Name: Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda a sintetizar vesículas unilamelares peptídicas para biologia de membranas usando reidratação de filmes com microesferas de vidro. Este método robusto permite incorporar amostras sensíveis como extratos celulares brutos em vesículas de crescimento autônomo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reconhecemos com gratidão o apoio financeiro através do DFG TRR 235 (emergence da vida, projeto P15), o Conselho Europeu de investigação (acordo de subvenção n º 694410 AEDNA), e a TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projeto n º 9, 5) . Agradecemos a E. Falgenhauer por sua ajuda com a preparação da amostra. Agradecemos a. Dupin e M. Schwarz-Schilling por sua ajuda com o sistema TX-TL e discussões úteis. Agradecemos a N. B. Holland por discussões úteis.

1. expressão de polipeptídeos semelhantes à elastina
<ol><li>Dia 1: preparação de uma cultura inicial e suprimentos para a expressão peptídica
	<ol>
<li>Preparar e autoclave expressão frascos de cultura (4 x 2,5 L) e 3 L de LB médio. Para 1 L de meio LB, adicione 25 g de pó LB a 1 L de água ultrapura.</li>
		<li>Prepare uma cultura inicial com 100 mL de meio LB, 50 μL de solução de cloranfenicol (filtro de 0,22 μm) estéril-filtrada (25 mg/mL em EtOH) e 50 μL de solução de carbenicilina filtrada (filtro de 0,22 μm) estéril (100 mg/mL em 50% EtOH e 50% de água ultrapura).</li>
		<li>Adicione uma pequena raia de um estoque bacteriano pré-fabricado contendo E. coli Strain BL21 (de3) pLysS com o vetor de expressão pET20b (+) que codifica a sequência de polipeptídeo MGHGVGVP ((gegvp)4(gvgvp))4((gfgvp)4(gvgvp))3 (Gfgvp)4GWP (abreviado como EF) a uma cultura pré-aquecida do acionador de partida de 100 ml e incubar em 37 ° c para 16 h com 250 rpm em uma incubadora de agitação (as tensões e os vetores dee. coli estão disponíveis em cima do pedido).</li>
		<li>Pré-aqueça as garrafas de cultura de expressão e a mídia LB a 37 ° c durante a noite para que eles estejam preparados para o dia seguinte.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2: expressão protéica
	<ol>
<li>Adicione 750 mL de meio LB a cada balão de cultura de expressão, 375 μL de estoque de cloranfenicol (filtro de 0,22 μm) estéril-filtrado (25 mg/mL em EtOH) e 375 μL de estoque de carbenicilina filtrado (0,22 μm) estéril (100 mg/mL em 50% EtOH e 50% de água ultrapura).</li>
		<li>Após agitação para distribuir os antibióticos, tomar 2 mL da mídia como uma amostra de referência para a medição da densidade óptica em 600 nm (OD600).</li>
		<li>Adicionar 7,5 mL da cultura inicial ao balão de expressão e incubar por 1 h a 37 ° c com 250 rpm.</li>
		<li>Após este passo, o OD600 de cada balão será verificado a cada 20 min.</li>
		<li>Quando a densidade óptica atinge aproximadamente 0,8 reduzir a temperatura para 16 ° c e induzir a expressão peptídica adicionando 750 μL de 1 M estéril-filtrado β-isopropílico tiogalactosídeo (IPTG) em água ultrapura em cada balão de expressão.</li>
		<li>Incubar o balão da expressão com as bactérias induzidas em 16 ° c para 16 h com 250 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 3: extração do polipeptídeo expresso
	<ol>
<li>Pré-pesar o balão de centrifugação para permitir a determinação da massa do pellet celular após a colheita.</li>
		<li>Colher todas as bactérias dos frascos da expressão pela centrifugação por 20 minutos usando um centrifugador pre-cooled em 4.000 x g e em 4 ° c.</li>
		<li>Despeje o sobrenadante e borre as garrafas de centrífuga em uma toalha de papel estéril.</li>
		<li>Pesar as garrafas de centrifugação e calcular a massa da pelota da pilha.</li>
		<li>Ressuscitar as células, que são peletizadas para baixo de 750 mL de cultura celular original, em 15 mL de solução salina tampão fosfato (PBS, pH 7,4) por pipetagem, e centrifugar a 4.000 x g por 20 min a 4 ° c. Despeje o sobrenadante e borre as garrafas de centrífuga em uma toalha de papel estéril.</li>
		<li>Ressuscitem a pelota da pilha para a etapa do lysis em 2 ml do amortecedor por 1 grama da pelota da pilha usando PBS (pH 7,4) suplementado com o lisozima (1 mg/ml), o fluoreto do fenilmetilsulfonil de 1 milímetro (PMSF), o benzamidine de 1 milímetro, e o 0,5 U de DNase I.</li>
		<li>SONICATE as células para mais lise no gelo com um sonicador em 8 W para 9 min com alternando 10 s sonication e 20 s passos de pausa, seguido por uma pausa de 9 minutos durante o qual a amostra deve ser arrefecida no gelo. Repita a etapa de sonication de 9 min mais uma vez.</li>
		<li>Adicione 2 ml de polietilenoimina de 10% (w/v) (PEI) por 1 L da cultura original da pilha para a precipitação do ácido nucleico.</li>
		<li>Distribuir a amostra em tubos de centrifugação de 2 mL e incubar a 60 ° c durante 10 min seguido de uma incubação por 10 min a 4 ° c.</li>
		<li>Centrifugue a solução em 16.000 x g por 10 min a 4 ° c e colete o sobrenadante contendo o ELP.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação da proteína através do ciclo inverso da temperatura:
	<ol>
<li>Ajuste o sobrenadante a um pH de 2 para mudar a parte hidrófila do peptídeo para hidrofóbico e induzir a agregação. Para ajustar o pH, o ácido fosfórico e o hidróxido de sódio são usados. as listras de pH são suficientes para determinar o nível de pH.</li>
		<li>Para melhorar o rendimento da purificação a amostra, aqueça a amostra a 60 ° c e adicione o cloreto de sódio até 2 M.</li>
		<li>Posteriormente, centrifugue a amostra a 16.000 x g durante 10 min à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Descarte o sobrenadante e redissolva o pellet em PBS (mas apenas metade do volume inicial é usado em comparação com a etapa anterior).</li>
		<li>Ajuste o pH a 7 com ácido fosfórico e hidróxido de sódio. as listras de pH são suficientemente precisas para determinar o pH.</li>
		<li>Centrifugue a amostra subseqüentemente em 16.000 x g por 10 minutos em 4 ° c.</li>
		<li>Colete o sobrenadante e repita os passos 1.4.1-1.4.6 até 3x total, exceto que na última repetição do passo 1.4.4, apenas a água é adicionada em vez de PBS.</li>
		<li>Meça a concentração dos peptídeos com um espectrómetro de absorção. Use um coeficiente de extinção de 5500/M/cm em 280 nm.</li>
		<li>Ajuste a concentração do ELP para 700 μM.</li>
	</ol></li>
</ol>2. produção do vesicle usando o método dos grânulos de vidro
<ol><li>Concentre a solução de ELP a 1,1 milímetros usando um concentrador centrífugo do vácuo.</li>
	<li>Misture 200 μL da solução concentrada de ELP com 1.250 μL de uma mistura de 2:1 clorofórmio/metanol seguida de vortexing.</li>
	<li>Adicionar 1,5 g de grânulos de vidro esférico (212 – 300 μm de tamanho) a um balão de 10 mL de fundo redondo.</li>
	<li>Adicione a solução contendo ELP e a mistura de clorofórmio/metanol ao balão de fundo redondo e misture por agitação suave.</li>
	<li>Ligue o balão a um evaporador rotativo. Ajuste a velocidade para 150 rpm e regule a pressão para-0,2 x 105 PA (-200 mbar) por aproximadamente 4 min até que o líquido seja evaporado à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque o balão de fundo redondo num dessecador durante pelo menos 1 h para garantir que o clorofórmio remanescente e o metanol são evaporados. Para evitar a perda dos grânulos de vidro, a folha de alumínio frouxamente unida deve ser envolvida em torno da abertura inferior redonda do balão.</li>
	<li>Para uma única experiência, misture 100 mg do peptídeo coberto de grânulos de vidro com 60 μL da solução de inchaço, como a PBS. Incubar esta amostra a 25 ° c durante 5 min.</li>
	<li>Centrifugue a amostra rapidamente com um centrifugador Table-Top para sedimento os grânulos de vidro.</li>
	<li>Use uma pipeta para coletar o sobrenadante que contém as vesículas.</li>
</ol>3. transcrição do RNA Aptamer Dbrócolis dentro das vesículas
<ol><li>Limpe o banco do laboratório com as limpezas que contêm a solução da descontaminação de RNase para criar um ambiente de funcionamento RNase-livre.</li>
	<li>Misture o ssDNA (5 μm) compreendendo o promotor T7 e a sequência dbrócolis (gagacggtcgggtccatctgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcagatgtcgagtagagtgtgggctc), assim como a vertente não codificante (5 μm) na água nuclease-livre suplementada com Tampão de reacção de rnapol [40 mm Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mm MgCl2, 1 mm ditiotreitol (DTT) e 2 mm de spermidina], para preparar o modelo de ADN para a reacção de transcrição.</li>
	<li>Incubar a solução a 90 ° c durante 5 min seguido de uma diminuição da temperatura lenta para 20 ° c durante 30 min.</li>
	<li>Prepare uma solução de 1 mM (5Z)-5-(3, 5-difluoro-4-hidroxibenzillideno)-2,3-dimetil-3,5-dihidro-4H-imidazol-4-One (DFHBI) dissolvendo 1,26 mg de DFHBI em 5 mL de DMSO.</li>
	<li>Prepare a reacção de transcrição misturando o tampão de reacção de rnapol [40 mm Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mm MgCl2, 1 mm ditiotreitol (DTT) e 2 mm de spermidina] com 125 mm KCl, 15 mm MgCl2,4mm rntp, 10 μm dfhbi, 200 nm DNA template, 0,5 U/μl RNase inibidor da Murina e da água.</li>
	<li>Logo antes da reação ser iniciada, adicione 4 U/μL T7 polimerase.</li>
	<li>Use esta mistura de reação como a solução de inchaço na etapa 2,7 e incubar a 37 ° c durante a duração do experimento, que é tipicamente 1 h.</li>
</ol>4. transcrição-tradução (TX-TL) reação
Nota: Para a reação da transcrição-tradução, um extrato cru da pilha é exigido assim como o amortecedor da reação e o ADN. O extrato de células brutas é preparado como descrito em Sun et al.18. Para uma reação de TX-TL, use o seguinte: 33% (v/v) do extrato bruto de E. coli , 42% (v/v) tampão de reação, e 25% (v/v) fenol-clorofórmio purificada DNA mais aditivos. As concentrações finais são aproximadamente 9 mg/mL de proteína, 50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzima A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM acampamento, 68 mM ácido folínico, 1 mM de spermidina , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mM maltose, 1 U de T7 RNA polimerase e 50 nM de DNA plasmídeo em água ultrapura.
<ol><li>
Fenol-clorofórmio purificação do modelo de DNA
	<ol>
<li>Prepare seis culturas durante a noite com 5 mL de meio LB e 5 μL de solução de carbenicilina filtrada (filtro 0,22 μm) estéril (100 mg/mL em 50% de EtOH e 50% de água ultrapura).</li>
		<li>Adicione uma pequena raia de um estoque bacteriano pré-fabricado contendo DH5α e. coli com o vetor de expressão pET20b (+) para cada cultura pré-aquecida de 5 ml durante a noite e incubar a 37 ° c por 16 h com 250 rpm. Dependendo de qual peptídeo (EF) ou proteína (YPet ou mVenus) deve ser expresso, um plasmídeo de codificação específico é usado.</li>
		<li>Extraia o plasmídeo com um kit de minipreparação conforme descrito no manual do usuário ou seguindo o protocolo fornecido por Zhang et al.24.</li>
		<li>Prepare 100 μL do DNA plasmídeo pré-purificado (a concentração pode variar de 200 a 600 ng/μL) e misture com 100 μL de roti-fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (pH = 7,5 – 8,0) em um tubo de microcentrífuga para permitir uma melhor separação da fase.</li>
		<li>Inverta suavemente o tubo até 6x e centrifugue por 5 min a 16.000 x g em RT.</li>
		<li>Adicione 200 μL de clorofórmio à fase superior do tubo e inverta o tubo até 6x.</li>
		<li>Centrifugue a amostra em 16.000 x g por 5 min em RT.</li>
		<li>Pipet o sobrenadante a um tubo separado e adicione 10 μL de 3 M de acetato de sódio para a precipitação do etanol.</li>
		<li>Adicione 1 mL de-80 ° c de etanol frio e armazene a amostra a-80 ° c por 1 h.</li>
		<li>Centrifugue a amostra a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° c.</li>
		<li>Decantar o sobrenadante e adicionar 1 mL de-20 ° c frio 70% (v/v) etanol.</li>
		<li>Centrifugador a 16.000 x g durante 5 min a 4 ° c.</li>
		<li>Retire o líquido introduzindo pipetagem. Tenha cuidado para não perturbar o pellet DNA.</li>
		<li>Armazene a amostra em RT por aproximadamente 15 min para evate o etanol restante.</li>
		<li>Adicione a água ultrapura à amostra para ajustar a concentração da amostra a aproximadamente 300 nanômetro, que é medido pela absorção em 260 nanômetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da reacção TX-TL
	<ol>
<li>Descongelar o extrato de células brutas preparadas e o tampão de reação no gelo.</li>
		<li>Para uma mistura de reacção de 60 μL, adicione o ADN plasmídeo (fenol-clorofórmio purificado) a 37,5 μL do tampão de reacção [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzima A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM cAMP, 68 mM de ácido folínico, 1 mM de spermidina, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, e 13,3 mM maltose), seguido pela adição de 28,7 μL de extrato de células brutas. Encha a um volume final com água ultrapura a 58,8 μl.</li>
		<li>Logo antes da reação começar, adicione 1,2 μL da solução de RNA polimerase T7 e misture a amostra com pipetagem para cima e para baixo.</li>
		<li>Use esta mistura de reação como uma solução de inchaço na etapa 2,7 e incubar a 29 ° c durante a duração do experimento, que é tipicamente 4 – 8 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. conjugação de polipeptídeos semelhantes à elastina com fluoróforos via azida catalisada por cobre-cicloadição de alkyne Huisgen
<ol><li>Prepare um vinculador de 20 mM NHS-azide (γ-ácido azidobutírico N-Hidroxisuccinimida Ester) solução em DMSO.</li>
	<li>Misturar 250 μL da solução de ELP (600 μM) com PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L na2HPO4, 0,27 g/l K2hpo4, pH = 7,2) e NHS-azida (1,2 mm) e incubar por 12 h em RT.</li>
	<li>Carregar a amostra numa gaveta de diálise de 10 kDa e armazená-la a 4 ° c durante 12 h em 1 L de água ultrapura para remover os sais e os resíduos de NHS-azida.</li>
	<li>Misture o ELP ativado (500 μM) com a tintura alkyne-conjugated (500 μM), Cy5-alkyne, ou Cy3-alkyne.</li>
	<li>Misture esta amostra com 1 mM de TBTA (Tris (benzyltriazolylmethyl) Amine), 10 mM TCEP (Tris (2-carboxyethyl)-fosfina cloridrato) e 10 mM CuSO4 e incubar a 4 ° c por 12 h.</li>
	<li>Coloque a amostra em uma gaveta de diálise de 10 kDa e armazene-a a 4 ° c por 12 h em 1 L de água ultrapura, para remover os sais e os corantes alkyne-conjugados residuais.</li>
	<li>Estes ELPs Dye-Modified são usados em uma mistura 1:1 do Cy3 etiquetado ELPs e o Cy5 rotulado ELPs análoga aos peptídeos na parte dois.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li>
<li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li>
<li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li>
<li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058(2016).</li>
<li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li>
<li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li>
<li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li>
<li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li>
<li>Chu, H. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+%28ELP%29+in+a+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+and+Microbial+Technology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li>
<li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Expression%2C+Aggregation%2C+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li>
<li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).</li>
<li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li>
<li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li>
<li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin%3A+a+representative+ideal+protein+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation%3A+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li>
<li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0%3A+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li>
<li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+polymersomes%3A+a+comparative+review+towards+cell+mimicking%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li>
<li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broccoli%3A+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+light+scattering%3A+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

A reidratação do filme é um procedimento comum para a criação de pequenas vesículas unilamelares. A principal fonte de falha é o manuseio incorreto dos materiais utilizados no procedimento.

Inicialmente, os ELPs são produzidos por células de E. coli . O rendimento após a purificação de ELP pode variar significativamente dependendo de como o protocolo é conduzido com cuidado durante suas etapas cruciais. Estes são a et...

A criação de sistemas celulares vivos sintéticos é geralmente abordada a partir de duas direções diferentes. No método de cima para baixo, o genoma de uma bactéria é reduzido aos seus componentes essenciais, em última análise, levando a uma célula mínima. Na aproximação bottom-up, as pilhas artificiais são montadas de novo dos componentes moleculars ou dos subsistemas celulares, que precisam de ser integrados funcionalmente em um sistema cell-like consistente.
Na abordagem de de novo, a compartimentação dos componentes bioquímicos necessários é geralmente alcançada usando membranas feitas de fosfolipídios ou ácidos graxos1,2,3,4. Isso porque as membranas celulares "modernas" consistem principalmente de fosfolipídios, enquanto os ácidos graxos são considerados candidatos plausíveis de gabinetes de membrana prebiótica5,6. Para a formação de membranas novas ou para facilitar o crescimento da membrana, os blocos de construção anfifílico devem ser fornecidos do exterior7 ou idealmente com a produção dentro de um compartimento membranous usando os processos anabólicos correspondentes4 ,8.
Enquanto a síntese lipídica é um processo metabólico relativamente complexo, os peptídeos podem ser produzidos bastante prontamente usando reações de expressão gênica sem células9,10. Assim, as membranas peptídicas formadas por peptídeos anfífilos representam uma alternativa interessante para as membranas lipídicas como compartimentos para mímica de células artificiais que são capazes de crescer11.
Os copolímeros de di-bloco de elastina (ELPs) anfífilos são uma classe atrativa de peptídeos, que pode servir como o bloco de construção para tais membranas12. O motivo básico da sequência de aminoácidos de ELPS é (gagvp) n, onde "a" pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina e "n" é o número de repetições de motivo13,14,15,16,17 . Os ELPs foram criados com um bloco hidrofóbico contendo principalmente fenilalanina para um e um bloco hidrófilo composto principalmente de ácido glutâmico11. Dependendo de um e parâmetros de solução, como pH e concentração de sal, ELPs exibem uma transição de temperatura inversa chamada na temperatura Tt, onde os peptídeos passam por uma transição de fase totalmente reversível de um hidrofílico para hidrofóbico Estado. A síntese dos peptídeos pode ser facilmente implementada dentro de vesículas usando o extrato de células bacterianas "TX-TL"11,18,19,20,21, que fornece todos os componentes necessários para a transcrição acoplada e reações de tradução.
O sistema TX-TL foi encapsulado em conjunto, com o modelo de DNA codificando os ELPs em vesículas ELP utilizando desidratação-reidratação de grânulos de vidro como suporte sólido. A formação de vesículas ocorre por meio da reidratação dos peptídeos secos da superfície do cordão11. Outros métodos22 para a formação de vesículas podem ser usados, que potencialmente apresentam menor polidispersão e tamanhos maiores de vesículas (por exemplo, electro-formação, transferência de fase de emulsão ou métodos baseados em microfluínicos). Para testar a viabilidade do método de encapsulamento, a transcrição do aptâmeros fluorogênico dbrócolos23 pode alternativamente ser usada11, que é menos complexa do que a expressão gênica com o sistema TX-TL.
Devido à expressão dos blocos de construção da membrana no vesicobolhosas e sua incorporação subseqüente na membrana, as vesículas começam a crescer11. A incorporação da membrana dos ELPs pode ser demonstrada através de um ensaio do FRET. Para este fim, os ELPs utilizados para a formação da população de vesículas iniciais são conjugados com corantes fluorescentes em partes iguais constituindo um par FRET. Em cima da expressão de ELPS não-etiquetados no vesicobolhosas e de sua incorporação na membrana, os ELPS etiquetados na membrana são diluídos e consequentemente o sinal do fret diminui11. Como um método versátil e comum para a conjugação, o cicloadição catalisado cobre da azida-alkyne é usado. Com o uso de um ligante estabilizante como a Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amine, a reação pode ser realizada em uma solução aquosa em um pH fisiológico sem a hidrólise de reagentes11, que é apropriado para reações de conjugação envolvendo peptídeos.
O protocolo a seguir apresenta uma descrição detalhada da preparação para o cultivo de peptidosomas baseados em ELP. A expressão dos peptídeos e a formação de vesículas utilizando o método de grânulos de vidro são descritas. Além disso, descreve-se como implementar a transcrição do apdomador fluorogênico de Dbrócolos e a reação de transcrição-tradução para expressão protéica dentro das vesículas do ELP. Finalmente, fornecido é um procedimento para a conjugação de ELPs com fluoróforos, que pode ser usado para provar o crescimento da vesícula através de um ensaio FRET11.

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals</td><td>3012-032</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock GelTM tubo</td><td>VWR</td><td>733-2478</td><td></td></tr><tr>Cy3 <td>Sigma-Aldrich</td><td>conjugado com</td><td>alcina</td> 777331 <td></td></tr><tr><td>conjugado com alina Cy5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777358</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidina</td><td>Carl Roth</td><td>CN38.2</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli cepa</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA Kit de Ensaio de Proteína</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Carpenicilina</td><td>Carl Roth</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Carl Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Carl Roth</td><td>4432.1</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth</td><td>P024.1</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>Lucerna Technologies</td><td>410</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>Contas de vidro, lavadas com ácido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (&beta;-isopropil tiogalactosídeo)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Carl Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>82,2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>KK36,3</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Colunas de Cromatografia</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>Ligante NHS-azida (éster oxissuccinimida do ácido y-azidobutírico)</td><td>Baseclick</td><td>BCL-033-5</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Carl Roth</td><td>263.2</td><td></td></tr><tr><td>Listras de pH</td><td>Carl Roth</td><td>549.2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonila</td><td>Carl Roth</td><td>6367.2</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>VWR</td><td>76180-684</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>fosfóricoSigma-Aldrich</td><td>W290017</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoimina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Solução dibásica de fosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Solução monobásica de fosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de reação RNAPol</td><td>NEB</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase murino</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes RNaseZap</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9788</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>NEB</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico</td><td>Carlroth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>RTS Amostrador de Aminoácidos</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer de Diálise, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>8655.1</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Filtrado estéril (0.22 &micro; filtro m)</td> <td>Carl Roth</td><td>XH76.1</td><td></td></tr><tr><td>T7 polimerase</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>TBTA (tris (benziltriazolilmetil) amina)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (cloridrato de tris (2-carboxietil) -fosfina)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (de E. coli)</td> <td>Roche aplicado Ciência</td><td>MRE600</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td></td></tr></tbody></table>

na síntese de vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

A compartimentação das reações bioquímicas é um aspecto central das células sintéticas. Para esta finalidade, os compartimentos peptídicos da reação servem como uma alternativa atrativa aos lipossomas ou aos vesicles ácidos gordos-baseados. Externamente ou dentro das vesículas, os peptídeos podem ser facilmente expressos e simplificar a síntese de precursores de membrana. Fornecido aqui é um protocolo para a criação de vesículas com diâmetros de ~ 200 nm com base no anfífilo elastina-como polipeptídeos (ELP) utilizando desidratação-reidratação de grânulos de vidro. Também são apresentados protocolos para a expressão e purificação de ELP bacteriana através de ciclagem de temperatura inversa, bem como a sua funcionalização covalente com corantes fluorescentes. Além disso, este relatório descreve um protocolo para permitir a transcrição de dbrócolos do aptâmeros do RNA dentro dos vesículas de ELP como um exemplo menos complexo para uma reação bioquímica. Finalmente, um protocolo é fornecido, que permite na expressão do vesicobolhosas de proteínas fluorescentes e do peptide da membrana, visto que a síntese do último conduz ao crescimento do vesícula.

Produção de vesículas A Figura 1 mostra imagens de microscopia eletrônica de transmissão (Met) de vesículas preparadas com diferentes soluções de inchaço e o método de grânulos de vidro (ver também VOGELE et al.11). Para a amostra na Figura 1a, apenas a PBS foi utilizada como solução de inchaço para comprovar a formação de vesículas e determinar seu tamanho. Quando a TX-TL foi utilizada como solução de inchaço (<strong...

Apresentamos aqui os protocolos para a criação de pequenas vesículas unilamelares à base de peptídeos capazes de crescimento. Para facilitar na produção do vesicobolhosas do peptide da membrana, estas vesículas são equipadas com um sistema da transcrição-Tradução e o plasmídeo da peptide-codificação.

Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Em nosso protocolo, usamos re-hidratação de filme de pequenas contas de vidro para formar compartimentos de reação feitos de peptídeos. Em experimentos, beneficiamos da simplicidade e robustez do protocolo. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de incorporar até mesmo amostras sensíveis, como o extrato de célula bruta usada.O contato com solventes orgânicos afetará significativamente a amostra. Para iniciar este procedimento, use um concentrador de vácuo centrífugo para concentrar a solução ELP a 1,1 mililitro. Misture 200 microliters desta solução concentrada com 1.250 microliters de uma mistura de clorofórmio e metanol de dois a um.Vórtice a solução para misturar completamente. Em seguida, adicione 1,5 gramas de contas de vidro esférica a um frasco fundo redondo de dez mililitros. Adicione a solução de metanol ELP e clorofórmio ao frasco fundo redondo e agite suavemente para misturar.Conecte o frasco a um evaporador rotativo. Ajuste a velocidade para 150 RPM e regular a pressão para 20.000 pascals por aproximadamente quatro minutos, até que o líquido seja evaporado à temperatura ambiente. É importante ter cuidado ao usar o evaporador rotativo devido a um possível retardo de ebulição.Depois disso, enrole vagamente a folha de alumínio em torno da abertura do frasco fundo redondo para evitar a perda de contas de vidro e coloque o frasco em um dessecador por pelo menos uma hora, para garantir que o clorofórmio restante e o metanol sejam evaporados. Para um único experimento, misture 100 miligramas das contas de vidro cobertas de peptídeos com 60 microliters de uma solução de inchaço. Incubar esta amostra a 25 graus Celsius por cinco minutos.Use uma centrífuga de mesa para centrifugar as amostras rapidamente e sedimentar as contas de vidro. Em seguida, use uma pipeta para coletar o supernatante, que contém as vesículas. Primeiro, misture 100 microlitadores do DNA plasmídeo pré-purificado com 100 microlitres de roti-phenol, clorofórmio ou álcool isoamílico em um tubo de micro centrífugas para permitir uma melhor separação de fase.Inverta suavemente o tubo até seis vezes e centrífuga a 16.000 vezes g e temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de clorofórmio à fase superior, e inverta o tubo até seis vezes. Centrifugar a amostra a 16.000 vezes g e temperatura ambiente por cinco minutos.Depois disso, pipete o supernascer a um tubo separado e adicione 10 microliters de três acetato de sódio molar para precipitação de etanol. Adicione um mililitro de etanol frio a 80 graus Celsius e armazene a amostra a 80 graus Celsius por uma hora. Em seguida, centrifugar a amostra a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos.Decante o supernascido e adicione um mililitro de etanol frio de 70% a 20 graus Celsius. Centrifugar a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, remova o líquido por pipetação, tomando cuidado para não perturbar a pelota de DNA.Armazene a amostra à temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos para evaporar o etanol restante. Depois disso, adicione água ultra pura à amostra para ajustar a concentração amostral a aproximadamente 300 nanomolar, que é medida por absorção em 260 nanômetros. Para preparar a reação de transcrição-tradução, siga a extração celular bruta preparada e o tampão de reação no gelo.Para uma mistura de reação de 60 microliteres, adicione o DNA de plasma a 37,5 microliters do buffer de reação, adicione 28,7 microliters de extrato celular bruto e preencha com água ultra pura a um volume final de 58,8 microliters. Logo antes da reação começar, adicione 1,2 microliters da solução de polimerase T7RNA e pipeta para cima e para baixo para misturar. Incubar a amostra e uma solução de inchaço a 29 graus Celsius durante a duração do experimento, que normalmente é de quatro a oito horas.Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de vesículas mostram que várias soluções de inchaço, como TX/TL ou mesmo apenas PBS, podem ser usadas para formar vesículas. Para ambas as soluções, a determinação do tamanho é um passo direto. A dispersão dinâmica da luz mostra que as vesículas preparadas sem o método de contas de vidro resultam em um diâmetro de 134 nanômetros, com uma polidispersidade de 25% Quando as contas de vidro são usadas, o diâmetro resulta em 168 nanômetros, com uma polidispersidade de 21%A intensidade de fluorescência de duas proteínas fluorescentes, que são expressas dentro das vesículas ELP, são então medidas usando um leitor de placas de fluorescência.É importante notar que após a formação da vesícula, o conteúdo das vesículas e da solução externa são os mesmos, assim, o antibiótico Kanamycin é adicionado à solução externa para suprimir a expressão proteica. Como controle, a kanamicina também é adicionada à solução de inchaço, nesse caso a expressão proteica dentro da vesícula é suprimida. Isso indica que a Kanamicina não se difunde através da membrana, e suprime a expressão interna constantemente, o tempo todo.O ensaio FRET é então realizado para demonstrar a incorporação de ELP na membrana. Após a expressão dos ELPs de membrana, peptídeos adicionais se incorporam à membrana, o que aumenta a distância média entre os pares DE FRET, e o que resulta em um aumento do sinal de doador. A técnica apresentada pode ser usada para produzir recipientes de reação simples ou para criar células artificiais com membranas à base de peptídeos.O conteúdo interno pode ser escolhido conforme necessário. Usando essas vesículas de peptídeos, agora podemos olhar para a frente em reações de síntese mais complexas dentro delas.

in-vesiculo-synthesis-peptide-membrane-precursors-for-autonomous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este protocolo de detalhes um método para a medida quantitativa da translocação de peptídeos em grandes vesículas lipídicas unilamelares. Este método também fornece informações sobre a taxa de translocação de membrana e pode ser usado para identificar peptídeos que de forma eficiente e espontânea cruz bicamadas lipídicas.

Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

Apresentamos uma técnica para micromanipulação sem contacto das vesículas, usando gradientes de íons cálcio localizadas. Microinjeção de uma solução de íons cálcio, nas proximidades de uma vesícula lipídica gigante, é utilizada para remodelar a membrana lipídica, resultando na produção de saliências de membrana tubular.

Remodelação de membrana das vesículas gigantes em resposta a gradientes de íons cálcio localizadas

Apresentamos um protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e outros componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico e micrométrico.

Construção de redes metabólicas fora de equilíbrio em vesículas nanométricas e micrométricas

Sintetizamos nanostars em forma de estrela de ouro usando um método de crescimento de sementes de prata mediada. O diâmetro do nanostars varia de 200 a 300 nm eo número de dicas variam de 7 a 10. As nanopartículas têm uma ampla ressonância de plasmons de superfície de modo centrado no infravermelho próximo.

Síntese Nanostar ouro com um método de crescimento de sementes de Prata Mediated

Aqui nós descrevemos o uso de uma auto-montagem 3-dimensional andaime para a cultura humana células progenitoras neurais. Nós apresentamos um protocolo para liberar as células da scaffolds a serem analisados ​​posteriormente por exemplo, por citometria de fluxo. Este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de células para realizar estudos detalhados mecanicamente.

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

O protocolo a seguir fornece técnicas para encapsular as células pancreáticas β na etapa de crescimento-PEG-péptido hidrogeles formados por reacções foto-clique tiol-eno. Esta plataforma de material não só proporciona um microambiente cytocompatible para encapsulamento de células, mas também permite que controlado pelo utilizador a recuperação rápida de estruturas de células formadas dentro dos hidrogéis.

Geração e recuperação de β-esferóides de células a partir do passo de crescimento-PEG-péptido Hidrogéis

Jorrando Microfluidic contra uma bicamada lipídica interface de gota fornece uma maneira confiável para gerar vesículas com controle sobre a assimetria da membrana, a incorporação de proteínas transmembrana, e encapsulamento do material. Esta técnica pode ser aplicada ao estudo de uma grande variedade de sistemas biológicos, onde são desejados biomoléculas compartimentadas.

Lipid Bilayer Vesicle Geração Usando Microfluidic jateamento

Descrevemos aqui um método melhorado de transferência de luminescência Ressonância Energia (lRet) onde é considerado um local de clivagem da protease entre os locais fluoróforo doador e receptor. Esta modificação permite a obtenção de sinais lRet específicas decorrentes de proteínas de membrana de interesse, permitindo o estudo de proteínas de membrana, sem purificação de proteínas.

Luminescência Ressonância transferência de energia para estudar mudanças conformacionais na membrana proteínas expressas em células de mamíferos

nanofibras electrospun têm uma área de superfície elevada em relação ao peso, a integridade mecânica excelente, e suportar o crescimento e proliferação celular. Estas nanofibras têm uma ampla gama de aplicações biomédicas. Aqui podemos fabricar queratina / nanofibras PCL, usando a técnica de electrospinning, e caracterizar as fibras para possíveis aplicações em engenharia de tecidos.

Síntese de nanofibras baseado em queratina de Engenharia Biomédica

Complexos polieletrolíticos automontados (PEC) fabricados a partir de heparina e protamina foram depositados em grânulos de alginato para aprisionar e regular a liberação de fatores de crescimento osteogênicos. Essa estratégia de entrega permite uma redução de 20 vezes da dose de BMP-2 em aplicações de fusão espinhal. Este artigo ilustra os benefícios e a fabricação de PECs.

Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio

Aprenda a sintetizar vesículas unilamelares peptídicas para biologia de membranas usando reidratação de filmes com microesferas de vidro. Este método robusto permite incorporar amostras sensíveis como extratos celulares brutos em vesículas de crescimento autônomo.

Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

Explorar mais vídeos