Name: Gene direto knock-out de células-tronco neurais da medula espinhal Axolotl via eletroporação de complexos de proteína-gRNA CAS9 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a realizar knock-out gênico direto em células-tronco neurais da medula espinhal de axolote via eletroporação de complexos CAS9-gRNA. Este método permite estudar mecanismos moleculares da regeneração medular sem efeitos confundidores do desenvolvimento.

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Agradecemos ao Prof. Elly M. Tanaka pelo seu apoio contínuo e a longo prazo. Este trabalho foi apoiado por uma Fundação Nacional de ciência natural da China (NSFC) Grant (317716), pesquisa de início de subvenções da Universidade do Sul da China normal (S82111 e 8S0109), e uma China pós-doutorado ciência Fundação Grant (2018M633067).

Todos os experimentos com animais devem ser realizados de acordo com as regulamentações locais e nacionais sobre experimentação animal e com a aprovação do quadro de revisão institucional pertinente.
1. preparando a mistura de CAS9-gRNA RNP
<ol><li>Projetar e sintetizar gRNAs. Nota: refira outras publicações para projetar e sintetizar grnas, incluindo um exclusivamente a respeito dos axolotls15,20,21,22.</li>
	<li>Obtenha proteína CAS9-NLS preparando-se em casa ou comprando-a comercialmente.</li>
	<li>Prepare a mistura de CAS9-gRNA misturando 5 μg de proteína de CAS9-NLS, 4 μg de gRNA, 0,9 μL de tampão de 10x CAS9, e encha acima o volume a 10 μL com H2o. alíquota-livre de nuclease a mistura e armazene em-80 ° c se não for usado imediatamente.</li>
</ol>2. preparando placas do agarose para o electroporation
<ol><li>Prepare 200 mL de solução de agarose a 2% (WT/vol) em 1x DPBS. Dissolva-se aquecendo a solução num microondas e despeje-a em 10 cm de placas de Petri até uma profundidade de cerca de 10 mm (suficientemente profunda para cobrir todo o animal).</li>
	<li>Permita que as placas se solidificem à temperatura ambiente. Guarde as placas a 4 ° c se não forem utilizadas imediatamente.</li>
	<li>Usando Bisturis cirúrgicos, corte a placa de agarose para fazer uma fenda para segurar a cauda reta, um poço para caber no corpo do animal, e dois poços extra para colocar os eletrodos (Figura 1e).</li>
	<li>Coloque a placa no gelo e encha-a até a borda com gelo-frio 1x DPBS. Use a mesma solução de DPBS para fazer as placas para assegurar a condutibilidade elétrica consistente na instalação.</li>
</ol>3. Configurando o electroporator
<ol><li>Configure o electroporator. Configurar o pulso poring para consistir de um pulso bipolar de 70 V, com uma duração de 5 ms, intervalo de 50 ms, e nenhuma deterioração da tensão. Configurar o pulso de transferência para ter quatro pulsos bipolares de 40 V, com uma duração de 50 ms, intervalo de 999 MS, e 10% de deterioração da tensão.</li>
	<li>Conecte os eletrodos ao electroporator e ajuste a pinça para 7 mm de distância. Submergir os eletrodos em uma taça de DPBS antes e entre Electroporation.</li>
</ol>4. preparando e carregando capilares de vidro da microinjecção
<ol><li>Realize um teste de rampa em um extrator de micropipeta flamejante/marrom de acordo com as instruções do fabricante para determinar o valor do calor.</li>
	<li>Puxe capilares de injeção com extremidades cônicas usando os seguintes parâmetros: calor = valor do teste de rampa, puxar = 100, velocidade = 100, tempo = 100.</li>
	<li>Observe a agulha um estereomicroscópio. Usando o fórceps fino, quebre o capilar em um ângulo de modo que tenha uma ponta inclinada. Quebre em uma posição onde é fino bastante para alvejar o canal central, ao ser forte bastante furar a pele. Nota: o ponto em que o diâmetro é de cerca de 20 μm ou cerca de 50% do diâmetro da medula espinhal é um bom ponto de partida. Várias tentativas podem ser necessárias para obter uma quebra ideal.</li>
	<li>Adicione a solução Fast Green FCF à mistura RNP numa proporção de 1:30 e carregue cerca de 5 μL de mistura de injecção no capilar com uma ponteira de pipeta Microloader.</li>
	<li>Monte o capilar na bomba pneumática, com a ponta inclinada voltada para baixo.</li>
</ol>5. Configurando a bomba pneumática
<ol><li>Configurar a bomba pneumática. Ajuste a preensão a 0,5 libras por a polegada quadrada (libra por polegada quadrada), ejetar à preensão de 2 libras por polegada quadrada, e a duração ao gated.</li>
	<li>Teste os ajustes capilares e pneumáticos da bomba mergulhando o capilar em uma gota da água e pressionando o pedal do pé para injetar. Certifique-se de que a mistura de injeção sai em um fluxo lento, mas constante.</li>
	<li>Ajuste a pressão de preensão se o começo da mistura da injeção que escapa para fora espontâneamente ou a água sugam acima o capilar. Aumente a pressão de ejeção ou quebre mais do capilar se a mistura da injeção está saindo demasiado lenta. Diminua a pressão de ejeção se a injecção estiver a sair demasiado depressa.</li>
</ol>6. injetar RNP misturar na medula espinhal
<ol><li>Anestesiar axolotls em 0, 3% de solução de benzocaína por pelo menos 10 min. Verifique se os animais não são responsivos lançando-os de cabeça para baixo na água.</li>
	<li>Pegar um animal com fórceps anel e colocá-lo em uma cama de silício, com o lado esquerdo do animal virado para cima ea cauda apontando para a direita. Posicione o local de injeção no meio do campo de visão do estereomicroscópio (Figura 1a).</li>
	<li>Ajuste o micromanipulador para que o capilar esteja chegando a 60 ° do lado direito do campo de visão (Figura 1B).</li>
	<li>Identifique a medula espinhal e o canal central (Figura 1C). Nota: a medula espinhal é a estrutura tubular acima do Notochord.</li>
	<li>Visando o canal central, mova o capilar para a frente para perfurar suavemente a pele e o músculo no canal central da medula espinhal. Limitar o movimento do capilar para pequenos passos, como a medula espinhal está bem abaixo dos músculos da cauda.</li>
	<li>Pressione e segure o pedal do pé para injetar a mistura no canal central. Observe se a mistura RNP se espalha ao longo do canal central como uma linha azul em ambas as direções, o que mostra que o capilar foi posicionado corretamente (Figura 1D).</li>
	<li>Se isso não ocorrer, mantenha o pedal pressionado enquanto move o capilar levemente para dentro e para fora até que a mistura RNP comece a entrar. Se o capilar ficar entupido por tecido, limpe-o ejectando-o em água a pressões mais elevadas.</li>
	<li>Ajuste a pressão de ejeção de modo que seja apenas bastante para fazer com que a mistura de RNP espalhe no canal central, mas não tanto que funde acima a estrutura.</li>
	<li>Continue a segurar o pedal do pé assim que a mistura da injeção se espalha mais ao longo do canal central, até que alcangue o vesícula terminal na extremidade da medula espinal e dos ventrículos no cérebro. Nota: isto pode demorar até 2 min, dependendo do tamanho do animal. Pode ser necessário aumentar a pressão após algum tempo para causar a mistura de RNP para entrar nos ventrículos cerebrais.</li>
	<li>Proceder o mais rapidamente possível ao Electroporation após a injeção bem sucedida.</li>
</ol>7. electroporação
<ol><li>Transfira o animal com o fórceps do anel na placa preparada do Electroporation do agarose (Figura 1E) no gelo. Coloque a cauda dentro da fenda por isso é colada por agarose (Figura 1F).</li>
	<li>Coloque os eletrodos nos poços de ambos os lados da cauda. Assegure-se de que o animal e os eléctrodos inteiros estejam cobertos por PBS gelado.</li>
	<li>Pressione o interruptor do pé para começar o electroporation.</li>
	<li>Depois que o electroporation é completo, retorne o animal à água.</li>
	<li>Proceder para injetar mais animais, se necessário.</li>
	<li>Verifique se os animais electroporados são saudáveis após a anestesia desaparece e que não há nenhum dano causado à cauda.</li>
</ol>8. avaliando a eficiência de knock-out
<ol><li>Fixar a cauda do animal em. Faça secções transversais da cauda seguidas de coloração imuno-histoquímica para avaliar a eficiência do knock-out no nível da proteína. Nota: se uma amputação da cauda deve ser executada após o electroporation, a cauda cortada poderia ser usada para esta finalidade. Animais eletroporados com gRNAs contra GFP ou tirosinase, por exemplo, podem ser usados como um controle negativo4.</li>
	<li>Alternativamente, a medula espinal em podia ser extraída e lysed para o ADN. Realize a PCR genotipagem seguida de sequenciamento de Sanger ou sequenciamento de próxima geração para avaliar a porcentagem de loci genético editado15. Nota: a eficiência de edição resultante irá subestimar a eficiência de edição real para as NSCs, devido à inclusão de células não eletroporadas e neurônios que não têm contato apical com o lúmen central e, portanto, não receberão a mistura de RNP.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

O protocolo descrito permite que o tempo e o espaço restringidos o gene knock-out nos NSCs na medula espinal do Axolotl. O protocolo atual permite direcionamento específico de NSCs em um tempo definido e local com alta penetrância. Evita potenciais efeitos indesejáveis originários de nocaute genético em NSCs em outras regiões, como o cérebro que ocorrem ao usar o sistema CRE-LoxP. Também evita efeitos de desenvolvimento originados de um knock-out persistente, permitindo o estudo da função gênica focada na regeneração. Al...

A medula espinal da maioria de vertebrados é incapaz de regenerar depois da lesão, conduzindo à inabilidade permanente. Várias salamandras, como o Axolotl, são exceções notáveis. O Axolotl pode regenerar inteiramente uma medula espinal estruturalmente idêntica e restaurar completamente a função da medula espinal. Grande parte da capacidade regenerativa da medula espinhal Axolotl é devida a células ependímicas. Estas células alinham o canal central, e ao contrário daquelas em mamíferos, as pilhas ependymal de Axolotl permanecem como pilhas de haste neural (NSCs) desenvolvimento borne-Embryonic. Após ferimento da medula espinal (por exemplo, de uma amputação da cauda), estes NSCS proliferar para Regrow o tubo ependymal e para diferenciar-se para substituir os neurônios perdidos1,2,3. Descobrindo como Axolotl medula espinhal NSCs permanecem pluripotentes e tornam-se ativados após a lesão pode fornecer informações valiosas sobre o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para pacientes humanos.
Devido aos avanços na técnica de knock-out do gene crispr-Cas9, a realização de knock-outs para decifrar a função gênica tornou-se mais fácil e demonstrou ter ampla aplicabilidade em várias espécies, incluindo axolotls4,5, 6 anos de , 7 anos de , 8. a liberação recente do genoma completo do Axolotl e do transcriptoma agora permite que qualquer Locus genómico seja direcionado e para melhor avaliar os efeitos fora do alvo9,10,11,12 , 13 anos de , 14. protocolos otimizados foram desenvolvidos para knock-out e knock-in em axolotls usando o sistema Crispr-Cas915. A entrega da maquinaria de crispr-CAS9 a forma do ribonucleoprotein de proteína-grna de CAS9 (RNP) foi mostrada para ser mais eficiente do que usando plasmídeos da codificação de CAS9 e de grna-4. Isto é provável devido ao RNP que é menor no tamanho do que vetores do plasmídeo, sua habilidade de criar rupturas do ADN imediatamente, e protegendo do gRNA da degradação do RNA. Além disso, o uso de RNPs ignora a transcrição e a tradução; assim, evita edições tais como a força do promotor e o uso óptimo do Codon quando os elementos do plasmídeo são derivados de uma espécie diferente.
Os estudos da perda--função são uma das aproximações gerais a investigar funções potenciais dos genes do interesse. A fim estudar a função do gene durante a regeneração, um knock-out deve idealmente ser executado apenas antes de um ferimento para evitar efeitos no desenvolvimento. Além disso, o knock-out deve ser restrito às NSCs e região de regeneração. Um knock-out do gene alvo em todos os NSCs (incluindo aqueles no cérebro, que é o caso em sistemas CRE-LoxP), pode produzir efeitos não relacionados com a regeneração que pode confundir a interpretação dos resultados. Felizmente, a estrutura da medula espinhal Axolotl fornece uma oportunidade única para o tempo e espaço restrito knock-out em NSCs. A maioria das NSCS da medula espinhal estão em contato com o canal central e constituem a grande maioria das células em contato com o canal central16,17. Portanto, uma injeção do complexo CAS9-grna no canal central, seguida de eletroporação, permite a entrega às NSCS da medula espinhal em uma região desejada em um tempo específico4,18,19. Este protocolo demonstra como isto é executado, conduzindo ao knock-out altamente penetrante nos NSCs alvejados da medula espinal. posteriormente, são realizadas análises subsequentes para estudar os efeitos sobre a regeneração e o comportamento do NSC.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína 0,03% (peso/vol)</td><td>Misture 500 ml de 10&vezes; TBS, 500 ml de Holtfreter a 400% (peso / vol) » S e 30 ml de solução-mãe de benzocaína a 10% (p/vol). Encha o volume até 10 L com dH2O. A solução pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 6 meses.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína 10 % (p/vol)</td><td>Misturar 50 g de benzocaína em 500 ml de etanol a 100 % (vol/vol). A solução pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 12 meses.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato 1,2 mm O.D., 0,94 mm I.D.</td><td>Instrumento de gagueira</td><td>BF120-94-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>tampão CAS9, 10x</td><td>Misture 200 mM HEPES e 1,5 M KCl em água livre de RNase. Ajuste o pH para 7,5. Filtre esterilize, alíquota e armazene em &minus; 20 &deg; C por até 24 meses</td><td></td><td></td></tr><tr><td>proteína CAS9-NLS&nbsp; &nbsp;</td>Pratos de cultura de células <td>PNA Bio</td><td>CP03</td><td></td></tr><tr><td>, 10cm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinça Fina</td><td>Instrumentos Científicos Finos</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador</td><td>Nepa Gene&nbsp;</td>Gerador de pulso <td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BEX</td><td>CUY21EDIT II</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Solution, 5x</td><td>Dissolver 12,5 mg de pó Fast Green FCF em 10 mL de 1&times; Pbs.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrator de Micropipeta Flamejante/Marrom</td><td>Instrumento de gagueira</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Holtfreter' s solução 400% (wt/vol)&nbsp;</td><td>Dissolver 11,125 g de MgSO4&middot; 7H2O, 5,36 g de CaCl2&middot; 2H2O, 158,4 g de NaCl e 2,875 g de KCl em 10 L de dH2O. A solução pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 6 meses.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Pontas</td><td></td> de pipeta Merck 105886 <td></td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MN-153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>Pneumática PicoPump</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>Pinça de Anel SYS-PV830</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Scientific Instruments</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Olympus</td><td>SZX10;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com Tris, 10x</td><td>Dissolver 24,2 g de base Tris e 90 g de NaCl em 990 ml de dH2O. Ajuste o pH para 8,0 adicionando 10 ml de HCl a 37% (vol/vol). A solução pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 6 meses.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinças com Gap Variável 2 Eletrodos de Placa de Platina Redonda, diâmetro de 10mm</td><td>Gene Nepa</td><td></td><td></td>CUY650P10</tr></tbody></table>

gene direto knock-out de células-tronco neurais da medula espinhal axolotl via eletroporação de complexos de proteína-grna cas9

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

O Axolotl tem a habilidade original de regenerar inteiramente sua medula espinal. Isto é pela maior parte devido às pilhas ependymal permanecendo como pilhas de haste neural (NSCS) durante todo a vida, que proliferar para reformar o tubo ependymal e para diferenciar-se em neurônios perdidos após ferimento da medula espinal. Deciphering como estes NSCS mantêm o borne-desenvolvimento do pluripotência e proliferar em cima da lesão da medula espinal para reformar a estrutura exata do pre-ferimento pode fornecer a introspecção valiosa em como os cabos espinais mamíferos podem regenerar assim como opções potenciais do tratamento. Executar knock-outs do gene em subconjuntos específicos de NSCS dentro de um período de tempo restrito permitirá o estudo dos mecanismos moleculars atrás destes processos regenerativa, sem ser confundidos pelo desenvolvimento que perturbam efeitos. Descrito aqui é um método para realizar o knock-out do gene no NSCs da medula espinal de Axolotl usando o sistema de CRISPR-Cas9. Injetando o complexo de CAS9-gRNA no canal central da medula espinal seguido pelo Electroporation, os genes do alvo são nocauteados para fora em NSCs dentro das regiões específicas da medula espinal em um timepoint desejado, permitindo estudos moleculars de NSCs da medula espinal durante Regeneração.

A injeção e o electroporation do complexo de CAS9-gRNA de encontro a Sox2 no canal central da medula espinal do Axolotl conduziram a uma perda maciça de immunoreactivity Sox2 em uma maioria de NSCS da medula espinal, com o grna de encontro ao tyrosinase (Tyr) como um controle (Figura 2 A). B3-tubulin (manchado com TUJ1) é um marcador para neurônios e não foi expressa em NSCS, e SOX2-TUJ1-células que cercam o canal central foram consideradas células abrigando SOX...

É apresentado aqui um protocolo para executar a batida-para fora do gene tempo-e espaço-restrito em cordas espinais do Axolotl injetando o complexo de CAS9-gRNA no canal central da medula espinal seguido pelo Electroporation.

Gene direto knock-out de células-tronco neurais da medula espinhal Axolotl via eletroporação de complexos de proteína-gRNA CAS9

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Este protocolo permite o tempo rápido e altamente penetrante e eliminações genéticas com restrição de espaço em células-tronco neurais da medula espinhal axolotl para estudo dos mecanismos moleculares de regeneração da medula espinhal. Esta técnica permite o estudo da função genética em células-tronco neurais, sua regeneração médica sem ser confundida por efeitos de desenvolvimento ou efeitos de outros tipos celulares. Células-tronco neurais axolotil contribuem em grande parte para sua capacidade de regenerar suas medulas espinhais.Compreender mecanismos de regeneração pode levar a insights para o desenvolvimento de tratamentos para lesão medular humana. Este método fornece uma visão de como as células-tronco neurais axolotl montam uma resposta regenerativa à lesão medular. Posicionar corretamente a injeção capilar na coluna central da medula espinhal pode ser desafiador e praticar em animais de teste ajuda na dominar a técnica.Ver a administração pode mostrar como executar a injeção e como é uma injeção bem sucedida. Para preparar a mistura de proteína ribonuclear RNA guia Cas9, misture cinco microgramas de proteína sequência de localização nuclear Cas9, quatro microgramas de RNA

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este vídeo demonstra como visualizar caminhos axonal de grupos geneticamente definido de neurônios na medula espinhal utilizando pinto...

Decifrando Pathways Axonal dos Grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo Neural Utilizando Pintainho In ovo Eletroporação

Periventricular nodular heterotopia (PNH) é a forma mais comum de malformação do desenvolvimento cortical (MCD) na idade adulta, mas sua base genética permanece desconhecida em casos mais esporádicos. Recentemente desenvolvemos uma estratégia para identificar genes candidatos romance para MCDs e confirmar diretamente seu papel causal em vivo.

Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

mutagénese de direccionamento de genes é agora possível em uma ampla gama de microrganismos utilizando técnicas de edição genoma. Aqui, nós demonstramos um protocolo para mutagénese gene alvo usando ativador de transcrição como nucleases efetoras (TALENS) em Astyanax mexicanus, uma espécie de peixe que inclui peixes de superfície e cavefish.

Genoma Edição na<em&gt; Mexicanus Astyanax</em&gt; Usando Transcrição Activator-like Effector nucleases (TALENS)

Um protocolo simples e eficiente de microinjeção para edição de genes em embriões de bagre de canal usando o sistema CRISPR/Cas9 é apresentado. Neste protocolo, guia de RNAs e proteínas Cas9 foram injetadas na gema de uma célula de embriões. Este protocolo foi validado por nocauteando dois genes imune-relacionados de bagre do canal.

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

Um protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediada disrupção do gene no mouse e células hematopoiéticas primárias humanas é descrito neste artigo. Ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA são introduzidas através de eletroporação com sgRNAs gerados através da transcrição em vitro e Cas9 comercial. Alta eficiência de edição é obtida com tempo limitado e custo financeiro.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Estudos convencionais de perda-de-função de genes usando animais nocaute foram frequentemente dispendioso e demorado. Baseado em Electroporation mutagênese mediada por CRISPR somática é uma ferramenta poderosa entender gene funciona em vivo. Aqui, nós relatamos um método para analisar os fenótipos de nocaute nas células em proliferação do cerebelo.

Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada

Aqui, nós descrevemos um protocolo para introduzir um nocaute do gene no amastigotas extracelular de Trypanosoma cruzi, usando o sistema de crispr/Cas9. O phenotype do crescimento pode ser seguido acima pela contagem da pilha da cultura axênicos do amastigotas ou pela proliferação de amastigotas intracelular após a invasão da pilha de anfitrião.

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Este objetivo deste protocolo é produzir axolotos quiméricos com membros dianteiros haploides derivados de tecido doador mutagenizado de Cas9 usando técnicas de enxerto de tecido embrionário.

Geração de Axolotis Quiméricos com Membros Haploides Mutantes através de enxerto embrionário

A eletroporação de organoides cerebrais de primatas fornece uma abordagem precisa e eficiente para introduzir modificações genéticas transitórias em diferentes tipos de progenitores e neurônios em um sistema modelo próximo ao desenvolvimento do neocórtex (pato)fisiológico de primatas. Isso permite o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos e também pode ser aplicado para modelagem de doenças.

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Este protocolo descreve o procedimento de edição do genoma em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos usando complexos ribonucleoprotéicos Cas9-sgRNA montados in vitro e liberados por eletroporação.

Ruptura Gênica de Alta Eficiência em Macrófagos Primários Derivados da Medula Óssea Usando Complexos Eletroporados Cas9-sgRNA

A linhagem celular THP-1 é amplamente utilizada como modelo para investigar as funções de monócitos/macrófagos humanos em várias áreas de pesquisa relacionadas à biologia. Este artigo descreve um protocolo para engenharia eficiente baseada em CRISPR-Cas9 e isolamento de clone de célula única, permitindo a produção de dados fenotípicos robustos e reprodutíveis.

Nocaute de gene mediado por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação em células THP-1 e isolamento de clone de célula única

Aprenda a realizar knock-out gênico direto em células-tronco neurais da medula espinhal de axolote via eletroporação de complexos CAS9-gRNA. Este método permite estudar mecanismos moleculares da regeneração medular sem efeitos confundidores do desenvolvimento.

Gene direto knock-out de células-tronco neurais da medula espinhal Axolotl via eletroporação de complexos de proteína-gRNA CAS9

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