Name: Método ex vivo para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo do mouse e um algoritmo de rastreamento de movimento do útero baseado em MATLAB para análise de dados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda um método ex vivo para avaliar a motilidade uterina espontânea em camundongos intactos usando gravação digital e análise por vídeo. Esta técnica permite testar relaxantes musculares para tratamento de dismenorreia.

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Este trabalho foi apoiado por fundos de IU internos. A AGO concebeu o estudo. XC e AGO estiveram envolvidos no projeto dos experimentos descritos.  FL e AGO analisaram e interpretaram os dados. KLL, JOB, FL realizou todos os experimentos ex vivo . FL escreveu o script MATLAB. KLL, Jó e AGO escreveram o manuscrito.  Todos os autores leram e aprovaram a versão final do manuscrito.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina da Universidade de Indiana (Indianapolis, IN). 2-5 mês-velho F2-129S-C57BL/6 ratos fêmeas sexualmente maduros foram utilizados no estudo.
Atenção: Assegure a segurança desgastando um revestimento, uma máscara, e umas luvas do laboratório ao trabalhar com animais e materiais bioperigosos.
1. preparação da solução
<ol><li>Prepare o tampão Krebs, que contém: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mm NaH2po4, 0,56 mM MgCl2, 25 mm NaHCO3e 5 mm glicose, pH 7,4. Oxigenar continuamente o tampão Krebs com uma mistura de gases compridos contendo 5% CO2 e 95% o2 , mantendo a temperatura tampão a 37 ° c usando um banho de água circulante.</li>
	<li>Prepare a solução salina tamponada por fosfato de Dulbecco (DPBS), que contém: 2,68 mm kcl, 1,47 mm KH2po4, 136,89 mm NaCl e 8,1 mm na2HPO4, pH 7,4.</li>
</ol>2. preparação animal
<ol><li>Anestesiando camundongos usando inalação de isoflurano (3%) com a eliminação de gases residuais. Assegure a anestesia adequada avaliando reflexos da retirada. Aperte o dedo traseiro para afirmar que não há movimentos são eliciados, indicando a perda de respostas reflexas. Após a anestesia profunda é alcançada, eutanizar o animal por decapitação. Nota: Isoflurano pode causar dilatação do músculo liso. Portanto, a preparação do trato reprodutivo deve ser extensivamente lavada e incubada no tampão Krebs por pelo menos 15-30 min antes de iniciar os experimentos ex vivo. O isoflurano pode causar irritação e desconforto quando está em contacto com a pele, por isso proceda com precaução.</li>
	<li>Coloc o corpo em um grande barco do pesar alinhado com uma toalha de papel. Nota: O pessoal de laboratório feminino grávida não deve estar envolvido em experimentos com isoflurano, pois pode diminuir o peso fetal, diminuir a ossificação esquelética fetal e aumentar o risco de aborto espontâneo8,9. A inalação de CO2 pode ser usada como um substituto para eutanizar camundongos.</li>
</ol>3. determinação da fase de ciclo estral
<ol><li>Com fórceps pequeno, levante o clitóris para ganhar o acesso ao óstio vaginal e insira lentamente uma ponta da micropipeta que contem 10 μL de dpbs no vagina.<ol>
<li>Assegure-se de que a ponta da micropipeta seja inserida através do óstio em um ângulo de 10-30 ° para evitar perfurar a parede vaginal. O líquido ainda deve ser visível na ponta após a inserção. Se o líquido não é visível, a ponta foi inserida demasiado distante no vagina, e a área paracervicais do vagina pôde ter sido perfurada.</li>
		<li>Puxe levemente para baixo nos músculos do óstio vaginal com a ponta da micropipeta para permitir que o ar saia da vagina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave lentamente a cavidade vaginal pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes com 10 μL de DPBS e coloque a suspensão de células desenhadas numa lâmina de vidro.</li>
	<li>Use um microscópio de contraste de fase invertida para determinar o estágio de ciclo estral através da análise citológica. O procedimento é feito conforme descrito em outros10,11. Assegure-se de que a suspensão celular não seque antes que a análise citológica possa ser realizada. A suspensão pode ser diluída com DPBS fresco, se necessário.</li>
</ol>4. Ddissecção do trato reprodutivo do rato
<ol><li>Arranje o rato em uma posição supina e espalhe suas extremidades para expor a região abdominopelvic.</li>
	<li>Spray com 70% de etanol para umedecer e desinfectar a área abdominopélvica.</li>
	<li>Usando fórceps, levante cuidadosamente a pele localizada superior ao clitóris. Fazer pequenas incisões transversais nos aspectos laterais da área abdominal inferior, até as extremidades superiores para expor o peritônio (Figura 1a). Durante este processo, uma aleta externa formarão. Porque as incisões pequenas são feitas continuamente, a aleta aumentará no tamanho.</li>
	<li>Corte cuidadosamente o peritônio para expor o trato gastrointestinal (Figura 1B). É importante notar que os chifres uterinos podem muitas vezes ser localizado diretamente o peritônio, para fazer incisões cautelosamente e não tocar os chifres, pois isso pode afetar a motilidade uterina.</li>
	<li>Usando fórceps, retire a fáscia e tecido adiposo cobrindo o trato gastrointestinal. Remover os seguintes segmentos do trato gastrointestinal da cavidade abdominal: o duodeno, jejuno, íleo, cálio, cólon ascendente e transverso (Figura 1C).</li>
	<li>Para localizar os órgãos reprodutivos, primeiro identifique a bexiga urinária (Figura 1C, "4"), que pode ter uma aparência deflacionada devido à micção após a eutanásia. A vagina estará bem embaixo da bexiga urinária.</li>
	<li>Localize a sínfise púbica na confluência dos ossos púbica (caudally à bexiga).</li>
	<li>Usando tesouras, retire a sínfise púbica, fazendo incisões cuidadosamente em seus lados laterais através do tecido fibrocartilaginoso interpúbica para obter acesso e fornecer uma rota para a extração da vagina (Figura 1D).</li>
	<li>Corte através do períneo localizado entre o ânus e a parte inferior da vulva.</li>
	<li>Usando fórceps, levante a vagina e retire lentamente o reto.</li>
	<li>Identifique dois chifres uterinos que se bifurcam em um garfo, rostralmente para a vagina. Localize um oviduto e um ovário complicado no fim de cada chifre, que pode ser escondido os segmentos restantes do aparelho gastrointestinal. Use tesouras de dissecação pequenas para remover todos os ligamentos que conectam e suportam os chifres, os oviducts, e os ovários dentro da cavidade abdominal.</li>
	<li>Retire o trato reprodutivo, que inclui a vagina, útero, ovidutos e ovários, a partir da cavidade abdominal.</li>
	<li>Transferir o trato reprodutivo isolado (Figura 1E) para um prato de Petri de 100 mm preenchido com 10 ml de dpbs. Não comprima os chifres uterinos para evitar danificar o miometrium.</li>
	<li>Use fórceps e tesoura cirúrgica para remover qualquer tecido conjuntivo e adiposo em torno dos chifres uterinos e vagina, bem como qualquer pele na região Púnica que poderia dificultar a qualidade da imagem. Retire o ligamento largo para permitir a motilidade dos chifres uterinos.</li>
	<li>Lave o trato reprodutivo isolado com o DPBS fresco duas vezes e transfira-o para um prato de Petri de 35 mm preenchido com 3 mL de solução de Krebs oxigenada.</li>
</ol>5. imagem latente do tecido
<ol><li>Coloque a placa de Petri contendo o trato reprodutivo no tampão de Krebs oxigenado em uma superfície preta. Mantenha o prato à temperatura ambiente. Nota: É possível usar uma almofada de aquecimento infravermelha para manter o tecido em 37 ° c.</li>
	<li>Aguarde 15-30 min para que as contrações espontâneas comecem. Grave a motilidade uterina espontânea por 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.</li>
	<li>Transfira a preparação para uma placa de Petri contendo o tampão de Krebs oxigenado suplementado com um composto de teste. Grave a motilidade uterina espontânea por cerca de 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.</li>
	<li>Lave todo o trato reprodutivo em 100 mm prato de Petri com 10 mL de DPBS para avaliar a reversibilidade do tratamento.</li>
	<li>Transfira a preparação para uma placa de Petri com o tampão Krebs recém-oxigenado. Grave a motilidade uterina espontânea por cerca de 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.</li>
	<li>Transfira a preparação para outro prato de Petri de 35 mm preenchido com tampão de Krebs oxigenado suplementado com o veículo para o composto de teste para garantir que não haja alterações induzidas mecanicamente na motilidade uterina espontânea. Este é um controle importante.</li>
	<li>Transfira a gravação de vídeo para um disco rígido do computador.</li>
</ol>6. análise de dados
<ol><li>Faça clipes usando qualquer software de edição de vídeo da filmagem original contendo o controle, tratamento e episódios de lavagem.</li>
	<li>Use o software MATLAB e o script fornecido (consulte o material complementar on-line) para quantificar a motilidade uterina espontânea. Nota: O complemento Computer Vision Toolbox para MATLAB deve ser instalado para que o script seja totalmente funcional.<ol>
<li>Abra o script MATLAB, vá para a guia Editor e clique em executar.</li>
		<li>Selecione o primeiro arquivo de vídeo e clique em abrir.</li>
		<li>Insira um rótulo para o arquivo de vídeo na caixa de diálogo pop-up e clique em OK.</li>
		<li>Insira o (s) intervalo (es) de tempo necessário para calcular a taxa de movimento do chifre (distância Δ euclidiana/ΔS).</li>
		<li>Use o cursor do mouse para selecionar dois pontos no primeiro quadro do vídeo. Uma janela pop-up pedirá para confirmar que os pontos selecionados devem ser usados para o rastreamento. Clique em Iniciar para iniciar o processo de rastreamento em tempo real que será exibido na janela pop-up. Como alternativa, clique em selecionar pontos para selecionar novamente os dois pontos.</li>
		<li>Monitore a precisão do processo de rastreamento na janela pop-up.</li>
		<li>Observe um gráfico de dispersão de taxa versus tempo e distância versus gráfico de dispersão de tempo em uma nova janela pop-up. Salve as duas figuras selecionando arquivo | Salvar como na mesma janela para documentar os dados.</li>
		<li>Localize uma pasta denominada Pointtrackerdata, criada automaticamente pelo MATLAB, no mesmo diretório onde o script MATLAB está localizado. Identifique um arquivo do Excel denominado label_Data contendo pontos de dados coletados do vídeo em duas guias de planilha separadas. Nota: qualquer software de rastreamento de movimento alternativo pode ser usado para quantificar a motilidade espontânea do útero.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um software apropriado (por exemplo, Excel ou SigmaPlot 13) para realizar a análise estatística.</li>
</ol>

<ol><li>Kuijsters, N. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+peristalsis+and+fertility%3A+current+knowledge+and+future+perspectives%3A+a+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis.</a> Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).</li>
<li>Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menstrual+characteristics+and+prevalence+of+dysmenorrhea+in+college+going+girls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Family+Medicine+and+Primary+Care%22%5BJournal%5D)">Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls.</a> Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).</li>
<li>Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+aerobic+exercise+on+primary+dysmenorrhea%3A+A+clinical+trial+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+education+and+health+promotion%22%5BJournal%5D)">The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study.</a> Journal of education and health promotion. 7, 3(2018).</li>
<li>Lindner, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+prostaglandins+in+the+regulation+of+cyclic+events+in+the+ovary+and+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+prostaglandin+and+thromboxane+research%22%5BJournal%5D)">Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus.</a> Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).</li>
<li>Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysmenorrhea+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+research%22%5BJournal%5D)">Dysmenorrhea and related disorders.</a> F1000 research. 6, 1645(2017).</li>
<li>Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs+for+dysmenorrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+database+of+systematic+reviews%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea.</a> The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751(2015).</li>
<li>Oladosu, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+skeletal+muscle+activity+precedes+spontaneous+menstrual+cramping+pain+in+primary+dysmenorrhea%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+obstetrics+and+gynecology%22%5BJournal%5D)">Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea.</a> American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91(2018).</li>
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<li>Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+development+in+mice+exposed+to+isoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Fetal development in mice exposed to isoflurane.</a> Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), 35538(2012).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).</li>
<li>Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tocolytic+effect+of+catecholamines+in+the+gravid+rat+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+analgesia%22%5BJournal%5D)">The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus.</a> Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylephrine%2C+a+common+cold+remedy+active+ingredient%2C+suppresses+uterine+contractions+through+cAMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling.</a> Scientific reports. 8 (1), 11666(2018).</li>
<li>Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomathematical+pattern+of+EMG+signal+propagation+in+smooth+muscle+of+the+non-pregnant+porcine+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus.</a> PLoS One. 12 (3), 0173452(2017).</li>
<li>Crane, L. H., Martin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pace-maker+activity+in+the+myometrium+of+the+oestrous+rat%3A+in+vivo+studies+using+video-laparoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+fertility%2C+and+development%22%5BJournal%5D)">Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy.</a> Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, descrevemos um método para avaliar a contratilidade espontânea de todo o trato reprodutivo de roedores, que inclui os ovários, ovidutos, chifres uterinos e a vagina. Utilizou-se um método semelhante para demonstrar o efeito relaxante da fenilefrina na motilidade uterina espontânea13, porém, no passado não pudemos fornecer análise quantitativa dos dados. Neste trabalho, desenvolvemos um algoritmo para análise quantitativa de dados de motilidade utilizando o módulo de rastreamento de movimento...

Como um órgão fêmea principal, o útero é crucial para a reprodução e essencial para a nutrição do feto1. O útero consiste em três camadas: o perimetrium, o miométrio e o endométrio. O miométrio é a camada contrátil principal do útero e joga um papel chave na entrega do feto. O endométrio é a camada mais interna que reveste a cavidade uterina e é essencial para a implantação do embrião. Em fêmeas não gestantes em idade reprodutiva, a camada endometrial é vertida mensalmente no início do ciclo menstrual. O miométrio auxilia neste processo de derramamento, mantendo as contrações miometrial espontâneas necessárias para limpar o tecido endometrial necrótico do útero1.
Infelizmente, aumento da contratilidade miometrial pode resultar em efeitos colaterais negativos, tais como dismenorreia, ou cãibras menstruais dolorosas. Isto é especialmente observado em fêmeas jovens e mulheres nulíparas2. No entanto, a dismenorreia é diferente para cada mulher e depende da força de suas contrações miometrial; as contrações mais fortes são frequentemente associadas com a sensação de cãibras severas3. A contratilidade miometrial pode ser visualizada usando ultrassonografia uterina e muitas vezes é reconhecida como ondas endometriais. A liberação aumentada das prostaglandinas durante a menstruação4 em um útero que submete-se a descamação endometrial é acreditada para contribuir ao hypercontractility myometrial aumentado, tendo por resultado a isquemia e o hipóxia do músculo uterine e aumentado assim dor3.
Dismenorreia severa pode dificultar a atividade do dia-a-dia de algumas mulheres e 3 a 33% das mulheres têm dor muito severa, o que poderia causar uma mulher a ser acamados por 1 a 3 dias cada ciclo menstrual5. A dismenorreia é a principal causa de morbidade ginecológica em mulheres em idade reprodutiva, independentemente da idade, nacionalidade e status econômico5. A prevalência estimada de dismenorreia é alta e variável, variando de 45% a 93% em mulheres em idade reprodutiva5.  A dor associada à dismenorreia tem efeito no cotidiano das mulheres e pode resultar em mau desempenho acadêmico em adolescentes, menor qualidade de sono, restrição de atividades diárias e alterações de humor5.
Muitas mulheres que experimentam dismenorreia grave recorrer a medicamentos over-the-counter para aliviar a sua dor. Tais medicamentos de balcão contêm inibidores da ciclooxigenase (COX) que impedem a formação de prostaglandinas6. No entanto, os inibidores da COX estão associados a eventos cardiovasculares adversos, e cerca de 18% das mulheres com dismenorreia não respondem a esses inibidores7. Portanto, há uma necessidade de novos medicamentos para reduzir as cólicas menstruais. Desde que sobre o contratilidade do útero contribui à patogénese do dysmenorrhea, uma estratégia possível pode ser o uso de relaxants uterine.
É benéfico quantificar os efeitos de drogas relaxantes potenciais em um modelo de ocorrência natural myometrial espontâneo-como contrações de onda. Entretanto, assim distante, nenhum método ex vivo eficiente para testar drogas músculo-relaxando no útero intacto foi descrito. Atualmente, medições de tensão isométrica são usadas para avaliar os efeitos de drogas relaxantes. Durante tais medidas, uma tira do músculo uterine é mantida em um comprimento constante a pré-carga em um banho do tecido quando a força de contrações do músculo uterine for gravada antes e depois da estimulação do ocitocina na presença ou na ausência de uma droga relaxante. Embora esta aproximação seja muito útil, exige o equipamento caro. Além disso, as contrações isométricas não se assemelham às contrações myometrial espontâneas da onda-como que ocorrem naturalmente no útero intacto. Excepcionalmente, as ondas myometrial uterine nos roedores podem ser visualizadas como a motilidade uterine do chifre quando o intervalo reprodutivo inteiro (ovários, oviducts, útero, e vagina) é mantido em uma solução do amortecedor. Aqui, nós apresentamos um método ex vivo para monitorar a motilidade espontânea do útero intacto do rato coloc em um prato de Petri que contem o amortecedor oxigenado de Krebs. Também descrevemos um algoritmo de quantificação da motilidade utilizando o rastreador de movimento MATLAB. Esta nova abordagem fornece uma alternativa fácil e menos dispendiosa para testar o potencial relaxante de remédios que ocorrem naturalmente e compostos sintéticos.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de epinefrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; E4642&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Sceintific de Dulbecco&nbsp;</td><td>17-512Q</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 PROOF</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-2374</td><td></td></tr><tr><td>Dissecando Pinça de Precisão Extra-Fina</td><td>Fisher Sceintific</td><td>13-812-42</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Íris Fina Endurecida Curvada</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissecção Estereomicroscópio Modular de Alto Desempenho</td><td>Leica</td><td>MZ6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Câmera de Microscópio Digital Colorida de 5 Megapixel com sistema de resfriamento ativo</td><td>Leica</td><td>&nbsp; DFC425 C</td><td></td></tr><tr><td>Stereomaster Microscópio Fibra Óptica Fontes de Luz</td><td>Fisher Sceintific&nbsp;</td><td>12-562-21</td><td></td></tr><tr><td>Pesa Barco</td><td>Fisher Sceintific&nbsp;</td><td></td><td></td>WB30304</tr><tr><td>Convertors Astound Bata Cirúrgica Padrão&nbsp;</td><td>Cardinal Health&nbsp;</td><td>9515</td><td>Luvas Pequenas, Médias ou Grandes</td></tr><tr><td></td><td>McKesson Corporation</td><td>20-1080</td><td>Pequeno, Médio ou Grande; luvas cirúrgicas de látex ou nitrilo estéreis sem pó</td></tr><tr><td>&nbsp; Placa de Petri</td><td>Corning Falcon</td><td>351029</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>&nbsp; Placa de Petri</td><td>Corning Falcon</td><td>353001</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>95% O2- 5% CO2 mistura gasosa</td><td>Praxair</td><td>&nbsp; MM OXCD5-K</td><td></td></tr><tr><td>Máscaras de laço de orelha</td><td>Valumax International</td><td>5430E-PP</td><td></td></tr><tr><td>DSLR 24,2 MP Câmera</td><td>Canon</td><td>EOS Rebel T6i</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>versão 2019 ou posterior</td></tr></tbody></table>

método ex vivo para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo do mouse e um algoritmo de rastreamento de movimento do útero baseado em matlab para análise de dados

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

A dismenorreia, ou cãibras dolorosas, é o sintoma mais comum associado à menstruação em fêmeas e sua gravidade pode dificultar a vida cotidiana das mulheres. Aqui, apresentamos um método fácil e barato que seria instrumental para testar novas drogas diminuindo a contratilidade uterina. Este método utiliza a habilidade original do intervalo reprodutivo do rato inteiro para expor a motilidade espontânea quando mantido ex vivo em um prato de Petri que contem o amortecedor oxigenado de Krebs. Esta motilidade espontânea assemelha-se à atividade myometrial onda-como do útero humano, referido como ondas endometrial. Para demonstrar a eficácia do método, empregamos um bem conhecido medicamento relaxante uterino, epinefrina. Nós demonstramos que a motilidade espontânea do intervalo reprodutivo do rato inteiro pode ser rapidamente e reversivelmente inibida pela epinefrina de 1 μM neste modelo do prato de Petri. Documentar as mudanças da motilidade uterina pode ser facilmente feito usando um telefone inteligente comum ou uma câmera digital sofisticada. Nós desenvolvemos um algoritmo MATLAB-baseado permitindo o seguimento do movimento para quantificar mudanças uterine espontâneas da motilidade medindo a taxa de movimentos uterine do chifre. Uma grande vantagem dessa abordagem ex vivo é que o trato reprodutivo permanece intacto durante todo o experimento, preservando todas as interações celulares intrauterinas intrínsecas. A principal limitação dessa abordagem é que até 10-20% dos úteros podem não apresentar motilidade espontânea. Até o momento, este é o primeiro método quantitativo ex vivo para avaliar a motilidade uterina espontânea em um modelo de prato de Petri.

A Figura 1 mostra imagens representativas tiradas durante todo o procedimento de isolamento do trato reprodutivo descrito neste protocolo. Para evitar contaminar o tampão com pêlo, o que diminuiria a qualidade do vídeo, umedecido o corpo do mouse com 70% de etanol. A principal referência para a seção de dissecção do protocolo é encontrar a bexiga urinária. O útero ea vagina será localizado inferior à bexiga urinária.
Para testar o protocolo, tratamos todo o trato ...

As contrações uterinas são importantes para o bem-estar das fêmeas. No entanto, a contratilidade patologicamente aumentada pode resultar em dismenorreia, especialmente em fêmeas mais jovens. Aqui, nós descrevemos uma preparação ex vivo simples permitindo a avaliação rápida da eficácia de afrouxamento do músculo liso que podem ser usados tratando o dysmenorrhea.

Método ex vivo para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo do mouse e um algoritmo de rastreamento de movimento do útero baseado em MATLAB para análise de dados

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...

Nosso protocolo é significativo porque fornece o primeiro método ex vivo quantitativo para avaliar a motilidade espontânea de um útero intacto. Esta nova abordagem fornece uma alternativa fácil e menos cara para testar o potencial relaxante de remédios que ocorrem naturalmente em compostos sintéticos. Uma grande vantagem dessa técnica é que todas as interações celulares intrauterinas permanecem intactas durante todo o experimento.A sobresemilidade do útero está associada à dismenorreia, para a qual relaxantes uterinos podem ser úteis para o tratamento. Este método fornece uma maneira fácil de testar novos relaxantes. Após a confirmação do estágio de ciclo estrous, coloque o rato na posição supina e espalhe as extremidades para expor a região pélvica abdominal.Molhe o abdômen com 70% de etanol, e use fórceps para levantar cuidadosamente a pele superior ao clitóris. Faça pequenas incisões transversais nos aspectos laterais da área abdominal inferior até as extremidades superiores para expor o peritônio. Corte cuidadosamente o peritônio para expor o trato gastrointestinal sem danificar os chifres uterinos, e use fórceps para remover o tecido de fáscia e adiposa que cobre o trato gastrointestinal.Remova o duodeno, jejunum, íleo, ceco, e o cólon ascendente e transversal. Localize a bexiga urinária para localizar a vagina que é encontrada diretamente sob a bexiga urinária. Localize a sífise púbica na confluência dos ossos pubianos, caudal à bexiga, e use uma tesoura para fazer cuidadosamente uma incisão nas laterais laterais da sífise púbica através do tecido fibrocartilagino interpúbico para ter acesso e fornecer uma rota para a extração vaginal.Corte através do períneo localizado entre o ânus e a parte inferior da vulva, e use fórceps para levantar a vagina para permitir uma excisão lenta do reto. Identifique os dois chifres uterinos que bifurcam em um garfo rostrally para a vagina e localize um ovídeo e ovário complicados no final de cada chifre. Identificar corretamente os chifres uterinos é fundamental para o procedimento para garantir que os tecidos não sejam danificados.Use uma pequena tesoura dissecando para remover quaisquer ligamentos que se conectem e apoiem os chifres, ovidutos e ovários dentro da cavidade abdominal, e remova a vagina, útero, oviductos e ovários. Transfira todo o trato reprodutivo isolado para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 mililitros da PBS de Dulbecco. Use fórceps e tesouras cirúrgicas para remover qualquer tecido conjuntivo e adiposo ao redor dos chifres uterinos e vagina, bem como qualquer pele na região púbica que possa dificultar a qualidade da imagem.Remova o ligamento largo para permitir a motilidade dos chifres uterinos e lave o tecido duas vezes com pbs de Dulbecco fresco por lavagem antes de transferir o trato reprodutivo isolado para uma placa petri de 35 milímetros contendo três mililitros de solução krebs oxigenada. Para imagens espontâneas de motilidade, coloque a placa de Petri em uma superfície preta à temperatura ambiente, e deixe de 15 a 30 minutos para contrações espontâneas começarem. Quando o movimento pode ser observado, regisse a motilidade uterina espontânea por 10 minutos a partir de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.Em seguida, transfira a preparação para uma placa de Petri contendo tampão Krebs oxigenado complementado com o composto de teste e regise a motilidade uterina espontânea por mais 10 minutos da mesma maneira. No final do período de gravação, lave todo o trato reprodutivo em 10 mililitros da PBS de Dulbecco em uma placa de Petri de 100 milímetros, e transfira a amostra para uma nova placa de Petri de tampão Krebs recém-oxigenado para avaliar a reversibilidade do tratamento. Regisso da motilidade uterina espontânea por cerca de 10 minutos da mesma forma, como nas duas últimas gravações.Em seguida, transfira a preparação para outra placa de Petri de 35 milímetros cheia de tampão krebs oxigenado complementado com o veículo para o composto de teste para garantir que não haja alterações mecanicamente induzidas na motilidade uterina espontânea. A preparação do trato reprodutivo apresentou alta motilidade nos painéis A e C na ausência de epinefrina. Mas este fenótipo está adormecido no painel B com a presença de uma micro epinefrina muller.Aqui, mostra-se uma análise amostral da administração da epinefrina e da recuperação espontânea da motilidade, ilustrando como os efeitos do hormônio na motilidade espontânea do trato reprodutivo podem ser quantificados a partir das gravações do tecido tomadas antes, durante e após o tratamento composto do teste. É importante evitar comprimir ou esticar demais os chifres uterinos, caso contrário, nenhuma contralução espontânea será observada. Nosso método também pode ser usado para testar compostos que podem aumentar a contratilidade do útero.Este procedimento pode ser aplicado ao camundongo grávida uteri nos estágios iniciais da gravidez. Este experimento tem o potencial de ser atualizado para um formato de placa de seis poços para triagem de medicamentos de throughput.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Método ex vivo para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo do mouse e um algoritmo de rastreamento de movimento do útero baseado em MATLAB para análise de dados (Vídeo) | JoVE Journal

Método ex vivo para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo do mouse e um algoritmo de rastreamento de movimento do útero baseado em MATLAB para análise de dados

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