Name: Tratamento transitório de células-tronco pluripotentes humanas com DMSO para promover a diferenciação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprenda a usar DMSO para potencializar a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em linhagens específicas. Este método simples de 24 horas melhora a eficiência para terapia celular e modelagem de doenças.

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Este trabalho foi apoiado por subvenções da faculdade de medicina da Universidade de Stanford e uma bolsa Siebel concedida a S. C.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Em resumo, este protocolo descreve uma ferramenta simples e barata para realçar a capacidade da diferenciação de pilhas de haste pluripotentes (PSCs) a todas as camadas de germe preliminares, vários tipos de pilhas especializadas do progenitor, e mesmo os tipos funcionais, maduros da pilha dentro in vitro e configurações in vivo. Ilustrados são protocolos específicos de diferenciação que foram efetivamente reproduzidos em nosso laboratório, bem como outros, mas qualquer protocolo de diferenciação de escolha pode ser usado após o tratamento DMSO. Como mostrado na tabela 1, vários laboratórios também demonstraram um aprimoramento da diferenciação do PSC após o tratamento com DMSO transiente usando diferentes paradigmas para gerar vários outros tipos de células terminais. Além disso, embora os métodos aqui descrevam o uso de PSCs humanos, o pré-tratamento com DMSO pode ser utilizado em todas as espécies e demonstrou ser efetivo em PSCs de camundongo, coelho e primatas.
Embora doses mais elevadas de DMSO sejam conhecidas como citotóxicas, as baixas doses utilizadas neste método (1%-2%) por um período transitório resultam em morte celular mínima. Quando os números de pilha totais imediatamente depois que o tratamento de DMSO pode diminuir devido à promoção do DMSO da apreensão do ciclo de pilha na fase G1 do ciclo de pilha, os estudos precedentes mostram que as pilhas podem alcangar o mesmo nível de confluência como culturas do controle após a remoção de DMSO3.
A porcentagem e a duração do pré-tratamento de DMSO devem ser otimizadas por linha celular. O tempo de tratamento deve ser ajustado com consideração para o tempo de ciclagem/duplicação das pilhas. Por exemplo, os PSCs do mouse normalmente têm tempos de ciclismo muito mais curtos de cerca de 15 h; assim, o tratamento de DMSO para 15 h para estas pilhas é suficiente. Alguns laboratórios também descobriram que o tratamento com DMSO é benéfico quando continuado durante o protocolo de diferenciação ou em concentrações mais baixas (ver tabela 1). Deve-se notar que algumas linhas do PSC são mais modificáveis à diferenciação para linhagens específicas. Por exemplo, as células HUES6 mostraram-se menos permissivas à diferenciação e, portanto, apresentaram melhora acentuada com o tratamento com DMSO (Figura 2). Alternativamente, as células HUES8 utilizadas na Figura 4 e na Figura 5 demonstraram ter uma maior propensão para a diferenciação endodérmica; assim, menos diferenças foram mostradas entre o controle e o DMSO para a diferenciação nos estágios iniciais para o endoderma definitivo. No entanto, o realce do pré-tratamento com DMSO é observado em estágios posteriores de diferenciação nesta linha celular (Figura 4B). O tratamento DMSO também é versátil em que é eficaz em ambos os sistemas de culturas de células 2D e 3D, ele pode ser usado com vários tipos de material de revestimento em placas de cultura celular, e funciona em diferentes tipos de meio de manutenção que promovem o crescimento e expansão de hPSCs (por exemplo, mTeSR, e8, mídia climatizada de MEF, etc.).
Mais geralmente, esses resultados sugerem que o estado inicial de células-tronco pluripotentes tem forte influência na propensão para diferenciação inicial, bem como na diferenciação terminal em tipos de células funcionais. Nós mostramos previamente que o tratamento DMSO funciona com o RB em hpscs3,5. RB desempenha um papel importante na promoção da diferenciação terminal, sobrevivência celular, e a estabilidade genética das células41,42,43,44, e pode, portanto, explicar os efeitos persistentes sobre as células diferenciado dos hPSCs tratados com DMSO. Visando esses primeiros modos de regulação pode colocar hPSCs em uma melhor trajetória para a diferenciação e, finalmente, melhorar a sua utilidade para a medicina regenerativa.

O uso de células-tronco pluripotentes levou a inúmeros avanços na pesquisa biomédica, incluindo os campos de medicina regenerativa e terapias baseadas em células-tronco, modelagem de doenças e triagem de drogas. Conduziu também à perspectiva global de uma investigação mais traduzível e de uma medicina personalizada. O advento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) há mais de 20 anos permitiu que pesquisadores desenvolvessem células-tronco pluripotentes a partir de tecidos somáticos e diferenciá-los em tipos de células funcionais para estudar uma variedade de patologias, incluindo doenças cardiovasculares, neurológicas e imunológicas. Embora avanços significativos tenham sido feitos na tecnologia de diferenciação de células-tronco, os desafios na diferenciação efetiva de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e iPSCs ainda persistem, limitando o uso generalizado da tecnologia de células-tronco em diferentes programas de pesquisa. A variabilidade inerente em diferentes linhagens celulares e clones continua a representar obstáculos para diferenciar as linhagens de células-tronco para as linagens desejadas1. Além disso, derivar células funcionais, terminalmente diferenciadas de hPSCs continua sendo um processo tedioso e ineficiente em muitas linhagens. Na verdade, as células diferenciadas de hPSCs muitas vezes não conseguem se diferenciar terminalmente em células funcionais2. Em outras terapias baseadas em células-tronco em movimento para uso em pacientes, há uma necessidade de melhorar e garantir a eficácia das células que são geradas a partir de hPSCs.
Nosso laboratório estabeleceu uma ferramenta rápida e barata para aumentar significativamente a eficiência de diferenciar iPSCs e ESCs em tipos de células maduras. Nós encontramos que o pré-tratamento de hipscs e de hESCs com o dimetil sulfóxido comumente usado do reagente (DMSO) para 24 h a 48 h antes da diferenciação dirigida conduz a uma melhoria marcada na capacidade da diferenciação da pilha de haste. O tratamento com DMSO aumenta a proporção de hiPSCs e hESCs na fase inicial do G1 do ciclo celular e ativa a proteína de retinoblastoma (RB)3, um regulador crítico de proliferação celular, sobrevivência e diferenciação4. Em trabalhos mais recentes, verificou-se que RB e seus membros da família são necessários para os efeitos pró-diferenciação do DMSO, de modo que a inativação transitória do RB suprime os efeitos do DMSO, enquanto a ativação constitutiva do RB de forma transitória aumenta Efeitos do DMSO5. Análoga ao ciclo celular durante o desenvolvimento embrionário, o ciclo celular de ESCS e iPSCs é caracterizado por uma fase abreviada do G1 que promove a autorenovação6,7,8. Esta fase abreviada do G1 permite uma proliferação mais irrestrita, mas limita o potencial de diferenciação de4,9. Promovendo a apreensão do crescimento em G1 e ativando controles do ponto de verificação no ciclo de pilha de hESCs e de iPSCs, o tratamento de DMSO primos pilhas para mudanças do destino da pilha que seguem a diferenciação dirigida.
Até o momento, o pré-tratamento com DMSO demonstrou melhorar a capacidade de diferenciação para todas as três camadas germinativas em mais de 30 controle e as linhas de células ESC e IPSC humanas específicas da doença3,5 , bem como a diferenciação de células-tronco e outras linhas celulares para uma variedade de outros tipos de células maduras em estudos subsequentes10,11,12,13,14,15,16, 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 (tabela 1). Além disso, o tratamento com DMSO demonstrou ser eficaz no aprimoramento da diferenciação de células primárias não humanas21,23 (por exemplo, mouse, Primaz, coelho), sugerindo mecanismos compartilhados entre espécies. Por fim, o pré-tratamento com DMSO também foi estendido para a tecnologia de edição de genes, com um estudo específico mostrando que 24 h de pré-tratamento de DMSO de hESCs/iPSCs aumentaram significativamente a capacidade de repetições Palindromicas curtas agrupadas regularmente Interespaçadas (CRISPR) /Proteína-9 associada (Cas9)-eficiência de edição mediada de DNA não-codificante sem incorporar mutações não intencionais29. Aqui é fornecida uma metodologia detalhada do pré-tratamento do DMSO de hESCs e iPSCs para aplicações em biologia de células-tronco e diferenciação direcionada.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células Multipoços Tratadas com TC de Fundo Plano Transparente de 6 poços</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>placa de agitação de 9 posições&nbsp;</td><td>Chemglass</td><td>CLS-4100</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI</td><td></td><td>Gibco 12633012</td><td></td></tr><tr><td>Alk5i II</td><td>Axxora</td><td>ALX-270-445</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinóico totalmente trans&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>anti-Brachyury</td><td>R& D Systems</td><td>AF2085</td><td>Nenhuma variabilidade observada em diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-peptídeo C Estudos de</td> Desenvolvimento Banco de <td>Hibridoma</td><td>GN-ID4</td><td>Nenhuma variabilidade observada em diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-FoxA2</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>Nenhuma variabilidade observada em diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-Nkx2.2</td><td>Universidade de Iowa, Banco de Hibridoma de Desenvolvimento</td><td>74.5A5</td><td>Nenhuma variabilidade observada em diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-Nkx6.1</td><td>Universidade de Iowa, Banco de Hibridoma de Desenvolvimento; &nbsp;</td><td>F55A12-sobrenadante</td><td>Nenhuma variabilidade observada em diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-Olig2</td><td>EMD Millipore</td><td>MABN50</td><td>Nenhuma variabilidade observada em diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-Pax-6</td><td>Biolegend</td><td>901301</td><td>Nenhuma variabilidade observada em diferentes números</td></tr><tr><td>de lote anti-Pdx1</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>Nenhuma variabilidade observada em diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-SOX1&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>AF3369</td><td>Nenhuma variabilidade observada em diferentes números</td></tr><tr><td>de lote anti-SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>Nenhuma variabilidade observada em diferentes números de lote</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento, menos Vitamina A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Fator básico de crescimento de fibroblastos</td><td>Gibco</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>Betacelulina</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>50932345</tr><tr><td>Chir99021</td><td>Stemgent</td><td>04-000-10</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 1066</td><td>Corning</td><td>99-603-CV</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contador de Células Automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAF1000</tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G7528&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Spinner Descartáveis</td><td>Corning, VWR</td><td>89089-814</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Media</td><td>Gibco</td><td>A1516501</td><td></td></tr><tr><td>FAF-BSA</td><td>Proliant&nbsp;</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>PeproTech</td><td>100-19</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heparina&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina Humana Ultrassensível ELISA</td><td>ALPCO Diagnostics</td><td>80-INSHUU-E01.1</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>51500056</tr><tr><td>KGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-19</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-3,3&prime;,5-Triiodotironina (T3)</td><td>EMD Millipore</td><td>642245</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>Matriz Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131&nbsp;</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>15-100-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S3817&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Noggin Fc Quimera Proteína</td><td>R& D Systems</td><td>3344-NG-050</td><td></td></tr><tr><td>PdBU EMD</td><td>Millipore</td><td>524390</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina&nbsp;</td><td>Mídia</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Sant1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4572</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agonista Suavizado, SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de Ultra-Baixo Anexo Gibco</td><td></td><td></td> 12604013 TrypLE Corning 3471 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Vitamina C Sigma-Aldrich A4544&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R& D Systems</td><td>5036-WN</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748</td><td></td></tr><tr><td>XXI</td><td>EMD Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>StemCell Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

tratamento transitório de células-tronco pluripotentes humanas com dmso para promover a diferenciação

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Apesar do uso crescente de pilhas de haste pluripotentes (PSCs), os desafios em diferenciar eficientemente as pilhas de haste pluripotentes embrionárias e induzidas (ESCs e iPSCs) através das várias linhagens permanecem. Inúmeros protocolos de diferenciação foram desenvolvidos, mas a variabilidade entre as linhas celulares e as baixas taxas de diferenciação concebe desafios na implementação bem-sucedida desses protocolos. Descrito aqui é um meio fácil e barato para aumentar a capacidade de diferenciação de PSCs. Tem sido mostrado previamente que o tratamento de pilhas de haste com uma baixa concentração de dimetil sulfóxido (DMSO) aumenta significativamente a propensão de uma variedade de PSCs para diferenciar-se aos tipos diferentes da pilha que seguem a diferenciação dirigida. Esta técnica foi mostrada agora para ser eficaz através das espécies diferentes (por exemplo, rato, primata, e ser humano) em linhagens múltiplas, variando dos neurônios e dos esferoides corticais às pilhas de músculo lisas e aos hepatocytes. O pré-tratamento de DMSO melhora a diferenciação do PSC regulando o ciclo de pilha e as pilhas de haste de escorva para ser mais responsivo aos sinais da diferenciação. Fornecido aqui é a metodologia detalhada para usar esta ferramenta simples como um meio reprodutível e extensamente aplicável para diferenciar mais eficientemente PSCs a toda a linhagem da escolha.

A geração de tipos de células diferenciadas a partir da célula-tronco pluripotente humana (hPSCs) possui grande promessa terapêutica, mas permanece desafiadora. PSCs muitas vezes exibem uma incapacidade inerente para diferenciar mesmo quando estimulado com um conjunto adequado de sinais. Descrito aqui é uma ferramenta simples para melhorar a diferenciação multilinhagem através de uma variedade de linhas PSC.

Tratamento transitório de células-tronco pluripotentes humanas com DMSO para promover a diferenciação

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

É um tratamento simples que pode ser aplicado a qualquer linha de células-tronco ou protocolo de diferenciação às células prime para diferenciação. Tudo o que é preciso fazer é adicionar DMSO a 1-2% no meio de manutenção da cultura celular. A principal vantagem dessa técnica é que permite aumentar significativamente o potencial de diferenciação das células-tronco pluripotentes em qualquer linhagem de escolha, escorraçando células para diferenciação.O tratamento com DMSO aumenta a chance de que as células se diferenciem dos iPSCs derivados do paciente, permitindo que sejam usados para terapia de substituição celular, modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos. Pode dar origem ao início precoce da regulação que controla a sub-proliferação, a diferenciação e a especificação durante o desenvolvimento embrionário. Demonstramos que o tratamento DMSO melhora a diferenciação em quase 50 linhas de células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas.Enquanto outros laboratórios mostraram que é benéfico para células-tronco de outras espécies, como rato e primata. Um dia antes do início da diferenciação, adicione DMSO a uma concentração de 1 ou 2% por 24 horas no seu meio de manutenção típico. 24 horas após o tratamento DMSO, substitua o meio e prossiga com o seu protocolo de diferenciação habitual.Cultivar células de acordo com as instruções do manuscrito. Quando as células atingirem uma confluência apropriada, dissociá-las e preparar uma única suspensão celular. Conte as células vivas com um hemócito ou contador automático de células, usando um marcador de viabilidade, como o azul tripano.Para alcançar 80-90% de confluência dentro do pré-tratamento DMSO de 24 horas, coloque as células em uma placa revestida de seis poços a uma densidade de 500.000 a 1 milhão de células por poço. Incubar as células por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Em seguida, aspire a mídia e substitua-a por uma solução DMSO de 1-2%.Permita que as células incubam por 24-28 horas antes da diferenciação. Se incubar por 48 horas, substitua a mídia após 24 horas por uma nova solução DMSO. Para alcançar a diferenciação da cultura 3D, cresça e colete as células em uma suspensão celular.Conte as células vivas e as emplaque em uma placa de seis poços não revestida e de baixa fixação na mídia de células-tronco com inibidor de ROCHA. Normalmente, as esferas de células-tronco pluripotentes humanas 3D se formarão dentro de 24 horas. Permita que as células incubam por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono.Prepare 1-2% DMSO em mídia de células-tronco pré-aquecidas de acordo com as instruções do manuscrito. Para substituir a mídia após a incubação, incline a placa para um ângulo de 30 graus a 45 graus e permita que as esferas celulares se instalem na parte inferior do poço. Aspire a mídia das células e suspenda-as suavemente na solução DMSO.Permita que as células incubam por 24-48 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Pré-tratar células com DMSO como descrito para culturas 2D e preparar soluções de estoque noggin e SB431542. Prepare o suficiente 10% de substituição de soro de nocaute, ou KOSR, em DMEM nocaute para três a quatro dias de mudança de mídia.Prepare a mídia de diferenciação ectodérmica adicionando noggin e SB431542 ao DMEM de nocaute KOSR pré-aquecido, conforme descrito no manuscrito. Após o pré-tratamento do DMSO, aspire a mídia das células e adicione dois mililitros de mídia de diferenciação a cada poço. Permita que as células incubam por três a quatro dias a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono, substituindo a mídia diariamente por novos fatores de diferenciação.O pré-tratamento do DMSO resulta em uma diminuição transitória e dependente de doses na taxa de crescimento celular em comparação com células não tratadas. Essa diminuição da proliferação está associada ao aumento do contato celular-celular, que é especialmente pronunciado nas células tratadas com DMSO de 2%. Quando as células são fixas e manchadas para marcadores prototípicos de cada camada de germe, pode-se ver que 2% de pré-tratamento DMSO resulta em uma proporção aumentada de células de camada germinamentimentada diferenciadas.Por exemplo, sox17 foi manchado para visualizar células de endoderme. A fim de investigar o efeito do DMSO na diferenciação para os tipos de células progenitoras do sistema nervoso central, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem poderiam ser diferenciadas em células progenitoras neurais ou células progenitoras oligodendrocyte. Em comparação com as células de controle, 2% do pré-tratamento DMSO aumenta a expressão do marcador celular progenitor neural Pax6.Da mesma forma, o pré-tratamento aumenta a proporção de células expressando oligodendrocyte progenitor marcador celular Olig2. Além disso, o tratamento inicial de DMSO melhora a função celular derivada de células-tronco embrionárias humanas após o transplante in vivo. Quando células progenitoras pancreáticas diferenciadas são transplantadas em camundongos imunodeficientes, sua funcionalidade pode ser testada em resposta a um desafio de glicose ou estimulação de KCl.Melhorias na funcionalidade celular são evidentes de duas semanas a 16 semanas após o transplante. A consideração mais importante a levar em conta é o tempo de ciclismo ou duplicação de suas células-tronco. O comprimento do tratamento DMSO deve ser o mesmo que o tempo de ciclismo das células.Após o tratamento inicial do DMSO, pode-se entender como a proliferação celular e o ciclo celular são regulados em células-tronco, pois o tratamento ajuda a promover a prisão de crescimento na fase G1 do ciclo celular. As células diferenciadas podem ser utilizadas para compreender mecanismos relacionados à doença, para co-cultivo com outros tipos de células, em ensaios de tumorigenicidade, e em ensaios funcionais ou estudos de transplante para determinar se as células diferenciadas podem resgatar um fenótipo da doença.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra o método para melhorar a diferenciação de células-tronco com tratamento transitório de DMSO, que prende as células na fase G1. Após o tratamento, um meio de diferenciação ectodérmica com inibidores de BMP e TGF-β é adicionado para promover a formação de precursores neurais.

Aprimorando a diferenciação de células-tronco com um tratamento transitório de DMSO

O vídeo demonstra uma técnica para diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) em células progenitoras neurais (NPCs). Inicialmente, os hiPSCs são cultivados em uma camada alimentadora de fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs). Posteriormente, as células são destacadas e transferidas para uma placa revestida com biopolímero para permitir que os MEFs adiram e se separem dos hiPSCs. Os hiPSCs suspensos são então transferidos para uma placa de fundo em V e...

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas em Células Progenitoras Neurais

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Este trabalho descreve um protocolo in vitro de diferenciação para produzir pigmentadas, melanócitos maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas através de uma crista neural e melanoblasto estágio intermediário usando um protocolo sem alimentador de 25 dias.

Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Descrevemos em detalhes dois protocolos de base química para cultivo de células-tronco embrionárias do mouse. Esse novo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidação mediada por Tet (vitamina C) e reprimindo a síntese de novo de 5-metilcitosina (por PD0325901) para manter o DNA hypomethylation e pluripotência das células-tronco embrionárias do mouse.

Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

Apresentamos um protocolo para a reversão química, em massa, rápida e eficiente de células-tronco pluripotentes de humana linhagem-aprontadas convencional (hPSC) em um estado de pré-implantação epiblasto como pluripotentes epigenomically-stable ingênuo. Esse método resulta em diminuição da expressao linhagem-aprontadas e melhora acentuada na diferenciação de multilineage direcionada através de um amplo repertório de linhas hPSC convencional.

Reversão química de células-tronco pluripotentes humanas convencionais para um estado de ingenuidade com potência melhorada Multilineage diferenciação

Este protocolo detalha um monolayer, método soro-livre para gerar eficientemente Hepatocyte-como pilhas das pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em 18 dias. Isto implica seis etapas como hPSCs se diferenciam seqüencialmente em tipos de células intermediárias, como a raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior e progenitores de broto hepático antes de formar células como hepatócitos.

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.

Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema automatizado de cultura de células. Este sistema de cultura automatizado reduz o trabalho e beneficia os usuários, incluindo pesquisadores não familiarizados com o manuseio de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), desde a manutenção de células iPS até a diferenciação em vários tipos de células.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Manutenção e Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Este protocolo descreve e compara dois métodos representativos para diferenciar hiPSCs em células estromais mesenquimais (CTMs). O método da monocamada é caracterizado por menor custo, operação mais simples e diferenciação osteogênica mais fácil. O método dos corpos embrionários (BEs) é caracterizado por menor consumo de tempo.

Comparação de Dois Métodos Representativos para Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos em Células Estromais Mesenquimais

Aprenda a usar DMSO para potencializar a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em linhagens específicas. Este método simples de 24 horas melhora a eficiência para terapia celular e modelagem de doenças.

Tratamento transitório de células-tronco pluripotentes humanas com DMSO para promover a diferenciação

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