Name: Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda microscopia intravital para visualizar linfócitos intraepiteliais γδ no intestino delgado murino usando microscopia confocal de disco giratório. Esta técnica permite rastrear células vivas por até 4 horas.

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Este trabalho é apoiado pela NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Agradecemos a Madeleine Hu por sua ajuda na edição do manuscrito e no fornecimento dos dados mostrados nos resultados representativos.

Todos os estudos foram conduzidos em uma associação de avaliação e acreditação de laboratório de cuidados com animais (AALAC)-instalações credenciadas de acordo com protocolos aprovados pela Rutgers New Jersey Medical School recursos de medicina comparativa.
1. preparação do mouse
Nota: O procedimento a seguir, incluindo preparação e cirurgia de animais, levará de 30 a 40 min. antes da cirurgia, ligue o microscópio e aqueça a incubadora fechada no microscópio para 37 ° c.
<ol><li>Realize experimentos em camundongos TcrdEGFP de 8 – 10 semanas de idade em um fundo C57BL/6, que foram obtidos de Bernard Malissen (INSERM, Paris, França). De acordo com o procedimento aprovado pelo IACUC, anestesiam o camundongo pela injeção i.p. de cetamina (120 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) com base no peso do animal. Avaliar o nível de anestesia por taxa de respiração (55 – 65 respirs por minuto)21, pinça Toe e reflexo palpebral.</li>
	<li>Uma vez que a anestesia plana cirúrgica é alcançada, fixe os pés traseiros do rato usando a fita a uma almofada de aquecimento para manter a temperatura de corpo, que pode ser monitorada pelo termômetro rectal. Se houver sinais de que a anestesia está se desgastando (por exemplo, aumento da taxa de respiração, piscar e/ou músculo ocular espasmos resposta ao reflexo palpebral), re-administrar 50 μL de cetamina/xilazina em um momento até que o mouse é totalmente sedado.</li>
	<li>Prepare o corante nuclear diluindo 50 μL de Hoechst 33342 (10 mg/mL) com 315 μL de soro fisiológico de 0,9%; a concentração final é de 37,5 mg/kg com base no peso do rato (200 μL de volume aproximado). Uma vez que o rato é anestesiado, injete lentamente o Hoechst usando uma seringa da tuberculina através da cavidade venosa retro-orbital. Nota: Aguarde 1 – 2 min antes de prosseguir para a próxima etapa para permitir que o mouse aclimatar para a mudança no volume circulante após a injeção retro-orbital.</li>
	<li>Coloque uma pequena quantidade de lubrificante sobre os olhos para impedi-los de secar.</li>
</ol>2. cirurgia do rato: laparotomia para expor a mucosa intestinal
<ol><li>Faça uma incisão vertical de 2 cm através da pele e peritônio ao longo da linha média do abdômen inferior para externalizar a região do intestino a ser imaged.</li>
	<li>Usando fórceps angular, puxe com cuidado o cálio para fora da cavidade peritoneal e identifique a área do intestino delgado a ser imaged. Tenha cuidado para não rasgar os vasos sanguíneos mesentéricos durante este processo. Para minimizar potenciais danos ou sangramento, evite agarrar ou beliscar o intestino com o fórceps.</li>
	<li>Localize uma região adequada de intestino delgado (2 – 3 cm) para imagens que contêm conteúdo fecal mínimo. Retorne com cuidado o ceco e o intestino delgado restante na cavidade peritoneal, ao deixar o segmento do interesse externalized. Nota: Evite perfurar o ceco ou interromper a vasculatura mesentérica durante esta etapa.</li>
	<li>Coloque dois pares de fórceps em ambos os lados do mesenteria subjacente entre os vasos sanguíneos e esfregue suavemente as pontas da pinça juntas para criar um furo na membrana (Figura 1)22. Isto permitirá que a agulha passe através do mesentério ao fechar a cavidade peritoneal abaixo do intestino.</li>
	<li>Feche a incisão enquanto mantém o laço do intestino exteriorizado. Usando o fórceps angular e uma agulha curvada, do ponto do atarraxamento unida a uma sutura de 5 cm, penetre um lado do peritoneum, atravessa o furo feito na etapa precedente, e acima através do outro lado do forro peritonealny. Coloc uma sutura na parte superior, e outra perto da parte inferior da incisão. Nota: Evite danificar a vasculatura durante esta etapa.</li>
	<li>Repita este processo para fechar a pele o laço intestinal, colocando uma sutura no meio da incisão, entre as suturas anteriores no peritônio subjacente. Nota: É importante apenas externalizar a área a ser fotografada; Isto reduzirá o movimento estranho durante a imagem latente. Certifique-se de evitar amarrar as artérias mesentéricas.</li>
	<li>Use um eletrocautério para fazer uma linha de perfuração ao longo da beira antimesenteric. Imediatamente após a cauterização, aplique algumas gotas da água à superfície do intestino para impedir dano de tecido calor-induzido adicional. Blot com um Kimwipe para remover a água residual.</li>
	<li>Corte uma pequena fenda horizontal na borda distal do tecido cauterizado usando as tesouras de Vannas e prossiga para cortar ao longo do comprimento da linha cauterizada em direção à extremidade proximal do segmento de tecido externalizado (aproximadamente 1,5 cm de comprimento) para expor a mucosa Superfície. Nota: Se necessário, use fórceps para remover suavemente qualquer excesso de conteúdo fecal restante na superfície exposta da mucosa.</li>
	<li>Cubra o abdômen do rato com um Kimwipe úmido para impedir que o tecido se torne desidratado. Transportar o mouse para o microscópio em uma embarcação coberta.</li>
</ol>3. aquisição de imagem por microscopia confocal de disco giratório
<ol><li>Pipete 150 μL de 1 μM AlexaFluor 633 em HBSS para o fundo de vidro de um prato de 35 mm. Posicione o mouse de modo que a superfície mucosa aberta entre em contato diretamente com a lamínula.</li>
	<li>Incline a cabeça do microscópio para trás e coloc o rato no prato coverescorregado na fase da imagem latente em uma incubadora pre-warmed. Alternativamente, cubra o rato por uma manta de aquecimento para manter a temperatura do corpo.</li>
	<li>Inicie o software de imagem. A intensidade de excitação e o tempo de exposição de cada laser não devem exceder 10 – 15 mW ou 120 – 150 ms, respectivamente, para evitar o fotobranqueamento e minimizar o intervalo entre os pontos temporais. Ajuste a média do quadro para "2" e ative a função de ganho EM para reduzir o ruído de fundo. Selecione a calibração objetiva de 63x para assegurar a medida correta do tamanho do pixel. Nota: Os ajustes detalhados acima são significados fornecer uma referência inicial, mas variarão dependendo das configurações individuais do microscópio.</li>
	<li>Usando o laser de 405 nanômetro e o objetivo do ar 20x, visualize os núcleos para encontrar um campo dos Villi que faltam o movimento ou a tração perceptível pelo olho. Evite áreas de movimento vesícula devido à respiração, peristaltismo ou batimento cardíaco.</li>
	<li>Usando a varredura XY, registre a coordenada XY do campo de interesse e mude para o objetivo da imersão 63X do glicerol.</li>
	<li>Confirme que as vilosidades no campo selecionado são estáveis adquirindo uma imagem ao vivo no canal 405 nm por até 1 min.</li>
	<li>Ao adquirir uma imagem ao vivo no canal 405 nm, ajuste o foco para encontrar o plano ortogonal logo abaixo da ponta villous. Adquira pilhas Z a partir do logo abaixo do epitélio da ponta villous abaixo do vilosidades até que seja difícil resolver os núcleos, aproximadamente 15 – 20 μm, usando uma etapa de 1,5 μm. Nota: Quando a imagem latente com três canaletas (405, 488, 640 nanômetro) usando os tempos da exposição descritos acima, é possível adquirir todos os três canaletas sequencialmente em intervalos de aproximadamente 20 s.</li>
	<li>Abra o software em modo de análise, 3 – 5 min após o início da aquisição, para confirmar a estabilidade da imagem e a motilidade ltγδ IEL. Continue a adquirir imagens por 30 – 60 min para cada campo de Villi. Registre 2 – 3 campos para cada mouse. Durante a imagem, monitore o mouse a cada 5 min. Nota: Se a anestesia começa a se desgastar, use fórceps para esfregar suavemente o pescoço do mouse para administrar 50 μL de cetamina/xilazina de cada vez. Continuar a monitorizar os níveis de anestesia e re-administrar quando necessário.</li>
	<li>Não é aconselhável a imagem de um único mouse por mais de 4 h. Após a conclusão da aquisição da imagem, Sacrifique os camundongos por luxação cervical seguida de pneumotórax bilateral.</li>
</ol>4.4D análise de imagens
<ol><li>Importe diretamente arquivos de imagem para o software de renderização 4D.</li>
	<li>Crie superfícies individuais para IELS e o lúmen e, em seguida, acompanhe as superfícies ao longo do tempo usando os parâmetros descritos na tabela 1 como uma referência inicial. Para os IELs, ative dividir objetos tocantes usando o diâmetro do ponto de semente indicado.</li>
	<li>Use o algoritmo de rastreamento autoregressivo para determinar a motilidade do IEL. Embora o algoritmo de rastreamento seja relativamente preciso, é imperativo inspecionar visualmente as faixas para cada IEL individual. Se uma faixa estiver incorreta, corrija-a usando as funções Desconectar e conectar a guia Editar faixas .</li>
	<li>Para determinar a distância de cada IEL ao lúmen, selecione a superfície do lúmen e realize a função de transformação de distância no menu de ferramentas . Quando solicitado, selecione fora do Surface. Uma vez calculado, a transformação de distância será exibida como o 4º canal.</li>
	<li>Filtre a intensidade mínima do 4º canal para selecionar Ltγδ IELS que estejam dentro do espaço intercelular lateral (LIS). Esse valor deve ser próximo a 15 μm, com base na altura de uma célula epitelial colunar. A percentagem de ltγδ IELs totais dentro deste intervalo é relatada como a frequência de ltγδ IELs no LIS.</li>
	<li>Para uma análise mais aprofundada, exporte dados estatísticos, incluindo: velocidade da faixa IEL, deslocamento da faixa, lineabilidade da faixa e comprimento da faixa. Alternativamente, analise os dados usando o módulo Vantage. Dependendo do experimento, obtenha métricas adicionais dos dados adquiridos, incluindo o tempo de permanência dentro das interações LIS ou IEL/epitelial.</li>
</ol>

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<li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+migration+of+gammadelta+intraepithelial+lymphocytes+requires+occludin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).</li>
<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Migration+Limits+Transepithelial+Pathogen+Invasion+and+Systemic+Disease+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice.</a> Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).</li>
<li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+IL-15+Is+a+Critical+Regulator+of+gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Motility+within+the+Intestinal+Mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).</li>
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<li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).</li>
<li>Sandrock, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+reveal+origin%2C+persistence+and+non-redundant+functions+of+IL-17-producing+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).</li>
<li>Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR18+is+required+for+a+normal+CD8alphaalpha+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).</li>
<li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR55+regulates+intraepithelial+lymphocyte+migration+dynamics+and+susceptibility+to+intestinal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage.</a> Sci Immunol. 2 (18), (2017).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O desenvolvimento de técnicas de microscopia intravital proporcionou uma oportunidade inédita de observar a reorganização das estruturas subcelulares8,9,22, interações célula-celular12, 25 e comportamento migratóriocelular 13,14,15,16,</s...

Os linfócitos intraepithelial (IEL) são situados dentro do epitélio intestinal, e são encontrados ao longo da membrana do porão e entre pilhas epithelial adjacentes no espaço intercelular lateral1. Há aproximadamente um IEL para cada 5-10 pilhas epithelial; Estes IELs servem como sentinelas para fornecer a fiscalização imune da grande extensão da barreira epithelial intestinal2. Os IELs que expressam o receptor da célula ltγδ T (TCR) compreendem até 60% da população total de IEL no intestino delgado murino. Estudos em camundongos T-Cell-deficientes ltγδ demonstram um papel de grande proteção dessas células em resposta a lesão intestinal, inflamação e infecção3,4,5. Apesar da geração do mouse nocaute Tcrd 6, nossa compreensão da biologia ltγδ IEL permanece limitada devido, em parte, ao fato de que os ligantes reconhecidos pelo ltγδ TCR ainda não foram identificados7. Como resultado, a falta de ferramentas para estudar esta população celular dificultou a investigação do papel da ativação e função do ltγδ TCR condições fisiológicas e patológicas. Para preencher essa lacuna, desenvolvemos técnicas de imagem ao vivo para visualizar o comportamento migratório de ltγδ IEL e interações com enterócitos vizinhos como um meio para fornecer informações adicionais sobre a função ltγδ IEL e responsividade aos estímulos externos in vivo.
Durante a última década, a imagem latente Intravital expandiu significativamente nossa compreensão dos eventos moleculars envolvidos em facetas múltiplas da biologia intestinal, incluindo o derramamento epithelial8da pilha, regulamento da função epithelial 9 da barreira ,10, amostragem de células mielóides de conteúdo Luminal11,12e interações hospedeiro-micróide11,13,14,15,16 . No contexto da biologia de IEL, o uso da microscopia intravital tem derramado luz sobre a dinâmica espaciotemporal da motilidade de IEL e os fatores que mediam o seu comportamento de vigilância13,14,15, a 16. O desenvolvimento de camundongos de repórter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), que rotula ltγδ IELs pela expressão nuclear de GFP17, revelou que Ltγδ IELS são altamente motile dentro do epitélio e exibem um comportamento de vigilância único que é responsivo a microbiana infecção17,13,14. Recentemente, um outro rato do repórter da pilha de ltγδ T foi desenvolvido (Tcrd-GDL) que expressa GFP no citoplasma para permitir o visualização da pilha inteira18. Metodologia semelhante tem sido utilizada para investigar a exigência de receptores específicos de quimiocina, como o receptor acoplado à proteína G (GPCR)-18 e-55, sobre a dinâmica da motilidade de IEL19,20. Na ausência de um repórter Cell-specific, os anticorpos conjugado fluorescentes de encontro a CD8α foram usados para visualizar e seguir a motilidade de IEL in vivo19,20. Embora a microscopia de varredura do laser do dois-fóton seja usada geralmente para a imagem latente intravital, o uso da microscopia confocal do laser do disco de giro fornece vantagens originais para capturar imagens multicanal de alta velocidade e de alta resolução com ruído de fundo mínimo. Esta tecnologia é ideal para elucidar a dinâmica espaciotemporal das interações imunológicas/epiteliais dentro do complexo microambiente da mucosa intestinal. Além disso, através do uso de vários modelos transgênicos e/ou Knockout mouse, esses estudos podem fornecer informações sobre a regulação molecular da função intestinal imune e/ou células epiteliais.

<table><tbody><tr><td>Prato de 35 mm, Nº 1.5 Lamínula</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Hidrazida</td><td>Invitrogen</td><td>A30634</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Agulhas hipodérmicas - 27 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Estéril com Ponta Deslizante BD - 1 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringa Tuberculina</td><td>Thermo Fisher Tesoura</td> de dissecação Scientific <td>14-829-9</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Eletrocautério</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50822501</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de incubação fechada</td><td>OKOLAB</td><td></td><td>Agulhas</td></tr><tr><td>para Microscópio para Olhos, Tamanho #3; Círculo de 1/2, Ponto de Conicidade, 12 mm Comprimento do Acorde</td><td>Roboz</td><td>RS-7983-3</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Solução salina balanceada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55037C</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaris (v. 9.2.1) com módulos Start, Track, XT</td><td>Software</td><td>Bitplane</td><td></td></tr><tr><td>Inverted DMi8</td><td>Leica</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>IQ3 (v. 3.6.3)</td><td>Andor</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Putney</td><td></td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Tesoura Kimwipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 3" (7,5 cm) Longo 5 x 0,15 mm Reto Afiado</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Sutura cirúrgica não absorvível, Carretel de Seda, Trançado Preto</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0798934</td><td></td></tr><tr><td>Nugent Forceps 4.25" (11 cm) Ponta lisa angular longa de 1,2 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5228</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Pomada</td><td>Dechra</td><td></td><td>Lubrificante para os Olhos</td></tr><tr><td>Disco giratório Yokogawa CSU-W1 com uma objetiva de imersão de glicerol 63x 1,3 N.A. HC PLAN APO, câmera iXon Life 888 EMCCD, laser de diodo de 405 nm, laser DPSS de 488 nm, laser de diodo de 640 nm</td><td>Andor</td><td></td><td>Sistema confocal</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td></td><td>Anesthesia</td></tr></tbody></table>

imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Os linfócitos intraepithelial que expressam o receptor da pilha de ltγδ T (ltγδ IEL) jogam um papel chave na fiscalização imune do epitélio intestinal. Devido, em parte, à falta de um ligantes definitivo para o receptor de células ltγδ T, nossa compreensão da regulação da ativação ltγδ IEL e sua função in vivo permanece limitada. Isso requer o desenvolvimento de estratégias alternativas para interrogar as vias de sinalização envolvidas na regulação da função ltγδ IEL e a responsividade dessas células ao microambiente local. Embora os IELS do ltγδ sejam compreendidos extensamente para limitar o translocation do micróbio patogénico, o uso da imagem latente intravital tem sido crítico a compreender a dinâmica armazenamento de interações de IEL/epithelial no estado estacionário e em resposta aos micróbios patogénicos invasores. Nisto, nós apresentamos um protocolo para visualizar o comportamento migratório de IEL na mucosa intestinal pequena de um rato do repórter da pilha de GFP ltγδ T usando a microscopia de laser confocal invertida do disco de giro. Embora a profundidade máxima da imagem latente desta aproximação seja limitada relativo ao uso da microscopia do laser-exploração do dois-fóton, a microscopia confocal do laser do disco de giro fornece a vantagem da aquisição de imagem de alta velocidade com photobranqueamento reduzido e photodamage. Usando o software da análise de imagem 4D, o comportamento da fiscalização da pilha de T e suas interações com pilhas vizinhas podem ser analisados depois da manipulação experimental para fornecer a introspecção adicional na ativação e na função de IEL dentro da mucosa intestinal.

Usando a imagem latente intravital de ratos do repórter de tcrdegfp, nós mostramos previamente que ltγδ IELS exibem um comportamento dinâmico da fiscalização, em que patrulham o epitélio migrando ao longo da membrana do porão e no espaço intercelular lateral (LIS) em constante Estado (Figura 2, filme 1).
Essa abordagem também pode ser usada para avaliar como a inibição de vias de sinalização celular específica e/ou receptores influencia o comporta...

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

A microscopia intravital da pequena mucosa intestinal pode fornecer uma visão da dinâmica espesso das interações celulares dentro do epitélio entre diferentes tipos de células imunes, ou entre esses dois compartimentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a aquisição de imagens de alta velocidade e alta resolução dentro da mucosa intestinal em tempo real. Imagens ao vivo do intestino podem fornecer informações adicionais sobre as interações celulares, ou sinalização celular envolvida na imunidade mucosa, biologia epitelial ou biologia do câncer.Trata-se de um método desafiador que requer a prática da técnica cirúrgica, bem como paciência e posicionamento ideal do mouse para aquisição de imagem. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um rato transgênico anestesiado, expressando uma proteína fluorescente verde aprimorada, ou EGFP, receptor de células T Gamma-delta, use uma seringa tuberculina para injetar lentamente 200 microliters de Hoechst 33342 Dye Solution recém-preparada no seio venoso retro-orbital. De um a dois minutos após a injeção, aplique pomada nos olhos do animal para evitar que eles sequem.Em seguida, faça uma incisão vertical de 2CM através da pele e do peritônio, ao longo da linha média do abdômen inferior e use fórceps angulares para retirar cuidadosamente o caecum da cavidade peritoneal. Identifique uma área de 2-3CM do intestino delgado que contenha conteúdo fecal mínimo, tomando cuidado para não rasgar os vasos sanguíneos mesenéricos, e devolva cuidadosamente o caecum e o intestino delgado restante para a cavidade peritoneal, deixando o segmento de interesse externalizado. Colocando dois pares de fórceps em ambos os lados do mesentery sublinhado entre os vasos sanguíneos, esfregue suavemente as pontas dos fórceps juntos para criar um buraco na membrana.Usando fórceps angulares e uma agulha de ponto de fita curva presa a uma sutura de 5CM, penetre um lado do peritônio através do orifício na membrana, e até o outro lado do revestimento peritônio, colocando uma sutura na parte superior, e outra perto do fundo da incisão para fechar a incisão, mantendo o laço do intestino externalizado. Para aumentar a probabilidade de sucesso, não amarre ou rasgue nenhum vaso sanguíneo ao colocar a sutura abdominal e limite qualquer manuseio ím loc. Em seguida, feche a pele sob a alça intestinal da mesma forma, colocando uma sutura no meio da incisão entre as suturas anteriores no peritônio sublinhado.Usando um eletrocauteno, faça uma linha de perfuração ao longo da fronteira antimesenteric e aplique imediatamente algumas gotas de água na superfície do intestino para evitar danos adicionais nos tecidos induzidos pelo calor. Borrida com um kimwipe para remover água residual. Use uma tesoura de vanna para cortar uma fenda horizontal de aproximadamente 1,5CM na borda distal do tecido cauterizado, ao longo do comprimento da linha cauterizada, em direção à extremidade proximal do segmento tecidual externalizado.Quando a superfície mucosa estiver exposta, cubra o abdômen com um kimwipe úmido para manter o tecido hidratado. Para a Imagem de Microscopia Confocal do Disco Giratório, transporte o mouse para o microscópio em um vaso coberto. Inicie o software de imagem e incline a cabeça do microscópio para trás, e adicione 150 microlitros de 1 maçaria de pulgas de micromolar Alexa Fluor e a solução salina tampão da Hank no fundo escorregado da tampa de vidro.Posicione o mouse para que a superfície mucosa aberta entre em contato diretamente com a mancha de cobertura. Coloque o mouse e o prato sobre o palco de imagem em uma incubadora pré-aquecida. Defina a intensidade de excitação e o tempo de exposição de cada laser em não mais de 10-15 miliwatts e 120-150 milissegundos, respectivamente, e ajuste a Média do Quadro para 2.Ligue a função Ganho de Multiplicação eletrônica para reduzir o ruído de fundo e selecione a Calibração Objetiva 63X para garantir uma medição correta do tamanho do pixel. Utilizando o laser de 405 nanômetros e o objetivo do ar 20X, visualize manualmente os núcleos para localizar um campo de villi que carece de movimento ou deriva perceptível, evitando áreas de movimento artefatoual devido à respiração, peristalse ou batimentos cardíacos. Usando o X-Y Scan, registe a coordenada X-Y do campo de interesse e mude para o objetivo de imersão 63X de glicerol.Adquira uma imagem ao vivo no canal de 405 nanômetros por até 1 minuto para confirmar que os villi no campo selecionado são estáveis, enquanto ajustam o foco para encontrar o plano ortogonal logo abaixo da ponta villus. Em seguida, adquira pilhas z, partindo logo abaixo do epitélio da ponta villus, cerca de 15-20 micrômetros até o villus até que seja difícil resolver os núcleos, usando 1,5 passos de micrômetro. 3-5 minutos após o início da aquisição, confirme a estabilidade da imagem e a Motilidade celular intraepithelial Gamma-delta, e continue adquirindo imagens por 30-60 minutos para cada campo de villi.Os linfócitos intraepitheliais gama-delta exibem um comportamento dinâmico de vigilância, no qual patrulham o epitélio migrando ao longo da membrana do porão e para o espaço intercelular lateral em estado de estudo. Nestas imagens representativas, as faixas coloridas indicam os caminhos migratórios de linfócitos intraepitheliais gamma-delta ao longo de 30 minutos. Embora a frequência de linfócitos intraepitheliais no espaço intercelular lateral tenha aumentado em camundongos tratados com anticorpo beta receptor anti-interleucina-2, mais de 30% desses linfócitos intraepitelíacos gama-delta apresentaram um comportamento ocioso.Este fenótipo de marcha ociosa foi confirmado por uma redução significativa tanto na velocidade instantânea quanto na razão de confinamento dos linfócitos intraepitheliais gama-delta, após o bloqueio interleucina-2-receptor, em relação aos controles. Além disso, os linfócitos intraepitheliais gama-delta ociosos tinham tempos mais longos, e eram mais frequentemente localizados dentro do espaço intercelular lateral, em comparação com linfócitos intraepitheliais glifoseíacos motile Gamma-delta. Pode ser difícil identificar campos de villi que não possuem movimento excessivo devido à peristalse.O reposicionamento do mouse pode ajudar na localização de um campo mais estável. Uma análise mais aprofundada dos dados de rastreamento celular pode ajudar a identificar comportamentos específicos de motilidade ou fornecer métricas adicionais para medir as interações celulares. A imagem intravital e a análise da iel-motilidade tornaram-se uma leitura padrão da função IEL, fornecendo insights sobre como a sinalização imunológica inata regula a função IEL Gamma-delta.

intravital-imaging-intraepithelial-lymphocytes-murine-small

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Uma técnica para a realização de microscopia intravital do linfonodo inguinal (LN) é descrito. Tal técnica permite em tempo...

Microscopia intravital do linfonodo inguinal

Recentes avanços em 2-fotão microscopia permitiram em tempo...

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Este vídeo demonstra a visualização de linfócitos intraepiteliais γδ (IELs) em camundongos transgênicos usando microscopia confocal. O procedimento cirúrgico envolve a criação de uma linha de perfuração e a realização de uma incisão longitudinal para expor a mucosa intestinal e as vilosidades. Os camundongos transgênicos expressam proteínas repórter exclusivamente em γδ IELs, permitindo seu rastreamento. A imagem intravital captura o movimento dinâmico de γδ IELs marcados com fluorescência...

Visualização intravital de linfócitos intraepiteliais gama delta

Usando camundongos repórteres transgênicos e marcadores fluorescentes injetáveis, a microscopia confocal de disco giratório intravital de longo prazo permite a visualização direta do comportamento das células mielóides no adenoma intestinal no modelo de câncer colorretal ApcMin / +.

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics Apc Min / + Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Há um interesse crescente na caracterização quantitativa de linfócitos intestinais devido ao crescente reconhecimento de que essas células desempenham um papel crítico em uma variedade de doenças intestinais e sistêmicas. Neste protocolo, descrevemos como isolar populações de células únicas de diferentes compartimentos do intestino delgado para posterior caracterização por citometria de fluxo.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

Descrevemos aqui um modelo de camundongo repórter transgênico para visualizar as células produtoras de IL-22 dentro de diferentes tecidos de camundongos. Este método pode ser usado para rastrear a localização de outras citocinas ou proteínas secretas no camundongo.

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Aqui, demonstramos os métodos para a quantificação na vivo de saída de leucócitos de ingênuo, inflamado e pele murino maligna. Realizamos uma Head-to-comparação de dois modelos: transdermal FITC photoconversion de aplicativo e in situ . Além disso, vamos demonstrar a utilidade da photoconversion para controlar a saída de leucócitos de tumores cutâneos.

Quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores

Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.

Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Apresentamos aqui um método para obter imagens do intestino após ferimento induzido por laser. Ao expor o intestino do camundongo a um laser multifóton, a perda de uma única ou múltiplas criptas é induzida localmente. Ao obter imagens repetidas da área danificada ao longo de meses, a dinâmica em tempo real da recuperação intestinal é capturada.

Ablação a Laser e Microscopia Intravital no Estudo do Remodelamento Intestinal

Aprenda microscopia intravital para visualizar linfócitos intraepiteliais γδ no intestino delgado murino usando microscopia confocal de disco giratório. Esta técnica permite rastrear células vivas por até 4 horas.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

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