Método ex vivo para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo do mouse e um algoritmo de rastreamento de movimento do útero baseado em MATLAB para análise de dados

Nosso protocolo é significativo porque fornece o primeiro método ex vivo quantitativo para avaliar a motilidade espontânea de um útero intacto. Esta nova abordagem fornece uma alternativa fácil e menos cara para testar o potencial relaxante de remédios que ocorrem naturalmente em compostos sintéticos. Uma grande vantagem dessa técnica é que todas as interações celulares intrauterinas permanecem intactas durante todo o experimento.

A sobresemilidade do útero está associada à dismenorreia, para a qual relaxantes uterinos podem ser úteis para o tratamento. Este método fornece uma maneira fácil de testar novos relaxantes. Após a confirmação do estágio de ciclo estrous, coloque o rato na posição supina e espalhe as extremidades para expor a região pélvica abdominal.

Molhe o abdômen com 70% de etanol, e use fórceps para levantar cuidadosamente a pele superior ao clitóris. Faça pequenas incisões transversais nos aspectos laterais da área abdominal inferior até as extremidades superiores para expor o peritônio. Corte cuidadosamente o peritônio para expor o trato gastrointestinal sem danificar os chifres uterinos, e use fórceps para remover o tecido de fáscia e adiposa que cobre o trato gastrointestinal.

Remova o duodeno, jejunum, íleo, ceco, e o cólon ascendente e transversal. Localize a bexiga urinária para localizar a vagina que é encontrada diretamente sob a bexiga urinária. Localize a sífise púbica na confluência dos ossos pubianos, caudal à bexiga, e use uma tesoura para fazer cuidadosamente uma incisão nas laterais laterais da sífise púbica através do tecido fibrocartilagino interpúbico para ter acesso e fornecer uma rota para a extração vaginal.

Corte através do períneo localizado entre o ânus e a parte inferior da vulva, e use fórceps para levantar a vagina para permitir uma excisão lenta do reto. Identifique os dois chifres uterinos que bifurcam em um garfo rostrally para a vagina e localize um ovídeo e ovário complicados no final de cada chifre. Identificar corretamente os chifres uterinos é fundamental para o procedimento para garantir que os tecidos não sejam danificados.

Use uma pequena tesoura dissecando para remover quaisquer ligamentos que se conectem e apoiem os chifres, ovidutos e ovários dentro da cavidade abdominal, e remova a vagina, útero, oviductos e ovários. Transfira todo o trato reprodutivo isolado para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 mililitros da PBS de Dulbecco. Use fórceps e tesouras cirúrgicas para remover qualquer tecido conjuntivo e adiposo ao redor dos chifres uterinos e vagina, bem como qualquer pele na região púbica que possa dificultar a qualidade da imagem.

Remova o ligamento largo para permitir a motilidade dos chifres uterinos e lave o tecido duas vezes com pbs de Dulbecco fresco por lavagem antes de transferir o trato reprodutivo isolado para uma placa petri de 35 milímetros contendo três mililitros de solução krebs oxigenada. Para imagens espontâneas de motilidade, coloque a placa de Petri em uma superfície preta à temperatura ambiente, e deixe de 15 a 30 minutos para contrações espontâneas começarem. Quando o movimento pode ser observado, regisse a motilidade uterina espontânea por 10 minutos a partir de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.

Em seguida, transfira a preparação para uma placa de Petri contendo tampão Krebs oxigenado complementado com o composto de teste e regise a motilidade uterina espontânea por mais 10 minutos da mesma maneira. No final do período de gravação, lave todo o trato reprodutivo em 10 mililitros da PBS de Dulbecco em uma placa de Petri de 100 milímetros, e transfira a amostra para uma nova placa de Petri de tampão Krebs recém-oxigenado para avaliar a reversibilidade do tratamento. Regisso da motilidade uterina espontânea por cerca de 10 minutos da mesma forma, como nas duas últimas gravações.

Em seguida, transfira a preparação para outra placa de Petri de 35 milímetros cheia de tampão krebs oxigenado complementado com o veículo para o composto de teste para garantir que não haja alterações mecanicamente induzidas na motilidade uterina espontânea. A preparação do trato reprodutivo apresentou alta motilidade nos painéis A e C na ausência de epinefrina. Mas este fenótipo está adormecido no painel B com a presença de uma micro epinefrina muller.

Aqui, mostra-se uma análise amostral da administração da epinefrina e da recuperação espontânea da motilidade, ilustrando como os efeitos do hormônio na motilidade espontânea do trato reprodutivo podem ser quantificados a partir das gravações do tecido tomadas antes, durante e após o tratamento composto do teste. É importante evitar comprimir ou esticar demais os chifres uterinos, caso contrário, nenhuma contralução espontânea será observada. Nosso método também pode ser usado para testar compostos que podem aumentar a contratilidade do útero.

Este procedimento pode ser aplicado ao camundongo grávida uteri nos estágios iniciais da gravidez. Este experimento tem o potencial de ser atualizado para um formato de placa de seis poços para triagem de medicamentos de throughput.