Método ex vivo para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo do mouse e um algoritmo de rastreamento de movimento do útero baseado em MATLAB para análise de dados
1 de setembro de 2019
As contrações uterinas são importantes para o bem-estar das fêmeas. No entanto, a contratilidade patologicamente aumentada pode resultar em dismenorreia, especialmente em fêmeas mais jovens. Aqui, nós descrevemos uma preparação ex vivo simples permitindo a avaliação rápida da eficácia de afrouxamento do músculo liso que podem ser usados tratando o dysmenorrhea.
Nosso protocolo é significativo porque fornece o primeiro método ex vivo quantitativo para avaliar a motilidade espontânea de um útero intacto. Esta nova abordagem fornece uma alternativa fácil e menos cara para testar o potencial relaxante de remédios que ocorrem naturalmente em compostos sintéticos. Uma grande vantagem dessa técnica é que todas as interações celulares intrauterinas permanecem intactas durante todo o experimento.
A sobresemilidade do útero está associada à dismenorreia, para a qual relaxantes uterinos podem ser úteis para o tratamento. Este método fornece uma maneira fácil de testar novos relaxantes. Após a confirmação do estágio de ciclo estrous, coloque o rato na posição supina e espalhe as extremidades para expor a região pélvica abdominal.
Molhe o abdômen com 70% de etanol, e use fórceps para levantar cuidadosamente a pele superior ao clitóris. Faça pequenas incisões transversais nos aspectos laterais da área abdominal inferior até as extremidades superiores para expor o peritônio. Corte cuidadosamente o peritônio para expor o trato gastrointestinal sem danificar os chifres uterinos, e use fórceps para remover o tecido de fáscia e adiposa que cobre o trato gastrointestinal.
Remova o duodeno, jejunum, íleo, ceco, e o cólon ascendente e transversal. Localize a bexiga urinária para localizar a vagina que é encontrada diretamente sob a bexiga urinária. Localize a sífise púbica na confluência dos ossos pubianos, caudal à bexiga, e use uma tesoura para fazer cuidadosamente uma incisão nas laterais laterais da sífise púbica através do tecido fibrocartilagino interpúbico para ter acesso e fornecer uma rota para a extração vaginal.
Corte através do períneo localizado entre o ânus e a parte inferior da vulva, e use fórceps para levantar a vagina para permitir uma excisão lenta do reto. Identifique os dois chifres uterinos que bifurcam em um garfo rostrally para a vagina e localize um ovídeo e ovário complicados no final de cada chifre. Identificar corretamente os chifres uterinos é fundamental para o procedimento para garantir que os tecidos não sejam danificados.
Use uma pequena tesoura dissecando para remover quaisquer ligamentos que se conectem e apoiem os chifres, ovidutos e ovários dentro da cavidade abdominal, e remova a vagina, útero, oviductos e ovários. Transfira todo o trato reprodutivo isolado para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 mililitros da PBS de Dulbecco. Use fórceps e tesouras cirúrgicas para remover qualquer tecido conjuntivo e adiposo ao redor dos chifres uterinos e vagina, bem como qualquer pele na região púbica que possa dificultar a qualidade da imagem.
Remova o ligamento largo para permitir a motilidade dos chifres uterinos e lave o tecido duas vezes com pbs de Dulbecco fresco por lavagem antes de transferir o trato reprodutivo isolado para uma placa petri de 35 milímetros contendo três mililitros de solução krebs oxigenada. Para imagens espontâneas de motilidade, coloque a placa de Petri em uma superfície preta à temperatura ambiente, e deixe de 15 a 30 minutos para contrações espontâneas começarem. Quando o movimento pode ser observado, regisse a motilidade uterina espontânea por 10 minutos a partir de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.
Em seguida, transfira a preparação para uma placa de Petri contendo tampão Krebs oxigenado complementado com o composto de teste e regise a motilidade uterina espontânea por mais 10 minutos da mesma maneira. No final do período de gravação, lave todo o trato reprodutivo em 10 mililitros da PBS de Dulbecco em uma placa de Petri de 100 milímetros, e transfira a amostra para uma nova placa de Petri de tampão Krebs recém-oxigenado para avaliar a reversibilidade do tratamento. Regisso da motilidade uterina espontânea por cerca de 10 minutos da mesma forma, como nas duas últimas gravações.
Em seguida, transfira a preparação para outra placa de Petri de 35 milímetros cheia de tampão krebs oxigenado complementado com o veículo para o composto de teste para garantir que não haja alterações mecanicamente induzidas na motilidade uterina espontânea. A preparação do trato reprodutivo apresentou alta motilidade nos painéis A e C na ausência de epinefrina. Mas este fenótipo está adormecido no painel B com a presença de uma micro epinefrina muller.
Aqui, mostra-se uma análise amostral da administração da epinefrina e da recuperação espontânea da motilidade, ilustrando como os efeitos do hormônio na motilidade espontânea do trato reprodutivo podem ser quantificados a partir das gravações do tecido tomadas antes, durante e após o tratamento composto do teste. É importante evitar comprimir ou esticar demais os chifres uterinos, caso contrário, nenhuma contralução espontânea será observada. Nosso método também pode ser usado para testar compostos que podem aumentar a contratilidade do útero.
Este procedimento pode ser aplicado ao camundongo grávida uteri nos estágios iniciais da gravidez. Este experimento tem o potencial de ser atualizado para um formato de placa de seis poços para triagem de medicamentos de throughput.
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Visão Geral
Este estudo aborda a importância das contrações uterinas, particularmente em relação à dismenorreia em mulheres jovens. Apresenta um novo método ex vivo para avaliar a motilidade uterina e a eficácia de relaxantes musculares lisos, o que pode oferecer opções terapêuticas para a dismenorreia.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Contratilidade uterina
- Tratamento da dismenorreia
- Técnicas de avaliação ex vivo
Antecedentes
- O aumento da contratilidade uterina está associado à dismenorreia.
- Os métodos existentes para avaliar a motilidade uterina são limitados em sua eficácia.
- Este estudo tem como objetivo aprimorar as técnicas de avaliação para testes de relaxantes mais eficientes.
Métodos Utilizados
- Avaliação quantitativa ex vivo da motilidade uterina.
- Sistema de modelo murino com interações uterinas intactas.
- Uso de equipamento de vídeo digital para gravação da motilidade.
Resultados Principais
- Estabelecimento de um método reprodutível para avaliação da motilidade uterina.
- Quantificação da motilidade espontânea em resposta a relaxantes.
- Potencial para testar compostos relaxantes e potencializadores da contratilidade.
Conclusões
- Este estudo apresenta um método prático para avaliar a motilidade uterina e a eficácia relaxante.
- Os achados têm implicações para pesquisas futuras sobre tratamentos da dismenorreia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método ex vivo permite a avaliação quantitativa da motilidade uterina espontânea em um trato reprodutivo de camundongo intacto, fornecendo um modelo fisiologicamente relevante para avaliar relaxantes uterinos e moduladores da contratilidade. Ao preservar as interações celulares intra-uterinas intrínsecas, a abordagem possibilita a desaceleração mecanicista de compostos direcionados à dismenorreia e a outros distúrbios da motilidade uterina. O método oferece uma plataforma escalável e reprodutível para validação precoce de alvos e identificação de compostos promissores na descoberta de fármacos para a saúde da mulher.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas sobre a função do músculo liso uterino por meio da quantificação de alterações na motilidade espontânea.
- Valor Operacional: Oferece um sistema ex vivo reprodutível para reduzir riscos em alvos terapêuticos, preservando a arquitetura tecidual nativa e a comunicação celular.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao fornecer dados quantitativos e dependentes da dose sobre os efeitos do composto na contratilidade uterina.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera leituras padronizadas de motilidade por meio de rastreamento de movimento baseado em MATLAB, permitindo triagem consistente de compostos.
- Escalabilidade: Compatível com captura digital de vídeo e adaptável a formatos de maior produtividade, como placas de seis poços.
- Robustez do Ensaio: Mede a inibição reversível da motilidade, conforme demonstrado com epinefrina, apoiando a validação do ensaio e a confirmação de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela a atividade ondulatória humana do endométrio, oferecendo insights translacionais para a fisiopatologia da dismenorreia.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta a descoberta à avaliação pré-clínica, mantendo as interações intactas do trato reprodutivo durante toda a experimentação.
- Progressão com Ajuste de Risco: Orienta decisões de avançar/não avançar ao quantificar a modulação da contratilidade e a reversibilidade dos efeitos do composto.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese sobre o alvo até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, especialmente para compostos moduladores da motilidade uterina.
- Biologia da Descoberta: Facilita a investigação mecanicista das vias de contratilidade uterina e o engajamento de alvos em um contexto de tecido intacto.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas baseadas em movimento que permitem comparação confiável dos efeitos de compostos sobre a motilidade espontânea.
- Análises: Utiliza algoritmos de rastreamento de movimento para gerar saídas mensuráveis e reprodutíveis para análise de resposta à dose e análise cinética.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade com modelos pré-clínicos ao preservar interações fisiológicas do tecido uterino relevantes para a dismenorreia humana.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de ensaio de motilidade reutilizável, aplicável a diferentes classes de compostos e áreas terapêuticas envolvendo a função do músculo liso.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas respostas do músculo liso uterino.
- Valor Operacional: Fornece um ensaio ex vivo padronizado e de baixo custo com requisitos mínimos de equipamentos (câmera digital, algoritmo MATLAB).
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir a eliminação precoce de candidatos a relaxantes uterinos antes de estudos in vivo que consomem muitos recursos.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização orientada por dados de compostos com base em perfis quantificados de inibição da motilidade e reversibilidade.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em dissecação do trato reprodutivo de camundongo e manipulação de tecidos para manter a viabilidade.
- Depende da manutenção do tampão de Krebs oxigenado e de um ambiente de imagem com temperatura controlada para garantir motilidade consistente.
- Necessita padronização dos parâmetros de gravação de vídeo (ângulo, duração, iluminação) para análise confiável de rastreamento de movimento.
- Exige adaptação do algoritmo baseado em MATLAB para diferentes padrões de motilidade do corno uterino entre cepas ou condições.
- Limitado pela ausência de motilidade espontânea em 10-20% das amostras, exigindo triagem prévia para identificar tecidos responsivos.
