Induzir e caracterizar a esteatose vesicular em células HepaRG diferenciadas

Este protocolo descreve como induzir esteatose vesicular hepática em células e métodos hepaRG diferenciados para detecção e quantificação do acúmulo lipídico. Este modelo de célula humana in vitro representa uma alternativa valiosa para modelos in vivo ratos e para hepatócitos humanos primários. Descongele um lote criopreservado de baixa passagem de células HepaRG, imergindo-as em um banho Celsius de 37 graus até descongelar.

Transfira rapidamente as células para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio proliferante. Após centrifugação por cinco minutos, descarte o supernasce e resuspenque as células em cinco mililitros de meio proliferador. Conte as células e dilua para a placa 250.000 células por centímetro quadrado.

Coloque as células em pratos de cultura celular de 100 milímetros e renove o meio a cada dois ou três dias. As células proliferam com um tempo de duplicação de cerca de 24 horas. Uma vez que as células HepaRG atinjam 80% de confluência, desvincule-as através de uma incubação de três a cinco minutos com solução de trippsina de 0,05%.

Colete as células em meio proliferador e centrífuga por cinco minutos como antes. Descarte o supernasce e resuspenque as células com cinco mililitros de meio proliferador. Novamente, conte as células e dilua para a placa 250.000 células por centímetro quadrado.

Nesta fase, amplifique as células repetindo esses passos para alcançar um número adequado de células para iniciar experimentos. Para criopreservar células HepaRG, desprendem as células 24 horas após a incubação de três a cinco minutos com solução de trippsina de 0,05%. Colete as células em meio proliferador e centrífuga por cinco minutos como antes.

Descarte o supernatante, resuspenque as células em um mililitro por lote de meio de congelamento, e criopreserve os lotes em nitrogênio líquido. No dia zero, as células HepaRG de sementes a 250.000 células por centímetro quadrado em pratos tratados com cultura com um volume adequado de meio de proliferação. Dois pratos precisam ser banhados para cada ensaio, um para células de controle e um para células tratadas com oleato.

No segundo dia e no quarto dia, mude o meio com um volume adequado de meio de proliferação e deixe as células crescerem até atingirem a confluência. No sétimo dia, as células devem ser 100% confluentes. Lave as células uma vez com 1X PBS.

Em seguida, remova o PBS 1X e adicione um volume apropriado de meio de diferenciação. Nos dias oito, nove, 12, 15 e 18, lave as células uma vez com 1X PBS antes de adicionar um volume adequado de meio de diferenciação. No dia 21, observe as células HepaRG sob um microscópio e garanta que as células sejam culturas diferenciadas confluentes.

Como controle, colher um prato de controle para realizar a análise de expressão genética de genes marcadores de diferenciação. No dia 21, células HepaRG diferenciadas podem ser criopreservadas em nitrogênio líquido. No dia 21, diluir o oleato de sódio com um volume apropriado de meio de diferenciação completa para uma concentração final de 250 micromolar.

Adicione 99% de metanol a uma proporção de um a 400 em outra alíquota de meio de diferenciação para fazer o tratamento de controle do veículo. Lave as células uma vez com 1X PBS e adicione veículo ou meio de oleato de sódio. Nos dias 23 e dia 25, troque o meio com o volume adequado do meio recém-preparado.

No dia 26, observe as células por microscopia óptica. Gotículas lipídicas se acumulam nas células tratadas com oleato de sódio e são facilmente visíveis como gotículas translúcidas no citoplasma. Para realizar a coloração de Oleo Vermelho, primeiro lave as células uma vez com 1X PBS e remova completamente o PBS 1X.

Adicione 4% de paraformaldeído e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Remova o paraformaldeído e lave as células duas vezes com 1X PBS. Depois de remover o PBS, incubar as células com isopropanol de 60% por cinco minutos em temperatura ambiente.

Remova a isopropanol e deixe as células secarem completamente à temperatura ambiente. Agora adicione a solução de trabalho Oil Red O às células e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. O volume de solução de trabalho necessário para cada amostra corresponde ao volume de mídia utilizado para a cultura das células.

Remova a solução Oil Red O e adicione imediatamente água duplamente destilada. Depois de lavar as células quatro vezes com água duplamente destilada, adquira imagens sob o microscópio para análise. Para elutar o corante Óleo Vermelho O, remova toda a água e deixe secar.

Em seguida, adicione um mililitro de isopropanol de 100% e incubar por 10 minutos com agitação suave à temperatura ambiente. Pipeta o isopropanol com óleo elucido Corante Vermelho O para cima e para baixo várias vezes, garantindo que todo o Óleo Vermelho O está na solução. Transfira a solução para um cuvette.

Meça a densidade óptica em 500 nanômetros por espectrofotometria e use 100% isopropanol como o branco. Lave as células uma vez com 1X PBS. Em seguida, incubar com 100 nanomolar de Bodipy diluído em 1X PBS no escuro por 40 minutos a 37 graus Celsius.

Um controle não manchado deve ser incluído nas medidas de citometria de fluxo. Remova a solução de coloração e lave as células uma vez com 1X PBS. Em seguida, lave as células novamente e remova completamente o PBS.

Adicione 4% de paraformaldeído e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Remova o paraformaldeído e lave as amostras três vezes durante cinco minutos em PBS. As células podem ser mantidas em 1X PBS a quatro graus Celsius ou imagens imediatamente.

Para armazenamento, enrole com Parafilm e cubra com papel alumínio para evitar que as células sequem. Para verificar a indução eficiente da esteatose, as células hepaRG tratadas com oleato foram manchadas com corante O Vermelho-Óleo. Após a coloração, gotículas lipídicas são facilmente visíveis como gotículas vermelhas.

A coloração pode ser quantificada pela medição espectrofotométrica do corante óleo R O eludido com isopropanol. A absorção de Óleo Vermelho O das células é diretamente proporcional ao acúmulo de gotícula lipídica citoplasmática. A concentração de oleato de sódio e o tempo de exposição foram determinados pelo ensaio de viabilidade celular colorimétrica MTT.

O produto Formosan é quantificado por sua absorção em 490 nanômetros e é diretamente proporcional ao número de células vivas na cultura. O tratamento de oleato de sódio foi comparado ao tratamento de palmitato de sódio. A droga apoptóica doxorubicina foi usada como controle.

Para quantificar o aumento do teor lipídico celular após o tratamento de oleato de sódio, a coloração com corante Bodipy foi usada para rotular gotículas lipídicas. Usando a análise citofluormétrica, é possível quantificar o teor de triglicerídeos pela intensidade fluorescente média de Bodipy, que é maior em células tratadas com oleato em comparação com as células de controle. Isso indica um acúmulo eficiente de gordura após o tratamento de oleate.

De fato, imagens de células manchadas de Bodipy mostram gotículas lipídicas fluorescentes verdes brilhantes em células tratadas com oleato que não são visíveis nas células de controle. Para caracterizar ainda mais o acúmulo de gotículas lipídicas após o tratamento de oleato de sódio, a microscopia CARS pode ser realizada conforme descrito no protocolo de texto que permite quantificação de gotículas lipídicas sem rotulagem. Esse modelo baseado em células pode aumentar o conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na doença hepática gordurosa não oncótica e pode levar ao desenvolvimento de novos marcadores para o diagnóstico precoce e novas estratégias de tratamento.