Name: Teste anticorpo-livre para a análise da atividade do methyltransferase do RNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda a realizar ensaio in vitro sem anticorpos para analisar atividade de metiltransferase de RNA usando S-adenosil-metionina tritiada. Este método permite quantificação e visualização sensíveis de RNA metilado.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Turja Kanti Debnath por sua ajuda com a ChemDraw. A pesquisa no laboratório de Xhemalçe é apoiada pelo departamento de defesa-programa de investigação médica dirigido Congressionally-prêmio da descoberta do cancro da mama (W81XWH-16-1-0352), concessão de NIH R01 GM127802 e fundos do start-up do Instituto de celular e Biologia molecular e faculdade de ciências naturais da Universidade do Texas em Austin, EUA.

1. a transcrição in vitro e a purificação do gel do RNA alvo
<ol><li>Clone a seqüência de interesse em plasmíos contendo T7 e/ou SP6 promotores usando técnicas de clonagem molecular estabelecidas12 ou kits.</li>
	<li>Linearização do modelo de DNA para transcrição in vitro
	<ol>
<li>Amplificar a seqüência de interesse por PCR do plasmídeo com primers projetados para incluir a região promotora T7 através da pastilha, + 20-30 BP upstream e downstream como descrito anteriormente13.</li>
		<li>Alternativamente, digerir 5 μg do plasmídeo utilizando um local de corte da enzima de restrição (RE) disponível a jusante da pastilha de acordo com as instruções fornecidas pelo fornecedor do RE. Nota: Lembre-se de verificar se a pastilha não foi cortada pelo RE selecionado. A seleção do RE usada nesta etapa pode afetar dramaticamente o rendimento da transcrição. Preferencialmente, linearizar com uma extremidade sem corte ou 5 '-overhanging produzindo o re para evitar a comutação do modelo da polimerase do RNA T7 na costa oposta14do ADN. Tente RE diferente se os rendimentos iniciais forem insuficientes.</li>
	</ol></li>
	<li>Purify o ADN resultante usando o jogo para a extração e a limpeza do gel do Agarose do ADN. Elute o DNA com 30 μL de água.</li>
	<li>Misture bem por vortexing, Pipet 1,5 μL e medir a concentração de DNA com um Espectrofotômetro de microespectrômetro.</li>
	<li>Use 250 ng do ADN para verific a qualidade e o tamanho do ADN purified em uma electroforese do gel de agarose de 1% no amortecedor de 1x TBE migrado para 1 h em 4 V/cm.</li>
	<li>Descongelar os reagentes congelados do kit de transcrição in vitro. Coloque o T7 RNA polymerase Mix no gelo, e os outros reagentes em um pulverizador em temperatura ambiente. Imediatamente após o descongelar completo, gire rapidamente os tubos rNTP para 5 s para coletar a solução na parte inferior dos tubos e coloc no gelo. Mantenha o buffer de reação 10x à temperatura ambiente para evitar a precipitação.</li>
	<li>Pipet em um tubo de 1,5 mL os seguintes componentes da reação da transcrição de 20 μL na temperatura ambiente na ordem indicada: 6 μL da água, 2 μL (0,1-1 μg) do molde linear do ADN, 2 μL da solução do ATP de 75 milímetros, 2 μL da solução de 75 mM GTP , 2 μL de solução CTP de 75 mM, 2 μL de solução UTP de 75 mM, 2 μL de tampão de reacção 10x e 2 μL de mistura de RNA polimerase T7. Nota: para o modelo de DNA gerado por PCR, use 100-200 ng DNA; para o modelo do ADN gerado pela digestão da enzima da limitação de um plasmídeo, use ~ 1 μg. recombinante ativo sua6-TAGGED T7 RNA polimerase pode ser purificada em E. coli15.</li>
	<li>Misture o tubo completamente. A rotação rápida para 5 s para coletar a solução da reação na parte inferior do tubo, a seguir incubar em 37 ° c para 2-4 h. Nota: cada transcrição vai se comportar de forma diferente, dependendo do modelo de DNA, seu comprimento, sua seqüência ou estrutura. Otimize as condições de transcrição in vitro testando diferentes tempos de incubação até 6 h; diferentes concentrações de modelo de DNA, T7 RNA polimerase, ou NTP; ou adição de MgCl suplementar2 ao que está presente na mistura de RNA polimerase T7.</li>
	<li>No final do período de incubação, adicionar 1 μL de DNase I por 20 μL de reacção e incubar a 37 ° c durante 15 min. Nota: a reacção de transcrição pode ser temporariamente mantida no gelo até que o gel de poliacrilamida esteja pronto.</li>
	<li>Proceder com a purificação por gel de poliacrilamida. Nota: desde que o RNA é sensível à contaminação do pH e do RNase, use o equipamento dedicado RNA e os reagentes RNase-livres.</li>
	<li>Determinar a percentagem de poliacrilamida para o gel, dependendo do tamanho da transcrição de juros: 3,5% para 100-2000 NT (XC: 460 NT; BB: 100 NT), 5% para 80-500 NT (XC: 260 NT; BB: 65 NT), 8% para 60-400 NT (XC: 160 NT; BB: 45 NT), 12% para 40-200 NT (XC: 70 NT; BB: 20 NT), 15% para 25-150 NT (XC: 60 NT; BB: 15 NT), e 20% para 6-100 NT (XC: 45 NT; BB: 12 NT).</li>
	<li>Prepare a ureia desnaturando o gel de poliacrilamida combinando os seguintes reagentes em um tubo cônico de 50 mL: 9,6 g de ureia de grau molecular, 2 mL de 10x TBE, x mL de acrilamida a 40%: mistura de bis-acrilamida (29:1) e água até a marca de 20 mL no tubo , onde x = 20 mL/(40%/percentagem de gel%). Cuidado: os géis de polyacrylamide contêm frequentemente o acrilamida un-polimerizado que é um material tóxico que possa produzir um perigo quando introduzido ao ambiente. Descarte os géis de poliacrilamida através do programa de resíduos químicos da instituição.</li>
	<li>Microondas para 15 s a 30% de potência. Coloque no pulverizador por 10 min à temperatura ambiente ou até que a ureia tenha sido completamente dissolvida.</li>
	<li>Enquanto a mistura de gel está girando, recuperar uma gaveta de gel (18-bem, 1 mm de espessura; 13,3 x 8,7 cm (W x L)), retire o pente e posicione a gaveta para fundição de gel.</li>
	<li>Gire rapidamente o tubo de 50 mL para 5 s para coletar a solução do gel na parte inferior do tubo. Adicionar 125 μL de solução de persulfato de amónio a 10% (APS). Coloque no pulverizador para ~ 1 min. Quick spin novamente por 5 s.</li>
	<li>Adicione 25 μL de tetrametilenodiamina (TEMED) e misture cuidadosamente pipetando para cima e para baixo 5 vezes com uma pipeta de 25 mL evitando bolhas.</li>
	<li>Pipeta no molde do gel e insira com cuidado o pente do gel que evita bolhas.</li>
	<li>Aperte o selo adicionando um grande grampo da pasta sobre a parte superior da gaveta.</li>
	<li>Permita que o gel polimerize por 1 h.</li>
	<li>Uma vez que o gel solidified, retire o grampo da pasta. Insira o cartucho na caixa de eletroforese. Adicione o amortecedor de 1x TBE nos reservatórios superiores e inferiores.</li>
	<li>Recupere a reacção de transcrição. Adicione água até 100 μL e, em seguida, adicione 100 μL de tampão de carregamento de gel 2x. Prepare a escada misturando a quantidade recomendada com água a 10 μL e 10 μL de tampão de carregamento do gel 2x a um tubo separado de 1,5 mL.</li>
	<li>Incubar a escada e a reacção de transcrição in vitro no termomisturador a 70 ° c durante 15 min.</li>
	<li>Enquanto as amostras estão desnaturando a 70 ° c, Retire cuidadosamente o pente, limpe os poços pipetando para cima e para baixo cada poço com uma pipeta P1000, e imediatamente Pre-Run por 10 min em 100 V.</li>
	<li>Uma vez que as amostras tenham completado a sua desnaturação de 15 min a 70 ° c, retire os tubos do termomisturador e coloque imediatamente no gelo.</li>
	<li>Limpe cada poço do gel novamente com a pipeta P1000. Carregar 20 μl da escada no primeiro poço à esquerda, 20 μL da amostra de RNA em 10 poços separados, e 20 μL de tampão de carregamento do gel 1x nos poços não utilizados.</li>
	<li>Execute o gel em 100 V para 60-240 min, dependendo do% poliacrilamida do gel. Nota: os corantes no tampão de carregamento do gel serão separados em duas bandas à medida que atravessam o gel, uma faixa azul de bromofenol azul (BB) migrante lenta e uma banda ciano de xylene cyanol (XC) de migração rápida. A migração aproximada destas bandas em diferentes% de poliacrilamida géis é bem conhecida (ver passo 1,11) e pode ser usada para estimar a migração de RNA no gel.</li>
	<li>Uma vez que o gel foi parado, Retire cuidadosamente o gel da gaveta.</li>
	<li>Coloc o gel em uma caixa limpa que contem uma solução de 50 mL do amortecedor de 1x TBE com 50 μL da mancha do gel do ácido nucleico e incubar por 5 minutos em um balancim para manchar o RNA.</li>
	<li>Tome um antes e após a imagem da excisão da faixa do gel no sistema da imagem latente do gel, preferivelmente usando a luz azul em vez da transiluminação UV.</li>
	<li>Extirpar cada faixa de interesse usando uma ponta descartável nuclease-livre do corte do gel. Depois de cada poço, transfira a ponta contendo a fatia de gel para um tubo de 1,5 mL e gire brevemente para recolher a fatia de gel. Repetir até que todas as bandas tenham sido recolhidas no mesmo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Uma vez recolhidas todas as fatias de gel, adicione 100 μL de água sem nuclease ou tampão TE ao tubo de 1,5 mL. Conservar a 4 ° c para ~ 48 h. Isto permite que o RNA saia das fatias do gel na solução.</li>
	<li>Depois de 48 h, Pipet a água ou tampão TE para um tubo de 1,5 mL fresco. Elimine as restantes fatias de gel. Purify o RNA através do jogo da limpeza como segue.<ol>
<li>Equilibrar a coluna de giro à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min.</li>
		<li>Para o 100 μL de solução de RNA no novo tubo de 1,5 mL da etapa 1,32, adicione 350 μL de tampão RLT e misture bem por 2 min em um Nutator. Gire por 1 s em 200 x g para coletar a solução na parte inferior do tubo.</li>
		<li>Adicione 675 μL de 100% de EtOH e misture bem durante 2 min no Nutator. Gire por 1 s em 200 x g e prossiga imediatamente para o próximo passo.</li>
		<li>Transferir 565 μL da mistura para a coluna de centrifugação e girar durante 1 min a 15.000 x g. Esvazie o tubo de recolha por aspiração.</li>
		<li>Repita a etapa anterior com a segunda metade da amostra.</li>
		<li>Adicione 500 μL de tampão de RPE à coluna e gire por 1 minuto em 15.000 x g. Esvazie o tubo de recolha por aspiração.</li>
		<li>Adicionar 750 μL de 80% de etanol à coluna e girar por 1 min a 15.000 x g. Esvazie o tubo de recolha por aspiração.</li>
		<li>Coloque a coluna em um novo tubo de coleta de 2 mL com a tampa aberta e gire em 15.000 x g por 5 min.</li>
		<li>Transfira a coluna para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 17 μL de água no centro da coluna e gire em 15.000 x g por 1 min para elute. Elute novamente usando mais 17 μL de água. O volume total recuperado deve ser de 32 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Misture bem por vortexing, Pipet 1,5 μL e meça a concentração do RNA usando um Espectrofotômetro de microespectrômetro.</li>
	<li>Verific a qualidade da purificação do RNA pelo gel de desnaturação do poliacrilamida da ureia como nas etapas 1.11-1.29.</li>
</ol>2. ensaio in vitro de RNA metiltransferase
<ol><li>Configurar o ensaio de 100 μL de RNA metiltransferase num tubo de 1,5 mL no gelo da seguinte forma: 23 μL de água, 10 μL de TBS 10x (500 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 μL de 0, 5 M de EDTA, 5 μL de 100 mM DTT , 40 μL de 50% de glicerol, 4 μL de 58 μM 3H-Sam, 5 μL de cocktail inibidor da protease 20x, 1 μL de RNaseOUT (opcional), 5 ΜL de RNA e 5 μL de metiltransferase. Cuidado: o material tritiado radioativo é perigoso e deve somente ser segurado ao desgastar luvas, um revestimento do laboratório e todo o outro PPE necessário. Todas as pontas e tubos de pipeta em contato com material radioativo são considerados resíduos radioativos sólidos. Elimine todos os resíduos radioactivos sólidos e líquidos de acordo com o protocolo de resíduos radioactivos aprovados pelo laboratório. Nota: inclua amostras de controle sem o metiltransferase e sem o RNA. As concentrações do reagente podem exigir a optimização e/ou a inclusão de sais divalentes do cation, tais como MgCl2, ou Sam sem rótulo. A escala óptima da concentração final do RNA é de 50 nanômetro a 1 μm, quando a concentração do metiltransferase for de 25 nanômetro a 300 nanômetro.</li>
	<li>Misture cuidadosamente o tubo. Girar 5 s em 200 x g para recolher a solução na parte inferior do tubo. Incubar o tubo (s) a 37 ° c durante 2 h.</li>
	<li>Limpe a reação usando a purificação da coluna como na etapa 1,32. Cuidado: tenha muito cuidado para dispor adequadamente de quaisquer materiais radioactivos, especialmente durante as lavagens de coluna (pipeta para fora em vez de aspirantes a resíduos de tubos de recolha).</li>
	<li>Realizar contagem de cintilação líquida<ol>
<li>Configure o rack de contagem de cintilação com um frasco por amostra, um frasco para injetáveis para medição de fundo e um frasco para injetáveis para o teste de furto. Encha os frascos com 5 mL de solução de contagem de cintilação.</li>
		<li>Adicione 10 μL de cada amostra de RNA radioativo eluído em 1 frasco para injetáveis e aperte a tampa e misture suavemente.</li>
		<li>Prepare os frascos de teste de furto. Esfregue cuidadosamente cotonetes em todas as superfícies e equipamentos utilizados durante o protocolo. Adicionar cotonetes aos frascos preenchidos com 5 mL de solução de cintilação e apertar a tampa.</li>
		<li>Execute as amostras no contador de cintilação da seguinte maneira. Abra a capa contrária, insira o rack na máquina e feche o capô. Selecione contar único rack. Selecione selecionar programade usuário. Selecione ou crie um programa que mede trítio (3H) para 60 s. hit Count rack. Repita a contagem de cintilação três vezes. Nota: o equipamento irá medir a contagem de cintilação de cada amostra e saída para a tela e uma impressão. O protocolo pode ser pausado aqui se desejado. As amostras de RNA remanescentes da etapa 2,3 devem ser congeladas em-80 ° c para uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Prossiga com o autoradiograma<ol>
<li>Prepare e Pre-Run uréia desnaturando gel de poliacrilamida como nas etapas 1.11-1.20.</li>
		<li>Pipete 20 μL de material de RNA radioactivo para um novo tubo de 1,5 mL contendo 20 μL de tampão de carregamento de gel 2x. Misture bem. Prepare a escada como na etapa 1,21. Incubar as amostras a 70 ° c durante 15 min.</li>
		<li>Lave os poços do gel mais uma vez imediatamente antes da carga da amostra. Carregar 20 μl da escada preparada, 20 μL das amostras e 20 μL de tampão de carga do gel 1x nas vias restantes. Executar o gel em 100 V por 60-180 min, dependendo da percentagem de poliacrilamida.</li>
		<li>Uma vez que o gel termine de funcionar, retire o gel da gaveta e coloque-o numa caixa contendo 50 ml de tampão TBE 1x com 5 μL de mancha de gel de ácido nucleico ultrassensível.</li>
		<li>Incubar por 5 min no balancim para manchar o RNA.</li>
		<li>Tome com cuidado o gel fora da caixa e coloc o no transiluminador UV do sistema da imagem latente do gel com os poços acima e a escada na esquerda.</li>
		<li>Concentre a câmera no gel, gire sobre a luz UV e tome então uma imagem do gel expondo de 50 ms a 1 s dependendo da intensidade do sinal.</li>
		<li>Desative a exposição UV e salve a imagem como arquivo TIFF.</li>
		<li>Coloque o gel de volta na caixa. Remover TBE. Fixar o gel com 50 mL de solução de fixação (50% de metanol, 10% de ácido acético, 40% de água ultraleve) durante 30 min à temperatura ambiente num balancim.</li>
		<li>Mova suavemente o gel novamente para uma caixa preta fresca contendo 25 mL da solução de melhoramento da autoradiografia. Na ausência de uma caixa preta, cubra a caixa com a folha de alumínio para proteger a solução da luz.</li>
		<li>Incubar durante 30 min à temperatura ambiente no balancim.</li>
		<li>Levante suavemente o gel e coloque-o virado para baixo sobre uma folha de plástico com os poços para cima e a escada do lado direito. Coloque duas folhas de papel de cromatografia na parte de trás do gel. Vire suavemente a pilha inteira.</li>
		<li>Pré-aqueça o secador do gel a 80 ° c. Afaste a tampa plástica do secador de gel. Insira o envoltório, o gel e a pilha de papel da cromatografia a tampa plástica e mova a tampa plástica de volta para baixo para criar um selo.</li>
		<li>Seque por 1 h a 80 ° c no secador de gel.</li>
		<li>Desligue o secador de gel e retire suavemente a pilha. Retire o envoltório e o segundo papel de cromatografia. Tape o papel restante da cromatografia com o gel secado em uma gaveta do corresponde.</li>
		<li>Adicione 1 folha de filme autoradiografia na sala escura.</li>
		<li>Coloque a gaveta a-80 ° c e desenvolva a película após 1 h a 4 semanas dependendo da intensidade do sinal, que pode ser julgada com base nas contagens de cintilação previamente medidas: 1-4 semanas para 250-1000 CPM, 24 h a 1 semana para 1000-10000 CPM e 1 h a 24 h para > 10000 CP M.</li>
		<li>Uma vez que o filme é desenvolvido, coloque o filme em cima da gaveta e cuidadosamente marcar com um marcador de laboratório as 4 bordas do gel, cada poço, e a posição dos corantes XC e BB.</li>
		<li>Digitalizar o filme em 300 ou 600 pixels por polegada de resolução e salvar a imagem como arquivo TIFF.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li>
<li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+%28rRNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, um método simples e robusto para a verificação in vitro da atividade do metiltransferase do RNA para transcritos específicos é relatado. O ensaio aproveita o fato de que a metionina S-adenosil pode ser tritiada no doador do grupo metil (Figura 1), permitindo que o RNA metilado seja detectado com precisão sem o uso de anticorpos. No entanto, é importante notar que este ensaio não pode indicar qual resíduo ou grupo químico é metilado pela enzima. Para identificar ou verificar se um resíd...

O DNA, o RNA e as proteínas estão sujeitos a modificações que regulam firmemente a expressão gênica1. Entre essas modificações, ocorrem metilações em todos os três biopolímeros. Os methylations do ADN e da proteína foram estudados muito bem durante as últimas três décadas. Ao contrário, o interesse no metilação do RNA foi reacendeu somente recentemente à luz dos papéis importantes que as proteínas que escrevem, apagam ou ligam o methylations do RNA jogam no desenvolvimento e na doença2. Além do que funções mais conhecidas nas RNAs abundantes ribossomal e da transferência, as vias do metilação do RNA regulam a estabilidade específica3,4do RNA do Mensageiro, emenda5 e a tradução6,7, Mirna que processa8,9 e transcricional que pausam e liberam10,11.
Aqui, um método simples e robusto para a verificação in vitro da atividade de RNA metiltransferase no cenário de um laboratório de biologia molecular é relatado (resumido na Figura 1). Muitos estudos avaliam a atividade de um metiltransferase do RNA através do dot-borrão com um anticorpo de encontro à modificação do RNA do interesse. Entretanto, Dot-blot não verifica a integridade do RNA em cima da incubação com o methyltransferase do RNA. Isto é importante porque mesmo as contaminações menores de proteínas de recombinação com nucleases podem conduzir à degradação parcial do RNA e aos resultados confundimento. Além disso, mesmo os anticorpos altamente específicos da modificação do RNA podem reconhecer RNAs não modificado com seqüências ou estruturas específicas. O ensaio in vitro de RNA metiltransferase aqui relatado aproveita o fato de que a S-adenosil metionina pode ser tritiada no doador do grupo metil (Figura 1), permitindo que o RNA metilado seja detectado com precisão sem o uso de anticorpos . As instruções são fornecidas para in vitro a transcrição e a purificação de uma transcrição do interesse e do teste da metilação da transcrição dita pela enzima do interesse. Este método é flexível e robusto, e pode ser ajustado de acordo com as necessidades de um determinado projeto. Por exemplo, in vitro transcritos e purificados RNAs, quimicamente sintetizadas RNAs, mas também RNAs celulares podem ser usados. Este ensaio fornece informações quantitativas a forma de contagens de cintilação, bem como informações qualitativas, mostrando onde exatamente o RNA metilado é executado em um gel. Isto pode fornecer a introspecção original na função de um methyltransferase do RNA, particular ao usar RNAs celulares como um substrato, porque fornece um método para observar diretamente o tamanho do RNA ou dos RNAs que são alvejados para o methylation.

<table><tbody><tr><td>10 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10821-015</td><td>Kit de escada de DNA de 10 bp.</td></tr><tr><td>10% de persulfato de amônio (APS)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para gel de poliacrilamida desnaturante de ureia (Para 10 mL, dissolva 1g em 8 mL de água milliQ; ajuste o volume para 10 mL com água milliQ; filtre a solução usando uma seringa de 10 mL equipada com um 0,45 &micro; m).</td></tr><tr><td>10X TBE Buffer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para gel de poliacrilamida desnaturante de ureia (Para 1L, adicione 108 g de Base Tris, 55 g de Ácido Bórico a um cilindro com uma barra de agitação; adicione 800 mL de água destilada e deixe dissolver; adicione 40mL de Na2EDTA 0.5 M (pH 8.0); ajuste o volume para 1L com água milliQ; filtre a solução usando um 0.22&micro; m).</td></tr><tr><td>10X COLHERES DE SOPA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para 1L, adicione 60,5 g de Tris Base, 87,6 g de NaCl a um cilindro com uma barra de agitação; adicione 800 mL de água destilada e deixe dissolver; ajuste o pH para 7,5 com HCl concentrado; ajuste o volume para 1L com água milliQ; filtre a solução usando um 0,22 &micro; Filtro M.&nbsp;</td></tr><tr><td>Acrilamida: Bis-Acrilamida 29:1 (Solução a 40%/Eletroforese), Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1408-1</td><td>Para gel de poliacrilamida desnaturante de ureia.</td></tr><tr><td>ADENOSIL-L-METIONINA, S-[METIL-3H]; (SAM [3H])</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155V250UC</td><td>Para metilação in vitro de RNA; Concentração = 1,0 mCi/mL; Atividade específica = 17,1 Ci/mmol; Molaridade= (1,0 Ci/L)/(83,2 Ci/mmol) = 0,0584 mmol/L = 58,4 &micro;M.&nbsp; &nbsp; Após o recebimento do tubo 3H-SAM congelado, descongele-o a 4&deg; C, faça 20 &micro; L alíquotas e congele-as a -30 ° C. Nunca congele novamente e reutilize uma alíquota parcialmente usada.</td></tr><tr><td>de autorradiografia hipercassete Amersham</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN11649</td><td>Para exposição ao gel de autorradiograma.</td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm MP</td><td>GE Healthcare</td><td>28906846</td><td>Para exposição ao gel de autorradiograma.</td></tr><tr><td>Contador de Cintilação</td><td>Beckman</td><td>LS6500</td><td>Para contagem de cintilação líquida.</td></tr><tr><td>Sistema de Eletroforese Horizontal Mini Biorad</td><td>1704466</td><td></td><td>Sistema de Eletroforese Horizontal.</td></tr><tr><td>Comprimidos de coquetel de inibidores de protease sem EDTA</td><td>Roche Applied Science</td><td>4693159001</td><td>completos Para uma solução 20X, dissolva 1 comprimido em 0,525 mL de água livre de nuclease.</td></tr><tr>vazio livre de RNase <td>Criterion Cell</td><td>Biorad</td><td>345-9902</td><td>para gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>vazios</td><td>de critério Biorad</td><td>1656001</td><td>Célula de eletroforese vertical de formato midi.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de Microvolume DeNovix DS-11 Espectrofotômetro</td> de Microvolume <td>DeNovix</td><td>DS-11-S</td><td>para medir a concentração de DNA e RNA.</td></tr><tr><td>Ecoscint Original</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-271</td><td>Para contagem de cintilação líquida.</td></tr><tr><td>Frascos de Cintilação HDPE 7mL da Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>03-337-1</td><td>Para contagem de cintilação líquida.</td></tr><tr><td>Realçador de autorradiografia de ação rápida Fluoro-Hance-Quick</td><td>RPI CORP</td><td>112600</td><td>Para pré-tratamento de gel de autorradiograma.</td></tr><tr><td>Secador de gel</td><td>Biorad</td><td>1651745</td><td>Para gel secante.</td></tr><tr><td>Tampão de carregamento de gel II</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td>Para carregar RNA em gel de ureia de poliacrilamida desnaturante (composição: 95% de formamida, 18 mM de EDTA e 0,025% de SDS, xileno cianol e azul de bromofenol).</td></tr><tr><td>Pontas de excisão de gel descartáveis GeneCatcher</td><td>Gel Company</td><td>NC9431993</td><td>Para remover bandas de géis de agarose e poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Kit Megascript</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td>Para transcrição in vitro com T7 RNA polimerase.&nbsp;</td></tr><tr><td>Recipiente Extragrande Perfectwestern</td><td>Genhunter Corporation</td><td>NC9226382 (transparente)/ NC9965364 (preto)</td><td>Caixa de coloração em gel.</td></tr><tr><td>pRZ</td><td>Addgene</td><td>#27663</td><td>Plasmídeo para produção de transcritos in vitro com extremidades homogêneas</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Para limpeza de RNA, use o protocolo modificado fornecido no protocolo.</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick (50)</td><td>Kit Qiagen</td><td>28704</td><td>para extração de gel e limpeza de fragmento de dsDNA usado para transcrição in vitro.</td></tr><tr><td>Saran Premium Plastic</td><td>Wrap Saran Wrap</td><td>Amazon</td><td>Para gel secante.</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Mancha de gel de ácido nucleico ultra sensível.</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Coloração de gel de ácido nucleico.</td></tr><tr><td>TE</td><td>Sigma</td><td>93283-100ML</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA dissódico, pH 8,0</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>110-18-9</td><td>Para gel de poliacrilamida desnaturante de ureia.</td></tr><tr><td>Termomixer com SMARTBLOCK 24X 1,5mL TUBES</td><td>eppendorf</td><td>5382000023/5361000038</td><td>Para incubação com temperatura controlada de tubos de 1,5 mL.</td></tr><tr><td>Kit de Clonagem TOPO TA</td><td>life technologies</td><td></td><td>Kits para clonagem rápida de Taq polimerase&ndash; produtos de PCR amplificados em vetores contendo promotores T7 e/ou SP6 para transcrição de RNA in vitro.</td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U&frasl; &micro; L)</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>Para remoção de DNA de reações de transcrição in vitro.</td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma</td><td>51456-500G</td><td>Para gel de poliacrilamida desnaturante de ureia.</td></tr><tr>Papel da <td>cromatografia dos cuidados médicos</td><td>3030-154</td> de GE do <td>papel de Whatman 3MM</td><td>para o gel de secagem.</td></tr></tbody></table>

teste anticorpo-livre para a análise da atividade do methyltransferase do rna

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Há mais de 100 modificações quimicamente distintas do RNA, dois terços dos quais consistem em metilações. O interesse nas modificações do RNA, e especialmente nos methylations, reemergiu devido aos papéis importantes desempenharam pelas enzimas que escrevem e os apagam em processos biológicos relevantes à doença e ao cancro. Aqui, um ensaio in vitro sensível para a análise exata da atividade do escritor do metilação do RNA em RNAs transcritos sintéticos ou in vitro é fornecido. Este ensaio usa um formulário tritiado de S-adenosyl-Methionine, tendo por resultado a rotulagem direta do RNA misturado com trítio. A baixa energia da radiação trítio torna o método seguro, e métodos pré-existentes de amplificação de sinal de trítio, tornam possível quantificar e visualizar o RNA metilado sem o uso de anticorpos, que são comumente propensos a artefatos. Quando este método for escrito para o methylation do RNA, poucos ajustes fazem-no aplicável ao estudo de outras modificações do RNA que podem radioativamente ser etiquetadas, tais como a acetilação do RNA com a coenzima A do acetil 14C. globalmente, este ensaio permite avaliar rapidamente o RNA condições de metilação, inibição com inibidores da molécula pequena, ou o efeito do RNA ou mutantes enzimáticos, e fornece uma ferramenta poderosa para validar e expandir os resultados obtidos nas células.

Reacção de transcrição in vitro Figura 2 A representa uma corrida típica de uma reação de transcrição in vitro com o RNA polimerase T7 do 7Sk snRNA, que é um RNA relativamente curto (331 NT) e altamente estruturado. Como mostrado nessa imagem crua, existem várias bandas indesejadas, tanto mais curtas quanto mais longas que 7SK, provavelmente resultantes de eventos aleatórios de iniciação ou terminação transcripcional. Devido a isso, a purificação do gel a...

Aqui, um ensaio in vitro anticorpo-livre para a análise direta da atividade do metiltransferase no RNA transcrito sintético ou in vitro é descrito.

Teste anticorpo-livre para a análise da atividade do methyltransferase do RNA

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Há mais de 100 modificações distintas de RNA, dois terços das quais são metilações. Este protocolo fornece um método para análise sensível e precisa da atividade do autor da metilação RNA. Esta técnica de fácil utilização nos permite quantificar e visualizar RNA metilado sem o uso de anticorpos, que são comumente propensos a artefatos.Demonstrando o procedimento será Samantha Shelton, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, configure o ensaio de metiltransferase RNA de 100 microliter em um tubo de 1,5 mililitro no gelo, conforme descrito no protocolo de texto. Vórtice o tubo para misturar completamente, e centrífuga a 200 vezes g por cinco segundos para coletar a solução na parte inferior do tubo.Incubar o tubo a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, limpe a reação usando a purificação da coluna, conforme descrito no protocolo de texto. Para realizar a contagem de cintilação líquida, configure o rack de contagem de cintilação com um frasco por amostra, um frasco para medição de fundo e um frasco para o teste de deslizamento.Encha os frascos com cinco mililitros de solução de contagem de cintilação. Adicione 10 microliters de cada amostra de RNA radioativa elucida em um frasco. Aperte a tampa e misture delicadamente.Para preparar os frascos de teste de deslizamento, esfregue completamente os cotonetes de algodão em todas as superfícies e equipamentos utilizados durante o procedimento. Adicione esses cotonetes aos frascos cheios de solução de cintilação e aperte a tampa. Para executar as amostras no balcão de cintilação, abra o capô do balcão, insira o rack na máquina e feche o capô.Selecione Contagem de Rack Único. Escolha selecionar programa de usuário. Selecione ou crie um programa que mede o trítio por 60 segundos e bata no Rack de Contagem.Repita a contagem de cintilação três vezes. Depois disso, prepare e re-execute um gel de poliacrilamida de ureia, conforme descrito no protocolo de texto. Transfira 20 microliters de material RNA radioativo em um novo tubo de 1,5 mililitro contendo 20 microliters de tampão de carregamento de gel 2X.Depois de preparar a escada, incubar as amostras a 70 graus Celsius por 15 minutos. Lave os poços do gel mais uma vez imediatamente antes do carregamento da amostra por tampão de tubulação dos tanques de gel para baixo nos poços do gel. Em seguida, carregue 20 microliters da escada preparada, 20 microliters das amostras e 20 microliters de tampão de carregamento de gel 1X nas pistas do gel.Execute o gel a 100 volts por 60 a 180 minutos, dependendo da porcentagem de poliacrilamida. Uma vez que o gel tenha terminado de funcionar, remova o gel do e coloque-o em uma caixa contendo 50 mililitros de tampão 1X TBE com cinco microliters de mancha de gel de ácido nucleico ultrasensível. Incubar em um roqueiro por cinco minutos para manchar o RNA.Depois disso, retire cuidadosamente o gel da caixa, e coloque-o no transilluminador UV do sistema de imagem gel com os poços para cima e a escada à esquerda. Concentre a câmera no gel, ligue a luz UV e tire uma imagem do gel. Em seguida, desligue a exposição uv e salve a imagem como um arquivo TIFF.Coloque o gel de volta na caixa, remova o TBE e fixe o gel com 50 mililitros de solução fixa em um roqueiro em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, mova suavemente o gel para uma caixa preta fresca contendo 25 mililitros da solução de melhoria autoradiografia. Incubar no roqueiro à temperatura ambiente por 30 minutos.Levante suavemente o gel, e coloque-o de brumão sobre uma folha de plástico com os poços para cima e a escada do lado direito. Coloque duas folhas de papel cromatografia na parte de trás do gel, e vire toda a pilha. Pré-aqueça o secador de gel a 80 graus Celsius.Mova a tampa de plástico na secadora de gel para trás. Insira toda a pilha sob a tampa de plástico e mova a tampa de plástico de volta para baixo para criar uma vedação. Seque o gel a 80 graus Celsius por uma hora.Em seguida, desligue o secador de gel e retire suavemente a pilha. Remova o envoltório e o segundo papel cromatógrafo. Grave o papel cromatógrafo restante com o gel seco em um autordiograma.Em uma sala escura, adicione uma folha de filme autordiografia. Armazene o a 80 graus Celsius negativos, e desenvolva o filme no momento apropriado, dependendo da intensidade do sinal. Uma vez que o filme é desenvolvido, coloque-o em cima do e use um marcador de laboratório para marcar cuidadosamente as quatro bordas do gel, cada poço, e a posição dos corantes XC e BB.Escaneie o filme com uma resolução de 300 ou 600 pixels por polegada e salve a imagem como um arquivo TIFF. Neste estudo, demonstra-se um ensaio sem anticorpos para analisar a atividade de metiltransferase de RNA. Uma corrida típica de uma reação de transcrição in vitro com a polimerase T7 RNA do RNA nuclear 7SK mostra RNA relativamente curto e altamente estruturado.Existem várias bandas indesejadas, mais curtas e maiores que 7SK, provavelmente resultantes de eventos aleatórios de iniciação transcricional ou término. Por causa disso, a purificação de gel após a reação de transcrição in vitro é importante para obter uma amostra de RNA limpa. Neste ponto, o RNA de interesse pode ser identificado por sua localização em relação à escada e purificado por purificação de gel.Um ensaio representativo de metiltransferase de RNA utilizando o limite inferior das concentrações recomendadas de RNA e proteínas é mostrado aqui. Este ensaio permite tanto os resultados quantitativos das contagens de cintilação, quanto os resultados qualitativos do autordiograma. Aqui, um RNA metiltransferase conhecido pelo metilato 7SK é mostrado ser capaz de também metilar U6. Além disso, como mostrado recentemente para 7SK, a ligação de histone H4 ao MePCE também inibe a metilação U6.Isso pode ser observado tanto na contagem de cintilação quanto no autordiograma, mostrando a robustez deste protocolo. O RNA é suscetível à degradação, por isso, certifique-se de usar reagentes livres de RNase e limpar completamente todas as superfícies e equipamentos. O RNA radioativo obtido a partir deste ensaio de metiltransferase pode ser usado diretamente para avaliar a atividade de demetilase RNA ou atividade de ligação de RNA por ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, por exemplo.Este método permite que os pesquisadores testem o efeito de diferentes fatores sobre a atividade de metiltransferase de RNA, incluindo mutações pontuais e tratamentos inibidores de pequenas moléculas. Este método utiliza material radioativo, por isso certifique-se de usar o EPI apropriado, e tenha cuidado durante o manuseio e descarte de materiais radioativos.

antibody-free-assay-for-rna-methyltransferase-activity-analysis

Research

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Genetics

Genética

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Ensaio in vitro de metilação tRNA com a Entamoeba histolytica DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferase (Ehmeth) Enzyme

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Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar semi-quantitativamente os níveis globais de m⁶A usando dot blot. O RNA total é extraído, desnaturado, manchado em uma membrana de náilon, sondado com anticorpo anti-m⁶A e visualizado por quimioluminescência. A intensidade do sinal, quantificada pela análise em escala de cinza ImageJ, reflete a abundância relativa de metilação, proporcionando um fluxo de trabalho reprodutível para pesquisas.

Ensaio Dot Blot para Detectar Níveis Globais de Modificação do RNAN 6-metiladenosina

Aqui, detalhamos o método de equação de S de sorgo de P soralen reticulado, L igado e Híbridos H elegidos (SPLASH), que permite o mapeamento genômico de interações intramoleculares e intermoleculares RNA-RNA in vivo . SPLASH pode ser aplicado para estudar os interactomas de RNA de organismos, incluindo leveduras, bactérias e seres humanos.

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Aprenda a realizar ensaio in vitro sem anticorpos para analisar atividade de metiltransferase de RNA usando S-adenosil-metionina tritiada. Este método permite quantificação e visualização sensíveis de RNA metilado.

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