applied Precision</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Difração PSF 3D plug-in</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Edimburgo mínimo médio (EMM) Notrogen</td><td>Sunrise</td><td>2023; 1kg</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&middot; 6H2O</td><td>END</td><td>FX9259-04</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento</td><td>Barnstead</td><td>Thermo Lyne</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H8125-100g</td><td></td></tr><tr><td>Huygens software de deconvolução</td><td>SVI</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Imaris software de deconvolução</td><td>Bitplane</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Shell lab</td><td>#3015</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Plug-in de software 3D Iterative Deconvolve</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckvadt</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Sigma</td><td>L7387-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma</td><td>L8912-100g</td><td></td></tr><tr><td>Lisina</td><td>Sigma</td><td>L5626-500g</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de malte (ME)</td> <td>MP</td><td>4103-032</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H20</td><td>AMRESCO</td><td>0288-500G</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4,</td><td>Mallinckvadt</td><td>6192-02</td><td></td></tr><tr><td>Ácido molibdico</td><td>Sigma</td><td>M-0878</td><td></td></tr><tr><td>Na2S04 </td><td>Mallinckvadt</td><td>8024-03</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nicotínico,</td> <td>Sigma</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pantotênico</td><td>Sigma</td><td>P-5161</td><td></td></tr><tr><td>Cera de parafina</td><td>Fisher</td><td>s80119WX</td><td></td></tr><tr><td>Pombe glutamato médio (PMG)</td> <td>Sunrise</td><td>2060-250</td><td></td></tr><tr><td>softWorx v3.3 software de processamento de imagem</td><td>GE Healthcare</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Esporulação Pó médio</td><td>Sunrise</td><td>1821-500</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga com temperatura controlada</td><td>Beckman</td><td>Allwgra 6KR xentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>AMRESCO</td><td>0847-500g</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Equaline</td><td>F79658</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura mais suplementos (YES)</td><td>Sunrise</td><td>2011-1kg</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>J.T.Baker</td><td>4382-04</td><td></td></tr></tbody></table>

examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

A imagem latente da vivo-pilha é uma técnica da microscopia usada para examinar a dinâmica da pilha e da proteína em pilhas vivas. Este método de imagem não é tóxico, geralmente não interfere com a fisiologia celular, e requer manuseio experimental mínimo. Os baixos níveis de interferência técnica permitem que os pesquisadores estudem células em vários ciclos de mitose e observem a meiose do início ao fim. Usando Tags fluorescentes como a proteína fluorescente verde (GFP) e a proteína fluorescente vermelha (RFP), os pesquisadores podem analisar diferentes fatores cujas funções são importantes para processos como transcrição, replicação de DNA, coesão e segregação. Juntamente com a análise de dados usando Fiji (uma versão livre, otimizada ImageJ), a imagem de células ao vivo oferece várias maneiras de avaliar o movimento da proteína, localização, estabilidade e timing, bem como a dinâmica nuclear e segregação cromossômica. Entretanto, como é o caso com outros métodos da microscopia, a imagem latente da vivo-pilha é limitada pelas propriedades intrínsecas da luz, que põr um limite ao poder da definição em ampliações elevadas, e é igualmente sensível ao photobranqueamento ou ao fototoxicidade no comprimento de onda elevado Freqüências. No entanto, com alguns cuidados, os investigadores podem contornar essas limitações físicas, escolhendo cuidadosamente as condições certas, cepas e marcadores fluorescentes para permitir a visualização adequada de eventos mitóticos e meióticos.

Aqui, nós apresentamos a imagem latente da viver-pilha que é um método não-tóxico da microscopia que permita investigadores de estudar o comportamento da proteína e a dinâmica nuclear em pilhas vivas do fermento da fissão durante o mitose e o meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

A microscopia de células vivas permite que os pesquisadores estudem a dinâmica nuclear da levedura de fissão em mitose e meiose em tempo real. A força deste método vem do estudo de processos nucleares em células vivas em condições fisiológicas normais que elimina a necessidade de fixações e manchas tóxicas. Esta técnica aborda questões relacionadas ao tempo de proteína, estabilidade e mobilidade que podem não ser favoráveis à manipulação genética ou biomecânica.É fundamental prestar muita atenção à saúde e aptidão das células de levedura de fissão antes da imagem. Examine sempre as características de morfologia e crescimento para garantir a consistência dos resultados em experimentos. Este protocolo mostra a maneira relativamente simples de preparar slides de microscópio que, quando dominados corretamente, podem aumentar a consistência e a reprodutibilidade de imagens de células vivas prolongadas.Para começar a pegar a matéria celular da placa de despertar criogênico, coloque-a nas placas SIM, e incuba-as a 25 graus Celsius ou 32 graus Celsius, dependendo do genótipo da levedura para acordar as cepas de leveduras de fissão da preservação criogênica. Em seguida, use um laço estéril para colher células de colônias individuais nas cepas de leveduras de fissão despertadas e inocula-las em tubos de ensaio contendo três mililitros de meio líquido YES. Coloque os tubos em um agitador a 150 a 220 rpm para crescer a 25 ou 32 graus Celsius durante a noite até a fase de tronco tardio com uma leitura de densidade óptica desejada de 0,7 a 1,0.Transfira 10 microlitros da cultura para um deslizamento de microscópio. Coloque uma mancha de cobertura e coloque-a sob um microscópio para verificar se há morfologia celular adequada e estado nutricional. Para configurar um slide de microscópio para análise de mitose ou análise de meiose adicione primeiro dois gramas de agarose no frasco de 500 mililitros contendo 100 mililitros de médio mínimo mais suplementos para mitose ou meio de esporulação líquida para a meiase.Aqueça a solução de agarose em um forno de micro-ondas a 60% de potência em incrementos de 10 segundos ou coloque o béquer em um banho de água de 55 graus Celsius por 10 minutos. Gire a solução para garantir um derretimento eficiente. Configure dois slides de microscópio em um suporte de ponta de pipeta com o slide superior apoiado em duas pilhas de fita de laboratório em ambas as extremidades como suporte fazendo uma forma cruzada.Ajuste a distância entre os dois slides para maiores que dois milímetros, a fim de formar uma almofada grossa nas etapas seguintes para imagens prolongadas. Depois de resfriar a agarose derretida por um minuto à temperatura ambiente, remova o slide superior e use uma ponta de pipeta larga para distribuir 50 a 100 microliters no slide inferior para fazer uma mancha. Antes que a agarose esfrie coloque o slide superior em cima para gerar uma almofada de cerca de um e meio a dois centímetros de diâmetro.A imagem de células vivas ideais é fundamental para etapas subsequentes de processamento de dados. Certifique-se de eliminar quaisquer bugigangas de ar na agarose derretida e crie uma almofada fina para períodos de imagem superiores a quatro horas. Para examinar eventos mitóticos, as células crescem a partir de culturas iniciais em EMM líquido ou PMG mais suplementos durante a noite.Transfira um mililitro da cultura em um cuvette, e meça no espectotúmetro em um comprimento de onda de 595 nanômetros. O crescimento celular é considerado fase de tronco médio quando a densidade óptica atinge 0,4. Em seguida, centrífugue um mililitro da suspensão celular a 1.375 vezes g por um minuto.Remova o supernatante e resuspenja a pelota celular em suplementos mínimos médios mais suplementos para um volume final de 100 microliters. Para a imagem, eventos meioticos crescem células a partir de culturas iniciantes em meio mínimo mais suplementos durante a noite. O crescimento celular é considerado fase de tronco tardio quando a densidade óptica em 595 nanômetros está entre 0,7 e um.Em seguida, a partir das culturas de registro tardio obter 500 microliters de cada cepa tipo mate, H negativo e H positivo, e combinar para fazer uma suspensão de célula de um mililitro. Centrifugar as células a 1.375 vezes g por um minuto. Remova o supernatante e resuspenque a pelota em um mililitro de extrato de maltose líquido.Repita a lavagem do extratos de maltose mais três vezes para garantir a remoção eficiente de nutrientes. Após a última lavagem do extrato maltose resuspensar as células em um mililitro de extrato de maltose e transferir a mistura para um frasco de 50 mililitros contendo nove mililitros de extrato de maltose. Incubar por 12 a 16 horas a 22 a 25 graus Celsius em uma velocidade mínima de rotação entre 50 e 100 rpm.O aparecimento de muitas moças de levedura de fissão redonda resultantes de auto-floculação abundante indica acasalamento eficiente. Em seguida, pegue uma amostra de um mililitro da cultura de acasalamento e centrífuga a 1.375 vezes g por um minuto. Remova 750 microlitadores do supernante e resuspenja as células no restante do supernatante.Vórtice vigorosamente por cinco segundos para interromper os aglomerados. Dispense 20 microliters de uma suspensão celular mitótica ou meiotic em uma almofada de 2%. Remova qualquer excesso de meio invertendo o slide e colocando-o na parte superior da toalha de papel sem fiapos por dois a três segundos.Vire o slide e coloque delicadamente uma mancha de vidro na parte superior da almofada, garantindo não gerar bolhas de ar. Para criar uma monocamada celular gire o deslizamento no sentido horário com o dedo indicador para uma volta completa para células de mitose ou duas voltas completas para células de meiose. Certifique-se de que a matéria celular se dispersa através da almofada de agarose permitindo uma melhor separação de células únicas ou asci.Com o auxílio de uma pequena vara de madeira dispense selante de hidrocarboneto derretido ao longo das bordas do deslizamento de cobertura para selar cada almofada de agarose. Uma vez que a almofada de agarose é selada coloque-a no estágio do microscópio. Ligue a câmara de temperatura e coloque-a na temperatura desejada.Coloque uma placa com uma toalha de papel molhada na câmara para controlar a umidade do sistema de microscópio. Deixe equilibrar por 10 a 15 minutos nas condições de imagem apropriadas. Isso permite que quaisquer bolhas de ar restantes se dissipem e quaisquer mudanças de última hora ocorram.Use o objetivo 40X para encontrar campos de visão apropriados para a imagem. Mude para o objetivo 60X de iniciar a aquisição de dados. No software que controla a função microscópio escolha os conjuntos de filtros de microscópio que melhor correspondem aos fluoroforos sob observação.Ajuste os comprimentos de onda de excitação para coincidir com os fluoroforos utilizados, empregue a menor potência de excitação que produz um sinal consistente e use tempos de exposição de quatro a oito horas para gerar dados de imagem aceitáveis, mas quantificáveis e reprodutíveis. Colete pelo menos seis pontos de tempo de aquisição a cada hora. No software de coleta de imagens selecione pelo menos um canal de fluorescência a partir do qual adquirir dados e empregar um estoque Z composto por 13 seções com espaçamento de 0,5 micrômetros.No software Fiji, carregue uma imagem desconvolved selecionando o recurso Bio-Formats Importer sob o menu plug-ins. Na janela pop-up Opções de importação, selecione Hyperstack, modo Cor Padrão, verifique a escala automática e pressione o botão OK. Certifique-se de que a janela exibida tenha o número correto de canais de fluorescência e períodos de tempo rolando para os lados nas respectivas barras na parte inferior.Salve como um arquivo Tiff que não compactua dados. Em seguida, no menu Analisar use a opção Definir medidas para escolher diferentes parâmetros. Por exemplo: Área, valor cinza mínimo min, densidade integrada, valor cinza médio, mediana, posição de pilha, perímetro e etiqueta display.Selecione Cor e clique na Ferramenta de Canais. Na janela pop-up dos canais, verifique o Canal de Cores para qual intensidade ou área será medida. Selecione Imagem, em seguida, Digite e clique em 32 bits.Escolha os recursos Ajustar e Limiar no menu Imagem. Verifique a caixa de fundo Escuro, selecione o método Padrão e escolha Vermelho para sobrepor os sinais de interesse. Use a ferramenta varinha para destacar cada estrutura de interesse e pressione a letra T no teclado para adicionar o ROI selecionado à janela do gerenciador de ROI pop-up.Em seguida, abra a pasta de ROI com zíper para carregar o gerenciador de ROI e clique em cada identificador de ROI no painel lateral esquerdo. Selecione Medir no menu Analisar e repita este comando em cada identificador de ROI para quantificar os objetos de interesse em todas as fatias da pilha de imagens. Guarde os resultados como um arquivo CSV para análise estatística.Neste estudo, se as células morrerem de fome devido à limitação de nutrientes ou ao crescimento excessivo, elas mostrarão excesso de vacúolos e diminuição do tamanho das células. As células logarítmicas mostram replicação ativa de DNA e divisão celular, bem como expressão pan-nuclear tos4-GFP e separação de focos Sad1-DsRed. A falta de acasalamento, como é o caso quando as células não estão suficientemente famintas de nitrogênio, impedirá que entrem em meiose.Um par de células de fissão submetidas à karyogamia são mostradas. A floculação robusta da suspensão celular de acasalamento aumenta a interação célula-célula e, portanto, indica acasalamento bem sucedido e indução meiotic eficiente. Asci zigoticas tomam múltiplas formas, incluindo as formas de zig-zag e células de banana.Na mitose à medida que as células transitam da metafase para a telophase, a primeira mudança envolve uma contração do tamanho nuclear na metafase, enquanto a segunda mostra a divisão do núcleo durante a anfáfase. Além de compartilhar algumas dinâmicas de segregação com células mitóticas, as células meioticas exibem oscilação nuclear durante a recombinação homólogoa e a redução adicional dos nucleosídeos no final da II.It é responsabilidade dos pesquisadores garantir que os parâmetros do experimento possam ser reproduzidos entre experimentos, e que os dados coletados sejam adequados para análise a jusante. Imagens de células vivas permitiram que os investigadores examinassem de perto a mecânica da divisão nuclear em mitose e meiose.À medida que as marcas fluorescentes e os recursos do microscópio melhoram o número e o tipo de processos que podemos observar, aumentará.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

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