Name: Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a diferenciação pan-mieloide de células CD34+ do sangue de cordão umbilical humano. Este método permite estudar as quatro linhagens mieloides e investigar mutações em doenças hematopoieticas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a Wendy Barrett, Rachel Caballero, e Gabriella Ruiz de Maricopa sistemas integrados de saúde para as unidades de sangue de cabo de-identificado e doado, Mrinalini Kala para assistência com citometria de fluxo, e bandidos gays e Christopher seet para aconselhamento sobre diferenciação mielóide ex vivo. Este trabalho foi apoiado por fundos para S.S. dos institutos nacionais de saúde (R21CA170786 e R01GM127464) e da sociedade americana de câncer (a pesquisa institucional Grant 74-001-34-IRG). O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.

O sangue do cordão umbilical humano para experimentação foi doado por indivíduos sadios após consentimento informado para a Maricopa sistemas integrados de saúde (MIHS), Phoenix. As unidades desidentificadas foram obtidas por meio de um acordo de transferência de material entre a MIHS e a Universidade do Arizona.
1. reagentes e amortecedores
Nota: Prepare todos os reagentes e tampões condições estéreis em um armário de segurança biológico.
<ol><li>Prepare o tampão estéril de PBS-BSA-EDTA (PBE) adicionando 7,2 mL da albumina de soro bovina estéril de 35% (BSA; use a classe estéril 35% BSA da cultura do tecido) e 5 mL do ácido tetra acético da diamina do etileno de 0,5 M estéril (EDTA) a 487,8 mL do fosfato de Dulbecco estéril tamponado soro fisiológico (DPBS). O filtro esteriliza e de-gás o amortecedor deixando o filtro anexado ao vácuo em um armário de segurança biológico para pelo menos 2 h. aliquot o tampão de-gabastecido em volumes menores (250 mL) e armazene em 4 ° c.</li>
	<li>Prepare a solução de sal equilibrada de 1x Hanks (1x HBSS). Diluir 100 mL de estoque de 10x HBSS em 900 mL de água destilada estéril para fazer 1 L de 1x HBSS e ajustar o pH para 7,2. O filtro Esteriliza o 1x HBSS antes de usar.</li>
	<li>Prepare 2% de solução de ácido acético adicionando 2 mL de ácido acético glacial a 98 mL de água destilada.</li>
	<li>Prepare 20 ng/mL solução de fragmento de fibronectina humana recombinante em 1X PBS. Faça 10 mL por placa 48-well.</li>
	<li>Prepare 2% BSA. Para 100 mL 1X PBS, adicione 2 gramas de fração BSA V. filtro esterilizar antes de usar.</li>
	<li>Faça o meio modificado da águia de Dulbecco completo (DMEM) adicionando o pó de DMEM, o bicarbonato de sódio do GM 3,7, o soro fetal do bovino de 100 mL (FBS) e a penicilina-estreptomicina de 5 mL (picosegundo) a 800 mL da água destilada estéril. Misture e compo o volume a 1 L, e esterilize o filtro antes de usar-se.</li>
	<li>Prepare o meio de congelação misturando 90 mL de FBS e 10 mL de dimetil sulfóxido estéril (DMSO).</li>
	<li>Prepare o meio de estimulação. Ao meio livre do soro, adicione a L-glutamina a 2 milímetros, e as citocinas a uma concentração final de 50 ng/ml para o fator da pilha de haste (SCF), o thrombopoietin (TPO), e o ligante da tirosina quinase 3 de FMS-como (Flt3L), e 20 ng/ml para interleukin-3 ( para a preparação de soluções em estoque de citocinas). Faça 5 mL por placa 48-well.</li>
	<li>Prepare o meio de diferenciação mielóide 1x. Para completar DMEM, adicionar citocinas a uma concentração final de 5 ng/mL para SCF, Flt3L, e IL3, 50 ng/mL para TPO, e 4 unidades/mL para eritropoietina (EPO). Faça 5 mL por placa 48-well.</li>
	<li>Prepare o meio de diferenciação mielóide 2x. Para completar o DMEM, adicione citocinas a uma concentração final de 10 ng/mL para SCF, Flt3L e IL3, 100 ng/mL para TPO e 8 unidades/mL para EPO. Faça 5 mL por placa 48-well.</li>
	<li>Prepare o tampão da citometria do fluxo. Para 1 L de 1X PBS, adicione 10 g de fração BSA V.</li>
	<li>Prepare 1% paraformaldeído em 1X PBS (ver tabela de materiais para mais detalhes).</li>
	<li>Prepare a solução de poli-L-lisina adicionando 500 μL de 10 mg/mL de poli-L-lisina a 49,5 mL de 1X PBS.</li>
</ol>2. isolamento de células mononucleares do sangue do cordão umbilical
Nota: Para o protocolo descrito abaixo, foram utilizados volumes sanguíneos de cordão umbilical de 90 a 100 mL. O isolamento das células CD34+ deve ser realizado condições estéreis em um armário de segurança biológico.
<ol><li>Pulverize o saco que contem UCB com o etanol 70% para esterilizar a superfície exterior antes de introduzi-la no armário de segurança biológico. Transfira o UCB para um frasco de plástico estéril de 250 mL e dilui-o 1:1 adicionando um volume igual de temperatura ambiente (RT) 1x HBSS.</li>
	<li>Dispensar 15 mL de meio de fraccionamento MNC (MFM; ver tabela de materiais) por tubo em cerca de seis tubos estéreis 50 ml cônicos. Incline o tubo com MFM e despeje suavemente 30 mL de UCB diluído na camada MFM sem perturbá-lo.</li>
	<li>Centrifugue os tubos a 400 x g durante 30 min em RT com aceleração lenta e sem travão.</li>
	<li>Após a centrifugação, aspirar entre 15-20 mL do plasma acima da camada de MNC. Recolha suavemente as MNCs com uma pipeta e transfira para um novo tubo cônico de 50 mL. Nota: O depósito de MNCs como uma camada branca da Buffy na relação do plasma e do MFM, e os glóbulos vermelhos (RBCs) sedimento na parte inferior do tubo cônico.</li>
	<li>Os MNCs da Associação coletaram de 2-3 tubos junto. Compo o volume de cada tubo a 50 mL com o amortecedor frio de PBE.</li>
	<li>Centrifugue os tubos a 300 x g durante 10 min a 4 ° c, com o travão em baixo.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e bata o tubo suavemente para soltar o pellet celular.</li>
	<li>Resuspender as células peletizadas em 5 mL de tampão PBE gelado. Use as mesmas 5 mL de células resuspensas para coletar células de outros tubos. Combine células de 3 a 4 tubos em conjunto em 1 50 mL de tubo cônico.</li>
	<li>Para recolher todas as células restantes, lave todos os tubos com 5 mL de tampão PBE frio e adicione ao tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Conte as MNCs diluindo 10 μL de suspensão celular em 490 μL de solução de ácido acético. Nota: O ácido acético lise qualquer contaminando RBCs para permitir a contagem mais fácil de MNCs.</li>
	<li>Compo o volume da suspensão da pilha a 50 mL com o amortecedor Ice-Cold de PBE. Centrifugue as pilhas em 300 x g por 10 minutos em 4 ° c, com freio em baixo. Nota: A suspensão de MNC pode ser processada imediatamente para o isolamento de células CD34+ ou congelada para aplicações posteriores.</li>
	<li>Para congelar as MNCs, retire o sobrenadante e Resuspenda a uma densidade de 2 x 107 células/ml em meio de congelação em RT.</li>
	<li>Congele as pilhas em-80 ° c durante a noite em um recipiente de congelação da pilha e transfira-os então ao nitrogênio líquido.</li>
</ol>3. isolação de pilhas de CD34+ das pilhas mononuclear
<ol><li>Se o uso de MNCs recém-isolados prosseguir diretamente para a etapa 3,3.</li>
	<li>Se estiver usando MNCs congelados, descongele rapidamente as células congeladas em um banho de água de 37 ° c e transfira para um tubo cônico de 50 mL. Colete todas as células restantes nos frascos com 1 mL de tampão PBE gelado e transfira para o tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Compõem o volume da suspensão MNC para 50 mL com tampão PBE frio e centrifugador a 600 x g durante 5 min a 4 ° c.</li>
	<li>Retire o sobrenadante e bata o tubo suavemente para soltar o pellet celular. Re-suspender as MNCs para 1 x 108 células em 300 μL de Ice-Cold PBE buffer.</li>
	<li>Adicione 100 μL de reagente de bloqueio de FcR do jogo humano do microbead do CD34 da classificação de pilha (MACS) magnética-ativada por 1 x 108 MNCs e misture delicadamente. Nota: Isto obstrui a ligação inespecíficos aos microbeads CD34.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de microesferas CD34 por 1 x 108 células. Misture suavemente e incubar a 4 ° c durante 30 min num frigorífico. Não incubar no gelo.</li>
	<li>Enquanto as células estão incubando, coloque uma coluna LS e filtro de pré-separação no campo magnético do separador MACS. Equilibrar a coluna com o tampão PBE gelado adicionando 2 mL directamente na coluna e 1 mL no filtro de pré-separação. Permita que a coluna esvazie em um tubo cônico de 15 mL e descarte o fluxo.</li>
	<li>Remova as MNCs de 4 ° c, adicione o amortecedor PBE Ice-Cold para compo o volume a 15 mL, e Centrifugue as pilhas em 300 x g por 10 minutos em 4 ° c, com o freio em baixo.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e resuspender as células em 1 mL de tampão PBE gelado.</li>
	<li>Adicione a suspensão da célula ao filtro de pré-separação colocado na coluna LS. Nota: O filtro de pré-separação remove quaisquer agregados de células grandes que podem bloquear a coluna.</li>
	<li>Enxague o tubo com 3 mL de tampão PBE gelado e adicione-o ao filtro de pré-separação colocado na coluna LS. Depois disso, descarte o filtro de pré-separação.</li>
	<li>Lave a coluna LS quatro vezes adicionando 3 mL de tampão PBE gelado, permitindo que a coluna escorra cada vez. Nota: As células CD34+ permanecerão vinculadas à coluna e as células sem rótulo fluirão pela coluna.</li>
	<li>Após a lavagem final, retire a coluna do campo magnético do separador MACS e coloque-a num novo tubo cônico de 15 mL, longe do íman.</li>
	<li>Adicione 5 mL de tampão PBE gelado à coluna e expelir as células CD34+ ligadas empurrando firmemente o êmbolo.</li>
	<li>Opcionalmente, passe células CD34+ isoladas da primeira coluna sobre outra coluna ls com o filtro de pré-separação, conforme descrito acima (etapas 3.10 − 3.13).</li>
	<li>Conte as células CD34+ isoladas com azul de Tripan (10 μL de células e 10 μL de azul de Tripan) para determinar o número total de células ao vivo. Nota: Nesta fase, as células CD34+ isoladas podem ser congeladas para uso posterior ou podem ser processadas diretamente para análise de HSPCs por citometria de fluxo (seção 4) ou para diferenciação em células de linhagem mielóide (seção 5).</li>
	<li>Centrifugue a suspensão da pilha em 600 x g por 5 minutos em RT, com freio em baixo.</li>
	<li>Para congelar as células CD34+ , aspirar o sobrenadante e re-suspender até 5 x 106 células em 1 ml de congelamento médio e congelar como descrito acima (passo 2,13). Caso contrário, prossiga para a seção 4 ou 5.</li>
</ol>4. determinação de populações de caule e progenitoras por citometria de fluxo
<ol><li>Para determinar as frações das populações de tronco e progenitoras no recém-isolado CD34+ hspcs, centrifugue-os a 600 x g por 5 min e Resuspenda 1 x 106 células em 50 μL de tampão de citometria de fluxo.</li>
	<li>Para 1 x 106 células CD34+ , adicione anticorpos (ver tabela de materiais para diluições) a marcadores de linhagem (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 e CD235a — todos os FITC rotulados), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) e 7- aminoactinomicina D (7-AAD; como uma mancha viva/morta) e compõem o volume total para 100 μL. Incubar no gelo no escuro por 20 min. Nota: Menos de 1 x 106 células CD34+ podem ser empregadas para análise. Se manchar menos células, o volume total e o volume de anticorpos adicionados devem ser reduzidos em conformidade. Para a análise de citometria de fluxo, as MNCs não manchadas e únicas devem ser usadas como controles para a fixação de portões positivos e negativos para cada fluoróforo.</li>
	<li>Após a incubação, lave as células com 1 mL de tampão de citometria de fluxo e centrifugue a 600 x g durante 5 min.</li>
	<li>Opcionalmente, fixar as células manchadas em 0,5 mL de 1% solução paraformaldeído por 10 min no escuro em RT.</li>
	<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 min e aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Lave as células fixas/manchadas com 1 mL de tampão de citometria de fluxo e centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 ° c.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante, re-suspender as células em 500 μL de tampão de citometria de fluxo, e analisar por um citometro de fluxo (tabela de materiais).</li>
</ol>5. diferenciação mielóide da haste hematopoiética CD34+ e células progenitoras
Nota: Para diferenciar o CD34+ hspcs às pilhas myeloid da linhagem, são estimulados primeiramente em placas revestidas humanas de recombinação do fragmento do fibronectina e semeadas então em uma camada de pilhas STROMAL MS-5 no meio myeloid da diferenciação. A diferenciação pode ser monitorada a cada semana durante 3 semanas com base na expressão de marcadores de superfície celular específicos para as quatro linhagens mielóides. Durante a estimulação e a diferenciação, todas as incubações são executadas em 37 ° c e em 5% CO2 em uma câmara humidificada. Todas as etapas devem ser executadas em um armário de segurança biológico.
<ol><li>Cubra os poços de uma placa 48-well estéril não revestida adicionando 200 μL/poço da solução humana de recombinação do fibronectina em 1X PBS para 2 h em RT.</li>
	<li>Após 2 h, Retire cuidadosamente a solução de fibronectina humana recombinante e elimine-a.</li>
	<li>Bloqueie os poços com 200 μL/poço de 2% de BSA por 30 min em RT.</li>
	<li>Aspirar a solução de BSA e lave os poços duas vezes com 500 μL de 1X PBS estéril. Nota: As placas revestidas do fragmento de fibronectin podem ser armazenadas em 4 ° c por até 2 semanas.</li>
	<li>Para estimular o CD34+ hspcs, re-suspender as células recém-isoladas (a partir do passo 3,17) em uma densidade de 1 x 105 células/200 μl ou 5 x 105 células/ml de meio de estimulação quente 1x.</li>
	<li>Se estiver usando células CD34+ congeladas, descongele e transfira rapidamente as células para um tubo cônico de 15 ml contendo DMEM completo quente. Centrifugue a 600 x g durante 5 min e Resuspenda as células conforme descrito no passo 5,5.</li>
	<li>Placa 200 μL da suspensão de células CD34+ por poço do fragmento de fibronectina revestido placa de 48 poços e incubar para 48 h.</li>
	<li>No dia seguinte, sementes 15.000 MS-5 células estromais em 200 μL de DMEM completo por poço de uma cultura de tecido 48 bem tratada e incubar a 37 ° c por 24 h.</li>
	<li>Após 48 h da estimulação, colete as pilhas de CD34+ pela pipetagem delicada. Lave os poços com 500 μL de DMEM quente e piscina com a suspensão celular.</li>
	<li>Conte as células com azul de Tripan. Centrifugue a suspensão a 600 x g durante 5 min e Resuspenda a uma densidade de 5.000 células/200 μL de meio de diferenciação mielóide 1x.</li>
	<li>Da placa da cultura do tecido 48-well semeado com as pilhas stromal MS-5, Aspire delicadamente o meio sem perturbar as pilhas. Camada 200 μL (5.000 células) da suspensão de células CD34+ por poço da placa e incubar a 37 ° c. Nota: A cultura das células MS-5 pode ser mantida em DMEM completo. No dia em que as células CD34+ são semeadas, as células MS-5 devem estar em uma camada uniforme (80-90% de confluência). Recomenda-se que as pilhas MS-5 estejam chapeadas pelo menos 24 horas antes da semeadura das pilhas de CD34+ .  Se as pilhas MS-5 devem ser chapeadas 48 h ou 72 h antes de semear as pilhas CD34+ , a densidade da pilha deve ser ajustada conformemente. Recomenda-se também que os poços periféricos da placa 48-well sejam deixados em branco ou preenchidos com 200 μL de água estéril para evitar efeitos de aresta.</li>
	<li>Realize uma mudança meio-média a cada 3 − 4 dias, removendo suavemente 100 μL do meio da parte superior de cada poço e substituindo-o por 100 μL de meio de diferenciação mielóide 2x por poço.</li>
	<li>No 21º dia, colher as células para análise da expressão do marcador da linhagem mielóide por citometria de fluxo. Sem perturbar a camada MS-5, pipete suavemente o meio e transfira as células para um tubo de 5 mL. Nota: Para a análise de coloração e citometria de fluxo, as células de 1-2 poços são suficientes. A diferenciação também pode ser monitorada nos dias 1, 7 e 14. Se executar imunofenotipagem em dias múltiplos, os números dos poços necessários para a análise devem ser calculados conformemente.</li>
	<li>Mancha 5 x 105 células com anticorpos para CD34 (APC-Cy7), CD66B (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (percp-Cy 5.5), e CD235A (APC) em um volume total de 50 ΜL. Incubar no gelo no escuro por 20 min. inclua MNCs manchados e únicos manchado como controles para ajustar portas positivas e negativas para cada fluoróforo, e 7-AAD como uma mancha viva/inoperante para eliminar pilhas inoperantes da análise.</li>
	<li>Lave e fixe (opcional) as células manchadas como descrito acima (etapas 4.3-4.6).</li>
	<li>Re-suspender as células em 500 μL de tampão de citometria de fluxo e analisar por um citometro de fluxo.</li>
</ol>6. avaliação da morfologia celular
<ol><li>Limpe as lâminas do microscópio pulverizando o etanol e limpando até Squeaky.</li>
	<li>Mergulhe os slides limpos em solução de poli-L-lisina por 5 min em RT e seque por 1 h em RT.</li>
	<li>Ressuscitem os HSPCs da etapa 3,14 e células diferenciadas do passo 5,13 em 10 μL de tampão de citometria de fluxo.</li>
	<li>Transfira a suspensão da célula para as lâminas revestidas e deixe-as secar ao ar. Nota: Os slides do dia 1 e do dia 21 podem ser armazenados em RT e manchados simultaneamente.</li>
	<li>Despeje 0,5 mL da mancha Wright-Giemsa no slide e deixe ficar por 3 min em RT.</li>
	<li>Adicione o volume igual de água deionizada e deixe-se levantar para 10 minutos adicionais em RT.</li>
	<li>Lave a lâmina em água desionizada.</li>
	<li>Visualize células manchadas em uma ampliação de 60x ou 100x por um microscópio.</li>
</ol>

<ol><li>Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+comparison+of+CD34+%2B+CD38-+cells+in+cord+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow.</a> Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li>
<li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91 (5), 661-672 (1997).</li>
<li>Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell%3A+self-renewal+versus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).</li>
<li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-Induced+Emergency+Megakaryopoiesis+Driven+by+Hematopoietic+Stem+Cell-like+Megakaryocyte+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).</li>
<li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li>
<li>Bender, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+and+characterization+of+CD34%2B+cells+from+normal+human+bone+marrow%2C+cord+blood%2C+peripheral+blood%2C+and+mobilized+peripheral+blood+from+patients+undergoing+autologous+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation.</a> Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).</li>
<li>Fritsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+CD34+subpopulations+differs+between+bone+marrow%2C+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood.</a> Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).</li>
<li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+population+of+CD34%2B+cells+in+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).</li>
<li>Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+hematopoietic+stem+cells+of+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood.</a> Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).</li>
<li>Bapat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Disease+Mutations+of+Splicing+Factor+SRSF2+Cause+G2-M+Arrest+and+Skewed+Differentiation+of+Human+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells.</a> Stem Cells. 36, 1-13 (2018).</li>
<li>Yip, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U2AF1S34F+mutation+induces+lineage-specific+splicing+alterations+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).</li>
<li>Yoo, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+differentiation+of+human+cord+blood+CD34%2B+cells+during+ex+vivo+expansion+using+thrombopoietin%2C+flt3-ligand+and%2For+granulocyte-colony+stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor.</a> British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).</li>
<li>Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+identification+of+single+CD34%2BCD38-+cells+with+both+lymphoid+and+myeloid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential.</a> Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).</li>
<li>Moretta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+human+innate+lymphoid+cells+is+influenced+by+the+source+of+hematopoietic+stem+cells+and+by+the+use+of+G-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF.</a> European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).</li>
<li>Sanz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+human+CD34%2BCD10-CD19%2B+pre%2Fpro-B-cell+and+CD19-+common+lymphoid+progenitor+stages+in+two+pro-B-cell+development+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).</li>
<li>Egeland, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+differentiation+of+purified+CD34%2B+cells+after+stimulation+with+recombinant+human+granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+%28CSF%29%2C+granulocyte-CSF%2C+and+interleukin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3.</a> Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).</li>
<li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).</li>
<li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34%2B+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420(2017).</li>
<li>Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral-mediated+knockdown+during+ex+vivo+erythropoiesis+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2813(2011).</li>
<li>Davies, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+ASXL1+impairs+the+granulomonocytic+lineage+potential+of+human+CD34%28%2B%29+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells.</a> British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).</li>
<li>Caceres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP53+suppression+promotes+erythropoiesis+in+del%285q%29+MDS%2C+suggesting+a+targeted+therapeutic+strategy+in+lenalidomide-resistant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASXL1+plays+an+important+role+in+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ASXL1 plays an important role in erythropoiesis.</a> Scientific Reports. 6, 28789(2016).</li>
<li>Mazumdar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-Associated+Cohesin+Mutants+Dominantly+Enforce+Stem+Cell+Programs+and+Impair+Human+Hematopoietic+Progenitor+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enforced+expression+of+an+Flt3+internal+tandem+duplication+in+human+CD34%2B+cells+confers+properties+of+self-renewal+and+enhanced+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis.</a> Blood. 105 (1), 77-84 (2005).</li>
<li>Ambrosini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+inhibits+ILC3+while+favoring+NK-cell+maturation+of+umbilical+cord+blood+CD34%28%2B%29+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors.</a> European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).</li>
<li>Batard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%28beta%291+maintains+hematopoietic+immaturity+by+a+reversible+negative+control+of+cell+cycle+and+induces+CD34+antigen+up-modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation.</a> Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).</li>
<li>Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+potent+small+molecule+capable+of+regulating+polyploidization%2C+megakaryocyte+maturation%2C+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production.</a> Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136(2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo descrito aqui é apropriado para a diferenciação ex vivo de UCB derivado CD34+ hspcs às quatro linhagens Myeloid. A incubação inicial com uma mistura de citocina consistindo de SCF, TPO, Flt3L e IL3 estimula as células CD34+ . Subseqüentemente, a diferenciação é conseguida com um cocktail de SCF, de IL3, de Flt3L, de EPO, e de TPO. Nesta mistura, o SCF, o IL3, e o Flt3L são importantes para a sobrevivência e a proliferação de CD34+ hscs. ePO e TPO promovem a diferenciação para ...

A diferenciação normal de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) é fundamental para a manutenção de níveis fisiológicos de todas as linhagens de células sanguíneas. Durante a diferenciação, em uma resposta coordenada às pistas extracelulares, incluindo fatores de crescimento e citocinas, as hscs primeiro dão origem a células de progenitoras multipotentes (MPP) que têm potencial lympho-mielóide1,2,3 ,4 (Figura 1). Os MPPs dão origem a progenitores mielóides comuns (CMPs) e progenitores linfoides comuns (CLPs) que são restritos à linhagem. Os CLPs diferenciam nas linhagens lymphoid compostas de B, T, e de pilhas naturais do assassino. Os CMPS geram as linhagens Myeloid através de duas populações mais restritas do progenitor, dos progenitores Erythroid do megacariócito (deputados), e dos progenitores do monocyte do granulocyte (GMPs). Os eurodeputados dão origem a megacariócitos e eritrócitos, enquanto os GMPs dão origem a granulócitos e monócitos. Além do que levanta-se com CMPS, os megacariócitos foram relatados para levantar-se também diretamente de hscs ou de Mpps adiantados através das vias não-canônicas5,6.
As células tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são caracterizadas pelo marcador de superfície CD34 e pela falta de marcadores específicos de linhagem (Lin-). Outros marcadores de superfície comumente empregados para distinguir HSCs e populações de progenitoras mielóides incluem CD38, CD45RA e CD1232 (Figura 1). HSCs e MPPs são Lin-/Cd34+/CD38- e Lin-/CD34+/CD38+, respectivamente. As populações de progenitoras comprometidas mielóides distinguem-se pela presença ou ausência de CD45RA e CD123. As CMPS são Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo, os GMPs são Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, e os eurodeputados são Lin-/CD34+ /Cd38+/Cd45ra-/CD123-.
A população total de células CD34+ Stem e progenitoras pode ser obtida a partir do sangue do cordão umbilical humano (UCB), da medula óssea e do sangue periférico. As células CD34+ constituem 0, 2% a 1,46% das células mononucleares totais (MNCs) em UCB humano, enquanto a sua percentagem varia entre 0,5% e 5,3% na medula óssea e é muito mais baixa em ~ 0, 1% no sangue periférico7,8,9 . A capacidade proliferativa e o potencial de diferenciação das células CD34+ derivadas de UCB é significativamente maior do que a da medula óssea ou das células sanguíneas periféricas1,10, oferecendo assim uma vantagem distinta para obter material suficiente para análises moleculares em combinação com a realização de caracterização imunofenootípica e morfológica das células durante a diferenciação.
A diferenciação ex vivo do sangue do cordão umbilical CD34+ hspcs é um modelo amplamente aplicado para a investigação de hematopoiese normal e mecanismos de doença hematopoética. Quando cultivadas com as citocinas apropriadas, a UCB CD34+ hspcs pode ser induzida para diferenciar ao longo das linhagens mielóide ou linfoide11,12,13,14,15 , 16. aqui, nós descrevemos protocolos para a isolação e a caracterização immunophenotypic do CD34+ HSPCS do UCB humano, e para sua diferenciação às pilhas myeloid da linhagem. Este sistema da cultura é baseado na diferenciação cytokine-induzida dos HSPCs na presença de pilhas stromal MS-5 para imitar o microambiente na medula. As condições da cultura causam uma expansão inicial das pilhas de CD34+ , seguidas por sua diferenciação às pilhas que expressam marcadores para as quatro pilhas myeloid da linhagem, a saber os granululocytes (CD66b), os monócitos (CD14), os megacariócitos (CD41), e eritrócitos (CD235a). As aplicações do protocolo de diferenciação celular CD34+ incluem estudos sobre mecanismos moleculares que regulam a hematopoiese, e investigações sobre o impacto de mutações associadas à doença mielóide e pequenas moléculas na autorenovação e diferenciação de HSPCs.

<table><tbody><tr><td>Solução de 0,4% de azul de tripano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td>Dilua o material de trabalho para 0,2% em ácido tetra acético estéril 1x PBS</td></tr><tr><td>0.5 M UltraPure Ethylene diamine, pH 8.0</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>10x Hanks Solução salina balanceada (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14185052</td><td>Diluir para 1x com água destilada estéril e pH para 7,2</td></tr><tr><td>2,5% de tripsina, sem vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15090046</td><td>Diluir o estoque de trabalho para 1x com estéril 1x PBS</td></tr><tr><td>30 &micro; m Filtros de pré-separação</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>35% de albumina de soro bovino estéril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td></td><td>Biolegend 420404</td><td>Usado como um corante vivo/morto para eliminar células mortas da análise FACS</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD10-FITC humano (Clone HI10a)</td><td>Biolegend</td><td>312207</td><td>Use diluição</td></tr> <tr><td>1:20Anticorpo anti-CD11b-FITC humano (ativado) (Clone CBRM1/5)</td><td>Biolegend</td><td>301403</td><td>Uso diluição 1:5</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD123-APC humano (Clone 6H6)</td><td>Biolegend</td><td>306012</td><td>Uso diluição 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD14-PE humano (Clone M5E2)</td><td>Biolegend</td><td>301806</td><td>Uso diluição 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD19-FITC humano (Clone 4G7)</td><td>BD Biosciences</td><td>347543</td><td>Uso diluição 1:5</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD235a-APC humano (Clone GA-R2 (HIR2)))BD</td> <td>Biosciences</td><td>551336</td><td>Uso diluição 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD235a-FITC humano (Clone HIR2)</td><td>Biolegend</td><td>306609</td><td>Uso diluição 1:50</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD34-APC-Cy7 humano (Clone 581)</td><td>Biolegend</td><td>343514</td><td>Uso diluição 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD38-PE humano (Clone HIT2)</td><td>Biolegend</td><td>303506</td><td>Use diluição 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD3-FITC humano (Clone UCHT1)</td><td>Biolegend</td><td>300405</td><td>Uso diluição 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-humano CD41a-PerCP-Cy5.5 (Clone HIP8)</td><td>Biolegend</td><td>303720</td><td>Uso diluição 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-humano CD45Ra-PE-Cy7 (Clone HI100)</td><td>Biolegend</td><td>304126</td><td>Uso diluição 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-humano CD66b-PE-Cy7 (Clone G10F5)</td><td>Biolegend</td><td>305116</td><td>Uso Diluição 1:20</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD7-FITC humano (Clone CD7-6B7)</td><td>Biolegend</td><td>343103</td><td>Uso diluição 1:20</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Esterilize o filtro antes do uso</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) em pó com L-Glutamina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12100046</td><td>Reconstitua 1 pacote para fazer 1 L de meio DMEM com bicarbonato de sódio, 10% de FBS e 1% de penicilina e estreptomicina.</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, fonte australiana, inativado por calor</td><td>Lote FB-22</td> da <td>Omega Scientific</td> #609716 <td></td></tr><tr><td>Kit de microesferas CD34 humanas&nbsp;</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-046-702</td><td></td></tr><tr><td>Trombopoetina Humana (TPO), grau de pesquisa</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-094-011</td><td>Faça um estoque de 100 &micro; g/mL em 1x PBS + 0,1% BSA. Use 50 ng/mL para diferenciação mielóide e meio de estimulação</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Omega Scientific</td><td>GS-60</td><td>Concentração de 2 mM no meio de estimulação</td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multi stand</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separador magnético MidiMACS</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Meio de fracionamento MNC (Ficol-Paque PLUS)</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr>Células <td></td><td></td><td>MS-5</td><td>Presente do laboratório de Gay Crooks, UCLA</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Aqueça 800 mL de 1x PBS em um copo de vidro em uma placa de agitação em uma capa química a ~ 65 &deg; C. Adicione 10 g de pó de paraformaldeído. Para dissolver completamente o paraformaldeído, aumente o pH adicionando 1 N NaOH. Arrefecer e filtrar a solução e completar o volume até 1 l com 1x PBS. Ajuste o pH para 7,2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina & Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Faça um estoque de 10 mg/mL em 1x</td></tr><tr><td>PBS Eritropoietina humana recombinante alfa (rHu EPO-&alfa;)</td><td>BioBasic</td><td>RC213-15</td><td>Faça um estoque de 2.000 unidades/mL em 1x PBS + 0,1% BSA. Use 4 unidades/mL para diferenciação mieloide Fragmento</td></tr><tr><td>de fibronectina humana recombinante (RetroNectina)</td> <td>Takara&nbsp;</td><td>T100B</td><td>Use 20 &micro; g/mL diluído em 1x PBS estéril para revestir poços antes da estimulação de CD34+ HSCs.</td></tr><tr><td>Ligante humano recombinante Flt-3 (rHu Flt-3L)</td><td>BioBasic</td><td>RC214-16</td><td>Faça um estoque de 100 &micro; g/mL em 1x PBS + 0,1% BSA. Use 5 ng/mL para diferenciação mielóide e 50 ng/mL em meio de estimulação</td></tr><tr><td>Interleucina-3 humana recombinante (rHu IL-3)</td><td>BioBasic</td><td>RC212-14</td><td>Faça um estoque de 100 &micro; g/mL em 1x PBS + 0,1% BSA. Use 5 ng/mL para diferenciação mielóide e 20 ng/mL em meio de estimulação</td></tr><tr><td>Fator de células-tronco humanas recombinantes (rHu SCF)</td><td>BioBasic</td><td>RC213-12</td><td>Faça um estoque de 100 &micro; g/mL em 1x PBS + 0,1% BSA. Use 5 ng/mL para diferenciação mielóide e 50 ng/mL em meio de estimulação</td></tr><tr><td>Meio livre de soro (X-Vivo-15)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Wright-Giemsa mancha, modificado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WG16-500</td><td>Use de acordo com as instruções do fabricante</td></tr><tr><td><forte>Equipamento&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall Legend RT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação pan-myeloid do sangue humano do cabo derivado cd34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

A diferenciação ex vivo de células-tronco hematopoiéticas humanas é um modelo amplamente utilizado para estudar a hematopoiese. O protocolo descrito aqui é para a diferenciação induzida citocinas de pilhas da haste e do progenitor de CD34+ hematopoietic às quatro pilhas myeloid da linhagem. As pilhas de CD34+ são isoladas do sangue humano do cabo de cordão umbilical e co-cultivadas com as pilhas STROMAL MS-5 na presença de cytokines. A caracterização de immunophenotypic das pilhas da haste e do progenitor, e as pilhas Myeloid diferenciadas da linhagem são descritas. Usando este protocolo, as pilhas de CD34+ podem ser incubadas com moléculas pequenas ou transadas com lentivirus para expressar mutações myeloid da doença para investigar seu impacto na diferenciação Myeloid.

A aplicação dos protocolos acima rende 5,6 (± 0,5) x 108 MNCs e 1 (± 0,3) x 106 células CD34+ de uma unidade de sangue do cabo de ~ 100 ml. A percentagem de células CD34+ totais varia entre 80-90% (Figura 2A, B). A análise imunofenotípica pelo esquema descrito por Manz et al.5 demonstra que as células CD34+ tipicamente consistem em ~ 20% hscs e ~ 72% Mpps que são Lin-/Cd34+/C...

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .

Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Este protocolo pode ser usado para estudar as alterações moleculares e celulares que ocorrem durante a diferenciação mielóide normal das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras humanas. A principal vantagem deste protocolo é que ele permite a diferenciação de células positivas CD34 ao longo de todas as quatro linhagens mieloides, incluindo megacaiócitos, eritrócitos, granuócitos e monócitos. Demonstrando o procedimento será Aditi Bapat, uma pós-doutora do meu laboratório.Para o isolamento celular mononuclear de uma amostra de sangue do cordão umbilical humano, esterilize a superfície externa de um saco de sangue do cordão umbilical com 70% de etanol antes de transferir o conteúdo do saco para uma garrafa plástica estéril de 250 mililitros dentro de um armário de segurança biológica. Diluir o sangue com um volume igual de temperatura ambiente A solução salina tamponada de Hank, e adicionar 15 mililitros de fracionamento de células mononucleares médio para cada um dos cinco tubos cônicos estéreis de 50 mililitros. Após uma mistura suave, despeje cuidadosamente 30 mililitros do sangue diluído do cordão umbilical no meio de fracionamento mononuclear em cada tubo, segurando os tubos de 50 mililitros em um ângulo para ajudar a evitar a mistura das camadas.Separe as células por centrifugação gradiente de densidade, e remova os 15 a 20 mililitros superiores à camada de célula mononuclear. Use uma pipeta para transferir cuidadosamente a camada de célula mononuclear exposta em um novo tubo de 50 mililitros, unindo as células mononucleares de dois a três tubos juntos, e traga o volume final em cada tubo até 50 mililitros com tampão PBE frio. Pellte as amostras de células mononucleares por centrifugação, e aspire os supernantes.Bata em cada tubo suavemente para soltar as pelotas celulares e dilua as pelotas em cinco mililitros de tampão PBE gelado. Combine as células de três a quatro tubos em um tubo cônico de 50 mililitros, e lave todos os tubos com cinco mililitros de tampão PBE fresco para coletar quaisquer células restantes. Após a contagem, leve o volume final no tubo até 50 mililitros com tampão PBE frio fresco e colete as células por centrifugação.Para isolar as células mononucleares positivas CD34, suspenda a pelota em 50 mililitros de tampão PBE fresco antes de coletar as células com outra centrifugação. Depois de descartar o supernascer, bata suavemente para soltar a pelota, e suspenda as células em uma única vez 10 para as oito células mononucleares por 300 microliters de concentração de tampão PBE gelada. Bloqueie qualquer ligação inespecífica com 100 microlitres de reagente de bloqueio do receptor Fc, misture suavemente e, em seguida, adicione 100 micro-ebuligem de microesferas CD34 de um kit de microesferas humanos ativados magnéticos por uma vez 10 às oito células com mistura suave, e incubar as células por 30 minutos a quatro graus Celsius.Enquanto as células estão incubando, coloque uma coluna LS e filtro de pré-separação em um campo magnético separador MACS. Equilibre a coluna com dois mililitros de tampão PBE gelado e o filtro de pré-separação com um mililitro de buffer. Deixe a coluna esvaziar em um tubo cônico de 15 mililitros e descarte o fluxo através.Ao final da incubação, traga o volume final da amostra de célula mononuclear até 15 mililitros com tampão PBE frio fresco e sedimentar as células por centrifugação. Suspenda a pelota em um mililitro de tampão PBE frio e carregue as células no filtro de pré-separação na coluna. Enxágüe o tubo com três mililitros de tampão PBE frio fresco e adicione o tampão ao filtro de pré-separação.Lave a coluna quatro vezes com mais três mililitros de tampão PBE gelado por lavagem sem o filtro, permitindo que a coluna escorra completamente entre cada lavagem. Após a lavagem final, mova a coluna para um novo tubo de 15 mililitros, e mergulhe cinco mililitros de PBE frio fresco através da coluna para o tubo. Para determinar as frações de populações de caules e progenitores nas células hematopoiéticas e progenitoras recém-isoladas cd34, coletar as células por centrifugação e suspender a pelota em uma única vez 10 para as seis células por 50 microliters de concentração de tampão de citometria de fluxo.Em seguida, transfira as células em 50 alíquotas de microliter por cinco mililitros fluorescência ativada tubo de triagem celular de acordo com o protocolo experimental de coloração de citometria de fluxo. Adicione o coquetel de anticorpos apropriado e coloração viva/morta às células, ajustando o volume para 100 microliters totais. Após 20 minutos no escuro protegido da luz, lave as células com um mililitro de tampão de citometria de fluxo fresco por tubo, e suspenda as células em 500 microliters de tampão de citometria de fluxo fresco por tubo.Em seguida, analise as células em um citômetro de fluxo de acordo com protocolos citométricos de fluxo padrão. Para diferenciar as células de tronco e progenitoras cd34 positivas em células de linhagem mieloide, primeiro cubra os poços de uma placa estéril e sem revestimento de 48 poços com 200 microlitadores por poço de solução de fibronectina humana recombinante em PBS por duas horas à temperatura ambiente. Ao final da incubação, descarte a solução de fibronectina de cada poço e bloqueie os poços com 200 microliters de 2% de albumina de soro bovino.Após 30 minutos em temperatura ambiente, lave os poços duas vezes com 500 microliters de PBS estéril por lavagem. Suspenda as células positivas CD34 recém-isoladas a cinco vezes 10 as cinco células por mililitro de concentração média de estimulação quente. Em seguida, semente 200 microliters de células em cada poço da placa revestida de fragmento de fibronectina e coloque a placa na incubadora de cultura celular por 48 horas.No final da incubação, colete as células com tubulação suave, e lave os poços com 500 microliters do meio águia modificado de Dulbecco aquecido, unindo as lavagens com a suspensão da célula. Após a contagem, suspenda as células em 2,5 vezes 10 para as quatro células por um mililitro de concentração média de diferenciação mielóide. Camada 200 microliters de células positivas CD34 por poço em uma célula estromal MS-5 semeada 48 placa de cultura tecidual bem.Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular, substituindo suavemente 100 microliters do supernante em cada poço com 100 microliters de meio de diferenciação mielóide 2X fresco a cada três ou quatro dias. No dia 21, colhe as células para análise da expressão do marcador de linhagem mieloide por citometria de fluxo como apenas demonstrado. A porcentagem típica de células positivas cd34 isoladas do sangue do cordão umbilical por separação de microesferas como demonstrado varia entre 80 a 90% A análise imunofenofípica revela que essas células positivas CD34 geralmente consistem em uma linhagem negativa de aproximadamente 20% cd34 positiva cd38 população de células-tronco hematopoiéticas negativas e uma linhagem negativa CD34 positivo CD38 população de células progenitoras positivas.Dentro da população multipotente de células progenitoras, cerca de 25% das células expressam marcadores progenitores mieloides comuns, cerca de 15% expressam marcadores progenitores de monogenitor de granlócitos expressos, e cerca de 56% expressam marcadores progenitores de megacariódias. A imunofenofoteping também demonstra que o percentual de células positivas de CD34 reduz de cerca de 90% de isolamento para menos de 25% no dia 21. A análise da população negativa do CD34 demonstra um aumento concomitante no percentual de células expressando marcadores de linhagem mieloide madura.Além disso, as células manchadas de Wright-Giemsa demonstram características morfológicas distintas nos dias um e 21 com as culturas indiferenciadas exibindo grandes núcleos redondos e muito pouco citoplasma e as culturas diferenciadas que exibem características morfológicas de células de linhagem, incluindo monócitos, granulócitos e eritrobistas. Lembre-se de despejar o sangue diluído do cordão umbilical no meio de fracionamento da célula mononuclear sem misturar as camadas, e não perturbe as células positivas MS-5 e CD34 ao alterar o meio. Seguindo esse protocolo de diferenciação, as culturas celulares positivas cd34 podem ser analisadas para alterações morfológicas, efeitos apoptóticos, mudanças nos padrões de ciclo celular e o grau de diferenciação.

pan-myeloid-differentiation-human-cord-blood-derived-cd34

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Este vídeo demonstra uma técnica para a diferenciação de megacariócitos e a formação de plaquetas. As células-tronco progenitoras hematopoiéticas - isoladas do sangue do cordão umbilical humano - diferenciam-se em megacariócitos maduros na presença de trombopoietina. Os megacariócitos maduros produzem extensões citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dão origem a plaquetas individuais.

Um método in vitro para a diferenciação de megacariócitos e formação de plaquetas

Aqui descrevemos um protocolo para o isolamento de subconjuntos de precursor células B do sangue do cordão umbilical. A quantidade e qualidade suficientes de ácidos nucleicos podem ser extraídos a partir das células e usadas em ensaios subsequentes utilizando DNA ou RNA.

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Aqui, apresentamos pluripotentes humanas de protocolos de cultura de células-tronco (hPSC), usados para diferenciar hPSCs em CD34+ progenitores hematopoiéticos. Este método usa a manipulação de estágio específico de WNT canônico sinalização para especificar células exclusivamente para ambos o programa hematopoiética definitivo ou primitivo.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

Uma população altamente pura de megacariócitos pode ser Obtida de cordão hemoderivados CD34+ células. Um método para CD34+ diferenciação de isolamento e megacariócito célula está descrita aqui.

Megacariócito diferenciação e formação de plaquetas de humanos cabo hemoderivados CD34 células+

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Aqui, descrevemos o ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do CD34+ células derivadas do sangue do cordão umbilical, tratados com uma combinação de um cocktail de citocinas e VPA. Esse método leva a um grau significativo de ex vivo expansão dos linfócitos primitivos para qualquer clínica ou aplicações de laboratório.

Ex Vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do cordão humano hemoderivados CD34+ células usando o ácido valproico

Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

A modelagem da eritropoiese oferece uma chance valiosa de compreender o significado biológico dos atores nesse processo e avaliar novas abordagens terapêuticas que podem aliviar os defeitos de diferenciação. Aqui, descrevemos um método simples e confiável para diferenciar eficientemente células-tronco hematopoiéticas CD34+ e células progenitoras ex vivo.

Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo

Aprenda a diferenciação pan-mieloide de células CD34+ do sangue de cordão umbilical humano. Este método permite estudar as quatro linhagens mieloides e investigar mutações em doenças hematopoieticas.

Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34⁺ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor

Explorar mais vídeos